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摘 要 为研究菠萝蜜果肉类胡萝卜素分析方法、分析呈色组分，本研究基于高效液相色谱法检测果肉中类胡萝卜素组分，通过比较不同色泽果肉中类胡萝卜素物质差异，鉴定呈色组分。结果表明，用含0.01% BHT的正己烷 ∶ 丙酮 ∶ 无水乙醇（2 ∶ 1 ∶ 1，V/V/V）作为提取液，结合超声震荡、皂化脱脂等步骤，能有效提取菠萝蜜果肉中总类胡萝卜素。组分分析采用YMC carotenoid column C30（4.6×250 mm）色谱柱，二极管阵列检测器（photodiode array， PDA）在450 nm波长下，检测出16种不同的类胡萝卜素组分。定量结果表明，β-柠乌素是红色果肉的呈色组分，紫黄质是黄肉果肉主要的呈色组分。差异组分之间存在一定的代谢关联，即紫黄质合成前体的裂解反应及下游异构化反应是造成果肉色泽差异的潜在原因。
关键词 菠萝蜜；果肉色泽；类胡萝卜素；呈色组分鉴定
中图分类号 S667.8 文献标识码 A
Abstract In order to identify the carotenoid composition and pigments in jackfruit， the High Performance Liquid Chromatography（HPLC）was applied to analyze the composition and concentration of carotenoids in different fruit samples. By homogenizing in extracting solution（n-Hexane ∶ acetone ∶ ethanol=2 ∶ 1 ∶ 1， V/V/V）with 0.01% butylated hydroxytoluene（BHT）， accompanied with sonication and saponification， the total carotenoid in jackfruit was extracted. The analysis was carried out in a Waters liquid chromatography system equipped with a model 2996 photodiode array detector（PAD）. A C30 carotenoid column（250×4.6 mm； YMC， Japan）was used to elute the carotenoids. Sixteen carotenoids were successfully separated， identified and quantified by the HPLC-PDA system. In red-flesh fruit， the main carotenoids were luteoxanthin， β-citraurin， violaxanthin and all-trans-neoxanthin. β-citraurin was the only red substance， which determined the color of red-flesh fruit. In yellow-flesh fruit， the main carotenoid was violaxanthin. In summary， the cleavage or epoxidase of the precursors of violaxanthin， and isomerization of violaxanthin might determined the different color of jackfruit. Our study provide an efficient method for carotenoids analysis in jackfruit. Additionally， the relationship between pigments suggest a new insight of carotenoid metabolism， which would provide a regulatory mechanism by which to facilitate improvements to fruit quality in jackfruit.
