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摘要：苹果褐斑病主要危害叶片，可导致苹果早期落叶，对苹果树体和产量造成严重影响，而培育抗褐斑病的苹果品种是解决这一问题的根本途径。‘秦冠’和‘富士’是当前生产上对苹果褐斑病抗性水平差异较大的两个品种。本试验利用扫描电镜和石蜡切片法对褐斑病抗病品种‘秦冠’和感病品种‘富士’的叶片结构进行观察，结果表明，与‘秦冠’相比，‘富士’叶片上、下表面较粗糙，角质层明显偏薄，且气孔密度较大，推测二者对褐斑病的不同抗性水平可能与其叶片的结构特征有密切关系。
关键词：苹果；褐斑病抗性；叶片；显微结构
中图分类号：S661.101 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）04-0038-04
Comparison of Leaf Microstructure between Two Apple Cultivars
with Different Resistance to Brown Spot Disease
Kong Xianghua， Zhang Wei， Hou Dongliang， Tian Yike， Yang Shaolan， Xiao Yuxiong
（College of Horticulture， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China）
Abstract Apple brown spot disease mainly damages leaves which can lead to earlier defoliation and result in serious effects on apple tree growth and yield. Breeding resistant apple cultivars is the final way to solve this problem. Qinguan and Fuji are two main cultivars in apple production currently with great difference on resistant level to this disease. The leaf structure of the resistant cultivar Qinguan and the susceptible cultivar Fuji were observed by the method of scanning electron microscopy and paraffin. Compared with Qinguan， the leaf surface of Fuji in front and back side was much rougher， and the cuticle thickness was smaller， moreover， the stoma density was significantly larger. It was speculated that the different resistance to apple brown spot disease of these two cultivars might derived from their different structure characters in leaves.
Keywords Apple； Resistance to brown spot disease； Leaf； Microstructure
蘋果产业的发展在我国水果生产上具有举足轻重的地位。近年来，苹果栽培面积和产量迅速上升，但栽培品种相对单一，应对大规模病虫害及其它自然灾害的能力较差，给苹果生产造成了潜在的威胁。‘富士’是目前我国苹果生产上栽培面积最大的主栽品种，但病害和抗性一直是困扰生产者的主要问题。‘秦冠’是我国自主选育的在生产上推广面积最大的苹果品种。长期栽培实践证明‘秦冠’苹果具有结果早、丰产稳产、抗逆性强等特点。尽管‘秦冠’肉质较粗、风味品质稍差，但由于易于栽培管理，目前仍是我国黄土高原产区最受果农青睐的主栽品种之一。
抗性品种的选育是降低生产成本和进行无公害生产的根本途径。苹果褐斑病是造成苹果树早期落叶的主要病害，在我国各大苹果产区均有发生。众多研究表明，‘富士’是受褐斑病危害严重的品种（为感病品种），相对来说，‘秦冠’的抗褐斑病能力较强（为抗病品种）[1-4]，是栽培苹果种内极其珍贵的抗性种质。因此，有效利用这一基因资源进行栽培品种的遗传改良，对苹果生产具有重要意义。
已有研究发现，苹果对褐斑病的抗性表现在抗侵入和抗扩展能力两个方面[5]。因此，本研究拟通过电镜扫描技术和石蜡切片技术，对 ‘富士’和‘秦冠’的成熟叶片进行显微结构比较，为探讨二者抗性差异产生的原因提供一些形态解剖上的证据，同时，为杂交后代的早期选择提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供試苹果品种为‘秦冠’和‘富士’。试验材料取自青岛农业大学胶州试验站。
1.2 方法