Key words Jackfruit； flesh color； carotenoids； pigment identification
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.05.027
菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.），又名木菠萝，是典型的热带果树，在世界热带及南亚热带地区广泛种植[1]。长期以来，我国菠萝蜜育种上多注重适应性广、果型大、甜度高等性状，对热带水果独特的保健功能、果肉色泽、特征香气等品质性状未能引起重视，造成目前主栽品种模式单一，优异品种缺乏等问题，进而影响菠萝蜜市场竞争力。果实品质问题已成为影响菠萝蜜产业发展的重要限制因子[2]。
果肉色泽是果实品质构成的重要因子之一，对果实的感官和营养品质的形成具有重要作用，是目前果树研究的新焦点。类胡萝卜素是自然界一类重要的天然色素，其种类及含量分布具有明显的物种特异性[3]。分光光度法和高效液相色谱法是植物类胡萝卜素测定最常用的方法。其中，分光光度法易操作且对类胡萝卜素提取纯度要求不高，但该方法只能测定类胡萝卜素总量，无法分析不同组分[4]。高效液相色谱法是对物质精确定性和定量的方法之一，广泛应用于多种类胡萝卜素组分的分离，如柑橘、桃、西瓜等[5-7]。目前国内有关菠萝蜜果肉色泽呈色类胡萝卜素组分的鉴定及其含量的分析尚未见报道。 除了赋予植物一系列色彩之外，类胡萝卜素物质是健康饮食中必须的重要成分，在维持人体视觉系统、增强免疫力和防癌抗癌等方面具有广泛的作用[8-10]。如柑橘、枇杷、枸杞等植物的果肉中富含柠乌素、番茄红素、叶黄素等类胡萝卜素物质，该类物质在清除体内氧化自由基、延缓衰老等方面起着重要作用[11-13]。前人研究表明，脂溶性类胡萝卜素是菠萝蜜果肉的呈色物质，其组分和含量的差异影响菠萝蜜果肉色泽及营养价值[14]，因此，分析菠萝蜜果肉中主要的呈色类胡萝卜素组分，对于丰富植物类胡萝卜素代谢理论和改良果实的感官和营养品质具有重要价值。本项目参考柑橘等作物的研究方法，建立了菠萝蜜类胡萝卜素高效液相检测方法，可以清晰区分出16种菠萝蜜果肉不同类胡萝卜素组分。同时，基于不同色泽果肉的组分差异分析，初步鉴定果肉呈色组分，为后续菠萝蜜优异品种的选育提供了重要参考。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究以盛产期的3个黄肉品种/系（‘琼引1号’、‘XYS-8’、‘XYS-11’）和3个红肉品种（‘马来西亚5号’、‘珍珠果’、‘四季红’）为实验材料，树龄5 a，种植于自中国热带农业科学院香料饮料研究所菠萝蜜种质资源圃，土壤、水肥等栽培条件相对一致。2016年6～8月期間，根据菠萝蜜果实发育特征，以雌花柱头长出为起始挂牌，于开花后120 d（成熟期）取样。每个品种/系取3个具有代表性果实（生物学重复），收集果肉，-80 ℃保存。
类胡萝卜素提取试剂正己烷、丙酮、无水乙醇、氯化钠为分析纯级，购自国药基团化学试剂有限公司；甲基叔丁基醚、甲醇、丙酮、氢氧化钾、乙腈为色谱级，购自Sigma公司；所用类胡萝卜素色谱级标样购自CaroteNature公司。
1.2 方法
1.2.1 菠萝蜜果肉类胡萝卜素抽提 菠萝蜜果肉类胡萝卜素的提取参考柑橘提取方法[15]。将新鲜果肉于真空冷冻干燥仪中充分冷冻干燥，充分研磨后取0.8 g粉末，置于50 mL离心管。加15 mL色素提取液（正己烷 ∶ 丙酮 ∶ 无水乙醇=2 ∶ 1 ∶ 1，含0.01% BHT），涡旋5 min混匀。超声波震荡30 min，4 000 r/min离心10 min，转移上清液。
将上清液在分液漏斗中用饱和NaCl（10%）水溶液洗至中性，弃下层（水层）。将上层色素溶液分装在10 mL离心管中，氮吹仪真空浓缩后用2 mL甲基叔丁基醚（MTBE，含0.01% BHT）溶解，再加3 mL 10%KOH-甲醇溶液充氮，避光条件下皂化过夜（8～10 h）。皂化结束后，加3 mL饱和NaCl水溶液和2 mL MTBE（含0.01% BHT）使之更好地分层，用胶头吸管吸走下层水层，用饱和NaCl水溶液洗至中性。将色素上清液真空浓缩，用总体积0.2～1 mL MTBE和甲醇溶解定容（色谱级，含0.01% BHT）。12 000 r/min离心30 min，过0.22 μL微孔滤膜，转移到进样瓶中待测。
1.2.2 类胡萝卜素组分分析 色谱检测系统为Waters 1525型高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，YMC C30类胡萝卜素专用色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，Wilmington，NC，USA）。
类胡萝卜素HPLC分析设置两种流动相检测。流动相1：A相为乙腈 ∶ 甲醇 ∶ 水（7 ∶ 2 ∶ 1），B相为MTBE ∶ 甲醇 ∶ 水（90 ∶ 6.6 ∶ 3.3）。洗脱条件如下，0 min：A-B（95 ∶ 5）；0～10 min：A-B（95 ∶ 5）；10～19 min：A-B（86 ∶ 14）；19～29 min：A-B（75 ∶ 25）；29～40 min：A-B（50 ∶ 50）；40～50 min：A-B（26 ∶ 74）；50～60 min：A-B（95 ∶ 5）；流速为 1 mL/min。流动相2：A相为甲醇 ∶ 水（9 ∶ 1），B相为MTBE ∶ 甲醇 ∶ 水（90 ∶ 6.6 ∶ 3.3），洗脱条件、流速同上。
根据标准样品特征吸收峰进行类胡萝卜素定性分析，每个样品测定3次，取平均值（技术重复）。类胡萝卜素定量采用自动积分获取样品的峰面积，外标标准曲线法定量。
1.3 数据处理
类胡萝卜素检测数据由Empower 3分析导出，数据分析在Excel 2010中进行。
2 结果与分析
2.1 菠萝蜜果肉类胡萝卜素分析方法比较
通过高效液相色谱法，采用2种流动相针对供测材料的混合样（黄肉品种/系：‘琼引1号’、‘XYS-8’、‘YS-11’；红肉品种：‘马来西亚5号’、‘珍珠果’、‘四季红’）重复3次分析，根据3次结果的吻合度确定最佳的流动相组合。结果如图1所示，流动相1[A，乙腈 ∶ 甲醇 ∶ 水（7 ∶ 2 ∶ 1）；B，MTBE ∶ 甲醇 ∶ 水（90 ∶ 6.6 ∶ 3.3）]3次重复之间存在较大差异（图1，A-C）。首先，重复之间出峰的时间不同，第1次重复20 min左右开始出峰，但后2次同一出峰时间推迟至25 min左右。其次，相同时间出现的峰，面积存在差异，进而导致能检测出物质的种类重复性不好，而第3次重复只出现了14个明显的峰。流动相2[A，甲醇 ∶ 水（9 ∶ 1）；B，MTBE ∶ 甲醇 ∶ 水（90 ∶ 6.6 ∶ 3.3）]3次重复之间一致性较好，供测样品一共检测出16种物质，且出峰时间较为一致（图1，D-F）。根据结果，选择流动相2组合[A，甲醇 ∶ 水（9 ∶ 1）；B，MTBE ∶ 甲醇 ∶ 水（90 ∶ 6.6 ∶ 3.3）]开展后续实验。
2.2 不同色泽果肉中类胡萝卜素组分分析
黄肉品种/系（‘琼引1号’、‘XYS-8’、‘XYS-11’）和红肉品种（‘马来西亚5号’、‘珍珠果’、‘四季红’）果肉色泽如图2所示。 根据标准品的特征吸收峰进行类胡萝卜素定性分析，红色果肉和黄色果肉中，一共鉴定出16种类胡萝卜素组分（图3）。根据外标标准曲线法，对鉴定出的组分进行定量分析。3个红色果肉类胡萝卜素总体含量分别为434.21、327.39和629.68 μg/g，黄色果肉含量分别为255.19、113.46和155.96 μg/g，红肉品种类胡萝卜素含量高于黄肉品种（表1）。组分分析结果发现，黄色果肉中主要组分为violaxanthin（紫黄质）、lutein（叶黄素）、9-cis-violaxanthin（9-顺式紫黄质），红色果肉中主要组分为luteoxanthin（黄体黄质）、β-citraurin（β-柠乌素）、all-trans-neoxanthin（全反式新黄质）。其中β-柠乌素、全反式新黄质、黄体黄质、全反式新黄质是主要的差异组分，结果见表1。在差异组分中，β-柠乌素是唯一呈红色的类胡萝卜素组分，是红肉菠萝蜜的呈色物质。在黄肉菠萝蜜中，类胡萝卜素组分均为黄色，其中紫黄质含量最高，占总类胡萝卜素含量的60%左右，是黄肉的主要呈色组分。
2.3 类胡萝卜素差异组分代谢关系分析
根据不同色泽菠萝蜜果肉中类胡萝卜素组分的含量差异，结合差异组分之间的代谢关联，我们初步分析不同呈色组分之间的代谢关系。首先，在3个红肉菠萝蜜品种中，红色呈色物质β-柠乌素含量分别为54.88、28.61和47.94 μg/g，而在黄肉品种中没有检测到该组分。黄肉品种中主要的呈色物质是紫黄质，其含量分别为170.82、81.19和86.58 μg/g，是红肉品种中含量的2～4倍。在类胡萝卜素代谢途径中，这两种差异组分有着共同的前体物质。β-柠乌素以玉米黄质和β-隐黄质为前体，在类胡萝卜素裂解氧化酶4（Cleavage Dioxygenase 4， CCD4）的作用下裂解7、8或7′、8′位共轭双键后加氧形成。而紫黄质同样以玉米黄质和β-隐黄质为前体，在玉米黄质环氧酶（zeaxanthin epoxidase， ZEP）的作用下通过氧化反应生成[16]。类胡萝卜素定量分析结果发现，不同品种菠萝蜜果肉中，玉米黄质和β-隐黄质含量极低，说明呈色物质的前体并没有在果肉中富集而是继续进行下游的代谢反应。有鉴于此，我们认为玉米黄质和β-隐黄质的下游代谢途径的差异引起了菠萝蜜果肉色泽的不同。其次，除β-柠乌素之外，红色果肉中含量较高的全反式新黄质、黄体黄质、all-trans-neochrome，这类物质为紫黄质的异构体。由此可见，红色果肉和黄色果肉中差异类胡萝卜素组分之间存在一定的代谢关联，即紫黄质代谢的上游前体分支裂解反应及下游异构化反应是造成红肉和黄肉类胡萝卜素组分差异的主要原因（图4）。
3 讨论
类胡萝卜素是菠萝蜜果肉的呈色物质，不同类胡萝卜素组分使得其果肉呈现黄色至橙红色。自20世纪90年代，国外就陆续有菠萝蜜果肉类胡萝卜素组分分析的报道，Tee等[17]利用HPLC从菠萝蜜果实中鉴定出6种类胡萝卜素组分。Faria[14]利用液相串联API质谱，结合2种不同的类胡萝卜素检测柱鉴定出18种类胡萝卜素组分。整体而言，目前菠萝蜜类胡萝卜素尚缺少一套简便、高效的检测方法。本研究参考柑橘、枇杷等作物的提取、分析方法，所建立的方法能从6个不同的菠萝蜜品种中检测出16种不同的类胡萝卜素组分。与液相串联API质谱配合2种不同检测柱的结果相比，含量较低的隐黄质和2个玉米黄质异构体没有检测出来，但新检测出一种新的类胡萝卜素组分β-柠乌素，其他組分没有差异，结果基本一致。但是在分析方法上，本研究采取高效液相结合YMC carotenoid column C30一种色谱柱，且不需要串联质谱即可达到分离效果，比Faria的方法更为简便。综上所述，本研究所采用的分析体系能准确区分菠萝蜜果肉中主要的类胡萝卜素组分，可作为后续类胡萝卜素组分鉴定及品质研究的有效方法。
呈色物质的分析是近年来植物类胡萝卜素研究的热点。番茄红素和β-胡萝卜素是柑橘红肉突变体最常见的呈色组分[18]。周春华等[19]的研究发现，红肉枇杷果肉以β-胡萝卜素为主，白肉枇杷则以玉米黄质和叶黄素为主。本研究中，β-柠乌素是唯一呈红色的类胡萝卜素组分且特异存在于红色果肉中，是红肉菠萝蜜的呈色组分。紫黄质是黄肉品种中主要的类胡萝卜素组分，占整体含量的60%，是黄肉的主要呈色物质。β-柠乌素是一种C30脱辅基类胡萝卜素（C30-apocarotenoid），迄今为止仅在柑橘类水果中报道，且存在于几个特定品种果皮发育的特定阶段，是红色果皮的呈色物质[20-21，16]。本研究结果是除柑橘类水果外，植物界第二例关于β-柠乌素的报道。与柑橘不同的是，菠萝蜜β-柠乌素存在于可直接食用的果肉中，该物质的鉴定为提高菠萝蜜的营养品质和商业价值提供了新的思路。
研究呈色物质的合成与代谢机理是分子育种的重要前提。在柑橘中，β-柠乌素以β-隐黄质和玉米黄质为前体，在CCCD 4（Carotenoid Cleavage Dioxygenase4）催化下裂解7、8位双键形成。β-柠乌素的积累与前体物质β-隐黄质和玉米黄质以及下游产物紫黄质的积累呈显著负相关[22-24]。本研究中，红肉和黄肉菠萝蜜的差异组分主要为β-柠乌素、紫黄质和黄体黄质。差异组分之间存在代谢关联，即紫黄质前体分支裂解反应及下游异构化产物是造成红肉和黄肉类胡萝卜素组分差异的主要原因。该结果与柑橘中β-柠乌素代谢机理吻合，但紫黄质下游的异构化产物的积累则体现了菠萝蜜类胡萝卜素代谢的特点。本研究一方面为菠萝蜜品质育种提供了理论参考，同时对于丰富植物类胡萝卜素代谢理论具有重要意义。
致 谢 感谢华中农业大学徐娟教授在类胡萝卜素组分分析实验中给予的指导。
参考文献
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关键词 菠萝蜜；果肉色泽；类胡萝卜素；呈色组分鉴定
中图分类号 S667.8 文献标识码 A
Abstract In order to identify the carotenoid composition and pigments in jackfruit， the High Performance Liquid Chromatography（HPLC）was applied to analyze the composition and concentration of carotenoids in different fruit samples. By homogenizing in extracting solution（n-Hexane ∶ acetone ∶ ethanol=2 ∶ 1 ∶ 1， V/V/V）with 0.01% butylated hydroxytoluene（BHT）， accompanied with sonication and saponification， the total carotenoid in jackfruit was extracted. The analysis was carried out in a Waters liquid chromatography system equipped with a model 2996 photodiode array detector（PAD）. A C30 carotenoid column（250×4.6 mm； YMC， Japan）was used to elute the carotenoids. Sixteen carotenoids were successfully separated， identified and quantified by the HPLC-PDA system. In red-flesh fruit， the main carotenoids were luteoxanthin， β-citraurin， violaxanthin and all-trans-neoxanthin. β-citraurin was the only red substance， which determined the color of red-flesh fruit. In yellow-flesh fruit， the main carotenoid was violaxanthin. In summary， the cleavage or epoxidase of the precursors of violaxanthin， and isomerization of violaxanthin might determined the different color of jackfruit. Our study provide an efficient method for carotenoids analysis in jackfruit. Additionally， the relationship between pigments suggest a new insight of carotenoid metabolism， which would provide a regulatory mechanism by which to facilitate improvements to fruit quality in jackfruit.
Key words Jackfruit； flesh color； carotenoids； pigment identification
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.05.027
菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.），又名木菠萝，是典型的热带果树，在世界热带及南亚热带地区广泛种植[1]。长期以来，我国菠萝蜜育种上多注重适应性广、果型大、甜度高等性状，对热带水果独特的保健功能、果肉色泽、特征香气等品质性状未能引起重视，造成目前主栽品种模式单一，优异品种缺乏等问题，进而影响菠萝蜜市场竞争力。果实品质问题已成为影响菠萝蜜产业发展的重要限制因子[2]。
果肉色泽是果实品质构成的重要因子之一，对果实的感官和营养品质的形成具有重要作用，是目前果树研究的新焦点。类胡萝卜素是自然界一类重要的天然色素，其种类及含量分布具有明显的物种特异性[3]。分光光度法和高效液相色谱法是植物类胡萝卜素测定最常用的方法。其中，分光光度法易操作且对类胡萝卜素提取纯度要求不高，但该方法只能测定类胡萝卜素总量，无法分析不同组分[4]。高效液相色谱法是对物质精确定性和定量的方法之一，广泛应用于多种类胡萝卜素组分的分离，如柑橘、桃、西瓜等[5-7]。目前国内有关菠萝蜜果肉色泽呈色类胡萝卜素组分的鉴定及其含量的分析尚未见报道。 除了赋予植物一系列色彩之外，类胡萝卜素物质是健康饮食中必须的重要成分，在维持人体视觉系统、增强免疫力和防癌抗癌等方面具有广泛的作用[8-10]。如柑橘、枇杷、枸杞等植物的果肉中富含柠乌素、番茄红素、叶黄素等类胡萝卜素物质，该类物质在清除体内氧化自由基、延缓衰老等方面起着重要作用[11-13]。前人研究表明，脂溶性类胡萝卜素是菠萝蜜果肉的呈色物质，其组分和含量的差异影响菠萝蜜果肉色泽及营养价值[14]，因此，分析菠萝蜜果肉中主要的呈色类胡萝卜素组分，对于丰富植物类胡萝卜素代谢理论和改良果实的感官和营养品质具有重要价值。本项目参考柑橘等作物的研究方法，建立了菠萝蜜类胡萝卜素高效液相检测方法，可以清晰区分出16种菠萝蜜果肉不同类胡萝卜素组分。同时，基于不同色泽果肉的组分差异分析，初步鉴定果肉呈色组分，为后续菠萝蜜优异品种的选育提供了重要参考。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究以盛产期的3个黄肉品种/系（‘琼引1号’、‘XYS-8’、‘XYS-11’）和3个红肉品种（‘马来西亚5号’、‘珍珠果’、‘四季红’）为实验材料，树龄5 a，种植于自中国热带农业科学院香料饮料研究所菠萝蜜种质资源圃，土壤、水肥等栽培条件相对一致。2016年6～8月期間，根据菠萝蜜果实发育特征，以雌花柱头长出为起始挂牌，于开花后120 d（成熟期）取样。每个品种/系取3个具有代表性果实（生物学重复），收集果肉，-80 ℃保存。
类胡萝卜素提取试剂正己烷、丙酮、无水乙醇、氯化钠为分析纯级，购自国药基团化学试剂有限公司；甲基叔丁基醚、甲醇、丙酮、氢氧化钾、乙腈为色谱级，购自Sigma公司；所用类胡萝卜素色谱级标样购自CaroteNature公司。
1.2 方法
1.2.1 菠萝蜜果肉类胡萝卜素抽提 菠萝蜜果肉类胡萝卜素的提取参考柑橘提取方法[15]。将新鲜果肉于真空冷冻干燥仪中充分冷冻干燥，充分研磨后取0.8 g粉末，置于50 mL离心管。加15 mL色素提取液（正己烷 ∶ 丙酮 ∶ 无水乙醇=2 ∶ 1 ∶ 1，含0.01% BHT），涡旋5 min混匀。超声波震荡30 min，4 000 r/min离心10 min，转移上清液。
将上清液在分液漏斗中用饱和NaCl（10%）水溶液洗至中性，弃下层（水层）。将上层色素溶液分装在10 mL离心管中，氮吹仪真空浓缩后用2 mL甲基叔丁基醚（MTBE，含0.01% BHT）溶解，再加3 mL 10%KOH-甲醇溶液充氮，避光条件下皂化过夜（8～10 h）。皂化结束后，加3 mL饱和NaCl水溶液和2 mL MTBE（含0.01% BHT）使之更好地分层，用胶头吸管吸走下层水层，用饱和NaCl水溶液洗至中性。将色素上清液真空浓缩，用总体积0.2～1 mL MTBE和甲醇溶解定容（色谱级，含0.01% BHT）。12 000 r/min离心30 min，过0.22 μL微孔滤膜，转移到进样瓶中待测。
1.2.2 类胡萝卜素组分分析 色谱检测系统为Waters 1525型高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，YMC C30类胡萝卜素专用色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，Wilmington，NC，USA）。
类胡萝卜素HPLC分析设置两种流动相检测。流动相1：A相为乙腈 ∶ 甲醇 ∶ 水（7 ∶ 2 ∶ 1），B相为MTBE ∶ 甲醇 ∶ 水（90 ∶ 6.6 ∶ 3.3）。洗脱条件如下，0 min：A-B（95 ∶ 5）；0～10 min：A-B（95 ∶ 5）；10～19 min：A-B（86 ∶ 14）；19～29 min：A-B（75 ∶ 25）；29～40 min：A-B（50 ∶ 50）；40～50 min：A-B（26 ∶ 74）；50～60 min：A-B（95 ∶ 5）；流速为 1 mL/min。流动相2：A相为甲醇 ∶ 水（9 ∶ 1），B相为MTBE ∶ 甲醇 ∶ 水（90 ∶ 6.6 ∶ 3.3），洗脱条件、流速同上。
根据标准样品特征吸收峰进行类胡萝卜素定性分析，每个样品测定3次，取平均值（技术重复）。类胡萝卜素定量采用自动积分获取样品的峰面积，外标标准曲线法定量。
1.3 数据处理
类胡萝卜素检测数据由Empower 3分析导出，数据分析在Excel 2010中进行。
2 结果与分析
2.1 菠萝蜜果肉类胡萝卜素分析方法比较
通过高效液相色谱法，采用2种流动相针对供测材料的混合样（黄肉品种/系：‘琼引1号’、‘XYS-8’、‘YS-11’；红肉品种：‘马来西亚5号’、‘珍珠果’、‘四季红’）重复3次分析，根据3次结果的吻合度确定最佳的流动相组合。结果如图1所示，流动相1[A，乙腈 ∶ 甲醇 ∶ 水（7 ∶ 2 ∶ 1）；B，MTBE ∶ 甲醇 ∶ 水（90 ∶ 6.6 ∶ 3.3）]3次重复之间存在较大差异（图1，A-C）。首先，重复之间出峰的时间不同，第1次重复20 min左右开始出峰，但后2次同一出峰时间推迟至25 min左右。其次，相同时间出现的峰，面积存在差异，进而导致能检测出物质的种类重复性不好，而第3次重复只出现了14个明显的峰。流动相2[A，甲醇 ∶ 水（9 ∶ 1）；B，MTBE ∶ 甲醇 ∶ 水（90 ∶ 6.6 ∶ 3.3）]3次重复之间一致性较好，供测样品一共检测出16种物质，且出峰时间较为一致（图1，D-F）。根据结果，选择流动相2组合[A，甲醇 ∶ 水（9 ∶ 1）；B，MTBE ∶ 甲醇 ∶ 水（90 ∶ 6.6 ∶ 3.3）]开展后续实验。
2.2 不同色泽果肉中类胡萝卜素组分分析
黄肉品种/系（‘琼引1号’、‘XYS-8’、‘XYS-11’）和红肉品种（‘马来西亚5号’、‘珍珠果’、‘四季红’）果肉色泽如图2所示。 根据标准品的特征吸收峰进行类胡萝卜素定性分析，红色果肉和黄色果肉中，一共鉴定出16种类胡萝卜素组分（图3）。根据外标标准曲线法，对鉴定出的组分进行定量分析。3个红色果肉类胡萝卜素总体含量分别为434.21、327.39和629.68 μg/g，黄色果肉含量分别为255.19、113.46和155.96 μg/g，红肉品种类胡萝卜素含量高于黄肉品种（表1）。组分分析结果发现，黄色果肉中主要组分为violaxanthin（紫黄质）、lutein（叶黄素）、9-cis-violaxanthin（9-顺式紫黄质），红色果肉中主要组分为luteoxanthin（黄体黄质）、β-citraurin（β-柠乌素）、all-trans-neoxanthin（全反式新黄质）。其中β-柠乌素、全反式新黄质、黄体黄质、全反式新黄质是主要的差异组分，结果见表1。在差异组分中，β-柠乌素是唯一呈红色的类胡萝卜素组分，是红肉菠萝蜜的呈色物质。在黄肉菠萝蜜中，类胡萝卜素组分均为黄色，其中紫黄质含量最高，占总类胡萝卜素含量的60%左右，是黄肉的主要呈色组分。
2.3 类胡萝卜素差异组分代谢关系分析
根据不同色泽菠萝蜜果肉中类胡萝卜素组分的含量差异，结合差异组分之间的代谢关联，我们初步分析不同呈色组分之间的代谢关系。首先，在3个红肉菠萝蜜品种中，红色呈色物质β-柠乌素含量分别为54.88、28.61和47.94 μg/g，而在黄肉品种中没有检测到该组分。黄肉品种中主要的呈色物质是紫黄质，其含量分别为170.82、81.19和86.58 μg/g，是红肉品种中含量的2～4倍。在类胡萝卜素代谢途径中，这两种差异组分有着共同的前体物质。β-柠乌素以玉米黄质和β-隐黄质为前体，在类胡萝卜素裂解氧化酶4（Cleavage Dioxygenase 4， CCD4）的作用下裂解7、8或7′、8′位共轭双键后加氧形成。而紫黄质同样以玉米黄质和β-隐黄质为前体，在玉米黄质环氧酶（zeaxanthin epoxidase， ZEP）的作用下通过氧化反应生成[16]。类胡萝卜素定量分析结果发现，不同品种菠萝蜜果肉中，玉米黄质和β-隐黄质含量极低，说明呈色物质的前体并没有在果肉中富集而是继续进行下游的代谢反应。有鉴于此，我们认为玉米黄质和β-隐黄质的下游代谢途径的差异引起了菠萝蜜果肉色泽的不同。其次，除β-柠乌素之外，红色果肉中含量较高的全反式新黄质、黄体黄质、all-trans-neochrome，这类物质为紫黄质的异构体。由此可见，红色果肉和黄色果肉中差异类胡萝卜素组分之间存在一定的代谢关联，即紫黄质代谢的上游前体分支裂解反应及下游异构化反应是造成红肉和黄肉类胡萝卜素组分差异的主要原因（图4）。
3 讨论
类胡萝卜素是菠萝蜜果肉的呈色物质，不同类胡萝卜素组分使得其果肉呈现黄色至橙红色。自20世纪90年代，国外就陆续有菠萝蜜果肉类胡萝卜素组分分析的报道，Tee等[17]利用HPLC从菠萝蜜果实中鉴定出6种类胡萝卜素组分。Faria[14]利用液相串联API质谱，结合2种不同的类胡萝卜素检测柱鉴定出18种类胡萝卜素组分。整体而言，目前菠萝蜜类胡萝卜素尚缺少一套简便、高效的检测方法。本研究参考柑橘、枇杷等作物的提取、分析方法，所建立的方法能从6个不同的菠萝蜜品种中检测出16种不同的类胡萝卜素组分。与液相串联API质谱配合2种不同检测柱的结果相比，含量较低的隐黄质和2个玉米黄质异构体没有检测出来，但新检测出一种新的类胡萝卜素组分β-柠乌素，其他組分没有差异，结果基本一致。但是在分析方法上，本研究采取高效液相结合YMC carotenoid column C30一种色谱柱，且不需要串联质谱即可达到分离效果，比Faria的方法更为简便。综上所述，本研究所采用的分析体系能准确区分菠萝蜜果肉中主要的类胡萝卜素组分，可作为后续类胡萝卜素组分鉴定及品质研究的有效方法。
呈色物质的分析是近年来植物类胡萝卜素研究的热点。番茄红素和β-胡萝卜素是柑橘红肉突变体最常见的呈色组分[18]。周春华等[19]的研究发现，红肉枇杷果肉以β-胡萝卜素为主，白肉枇杷则以玉米黄质和叶黄素为主。本研究中，β-柠乌素是唯一呈红色的类胡萝卜素组分且特异存在于红色果肉中，是红肉菠萝蜜的呈色组分。紫黄质是黄肉品种中主要的类胡萝卜素组分，占整体含量的60%，是黄肉的主要呈色物质。β-柠乌素是一种C30脱辅基类胡萝卜素（C30-apocarotenoid），迄今为止仅在柑橘类水果中报道，且存在于几个特定品种果皮发育的特定阶段，是红色果皮的呈色物质[20-21，16]。本研究结果是除柑橘类水果外，植物界第二例关于β-柠乌素的报道。与柑橘不同的是，菠萝蜜β-柠乌素存在于可直接食用的果肉中，该物质的鉴定为提高菠萝蜜的营养品质和商业价值提供了新的思路。
研究呈色物质的合成与代谢机理是分子育种的重要前提。在柑橘中，β-柠乌素以β-隐黄质和玉米黄质为前体，在CCCD 4（Carotenoid Cleavage Dioxygenase4）催化下裂解7、8位双键形成。β-柠乌素的积累与前体物质β-隐黄质和玉米黄质以及下游产物紫黄质的积累呈显著负相关[22-24]。本研究中，红肉和黄肉菠萝蜜的差异组分主要为β-柠乌素、紫黄质和黄体黄质。差异组分之间存在代谢关联，即紫黄质前体分支裂解反应及下游异构化产物是造成红肉和黄肉类胡萝卜素组分差异的主要原因。该结果与柑橘中β-柠乌素代谢机理吻合，但紫黄质下游的异构化产物的积累则体现了菠萝蜜类胡萝卜素代谢的特点。本研究一方面为菠萝蜜品质育种提供了理论参考，同时对于丰富植物类胡萝卜素代谢理论具有重要意义。
致 谢 感谢华中农业大学徐娟教授在类胡萝卜素组分分析实验中给予的指导。
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