1.2.1 石蜡切片法 于生长季选择植株中部外围一年生枝条，取春梢中下部成熟叶片，用酒精棉球擦掉叶片表面的灰尘，从叶片中部以中脉为中轴，用双面刀片快速切取大小为0.5 cm×0.5 cm 的叶面，迅速放入FAA固定液中固定24 h。酒精脱水、浸蜡包埋、切片及染色观察等参考陈宝印等[6]的方法进行。每个种类抽取10个样片，用Nikon ECLIPSE 80i显微镜观察并拍照，每片镜检3个视野。用E-ruler 软件测量叶片总厚度、栅栏组织与海绵组织厚度以及角质层厚度，用DPS 7.05软件进行差异显著性检验（t测验法）。 1.2.2 扫描电镜法 材料取样和固定同上。将FAA固定好的样品用0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH=6.8）冲洗6～8次，每次30 min，后经梯度乙醇（30%→50%→70%→80%→90%→100%）脱水，每梯度脱水时间为30 min，再经1/2乙醇+1/2叔丁醇（30 min）过渡至叔丁醇（30 min）。处理好的样品经JFD-320冷冻干燥机干燥，再经JFC-1600离子溅射仪镀金后，在JSM-7500F扫描电镜下观察并照相。用E-ruler软件测量扫描电镜所拍图片中气孔长、宽（外径）并根据比例尺进行换算，每次观察10个气孔，重复3次，平均值即为该植株气孔的长度与宽度。测定气孔密度时计数10个视野的气孔数目，求其平均值作为气孔密度。长度测定及分析软件同1.2.1。
2 结果与分析
2.1 两个苹果品种叶片表面显微结构特征比较
通过电镜观察发现，两个供试苹果品种的叶片上表皮表面形状明显不同（图1）。 ‘富士’的叶片表面极为粗糙，形成较深的凹沟，有利于雨水的附着，为病原菌的侵染创造了有利条件。而‘秦冠’的叶片表面相对光滑，凹沟较浅，容易保持干燥，可减少病原菌侵染的机会。
与上表皮相似，‘富士’下表皮的粗糙程度也明显高于‘秦冠’（图2）。另外，两个品种的气孔特征也存在较大差异，‘秦冠’的气孔密度极显著小于‘富士’（表1）。
2.2 两个苹果品种叶片纵切面显微结构特征比较
石蜡切片观察结果显示：与‘富士’相比，抗病品种‘秦冠’具有明显偏厚的角质层和致密的栅栏组织（图3）。测量分析结果表明，‘秦冠’ 的上表皮角质层厚度极显著大于‘富士’，下表皮角质层厚度显著大于‘富士’（表2）。
3 讨论与结论
苹果褐斑病的初侵染源主要来自越冬病叶上病菌产生的子囊孢子，其后以分生孢子作为繁殖体在果树生长季进行多次再侵染[7]。苹果褐斑病原菌的侵染过程为先与叶片接触，产生胶状物质以便附着，然后开始侵染[8]，所以叶片表皮结构对植物的抗病性有重要影响。本研究通过扫描電镜观察发现，与抗病品种‘秦冠’相比，感病品种‘富士’的叶片上表面呈较深的凹槽状，这种结构有利于雨水的存留，为病菌的附着与生长创造了有利条件，且下表皮也较粗糙。可见，‘秦冠’叶片具有明显优于‘富士’的抗性结构特征。
植物在与病原菌长期协同进化的过程中形成了一套复杂的防卫机制[9]。植物本身的某些物理结构屏障以及自身的特殊成分，如细胞壁表皮上的蜡质、角质、皮孔、气孔、细胞壁的一些化学成分（木质素、角质素等）以及各种病程相关蛋白和自身分泌的某些化学成分，都会对植物的抗病性造成重要影响。Zhao等[10]通过显微观察发现，苹果褐斑病菌通过芽管或附着胞穿透角质层，形成吸器后在寄主表皮细胞和叶肉细胞间隙扩展。接种试验也表明，寄主品种对褐斑病的抗性与叶片角质层厚度呈正相关[11]。因此，角质层是植物抵抗病原菌入侵的一道重要屏障。本研究发现，抗病品种‘秦冠’的叶片表面角质层厚度明显大于感病品种‘富士’，这可能对其抵抗病原菌入侵能力的提高具有重要意义。
气孔也是外源病菌侵入植物的主要通道之一。在苹果叶片上，气孔分布于叶片的背面。苹果褐斑病菌从叶片的正面和背面均可侵入，但从背面侵入的量大一些[12]。有研究认为气孔是植物预先形成的抗病性防御体系[13]。党志国等[1]研究发现不同苹果品种间气孔密度差异很大，褐斑病抗病品种的叶片气孔密度明显小于感病品种，且与发病程度呈正相关。本研究对抗病品种‘秦冠’和感病品种‘富士’的气孔密度比较分析也支持了这一结论。然而，赵华[14]在研究苹果褐斑病过程中并未发现病原菌从叶片气孔侵入的现象。由于植物的抗病机制十分复杂，气孔是否对褐斑病的入侵有重要影响，叶片的气孔密度是否可作为苹果抗褐斑病种质的形态鉴定指标加以应用，还需进一步探讨。
参 考 文 献：
[1] 党志国， 高华， 王雷存， 等. 不同苹果品种对褐斑病抗性的鉴定及抗性生理研究[J]. 植物生理学报， 2011， 47 （7）： 691-698.
[2] 李燕， 周倩， 高華， 等. 苹果主栽品种的褐斑病和斑点病抗性评价[J]. 西北林学院学报， 2012， 27（1）： 132-136.
[3] 王洁， 赵华， 苏苏， 等. 苹果属不同种对褐斑病菌生长发育的影响[J]. 西北农业学报， 2012， 21（5）： 60-64，83.
[4] 殷丽华. 苹果属资源对苹果褐斑病的抗性机理及抗性诱导研究[D]. 杨凌：西北农林科技大学， 2013.
[5] 赵晶， 朱刚， 黄园， 等. 冠盘二胞Marssonina coronaria侵染不同抗性苹果叶片的组织病理学研究[J]. 菌物学报， 2012， 31（4）： 548-559.
[6] 陈宝印， 王彩虹， 初庆刚， 等. 外源油菜素内酯对矮生梨试管苗茎、叶生长及解剖特性的影响[J]. 北方园艺，2014（11）：7-11.
[7] 高月娥， 李保华， 董向丽， 等. 温度和湿度对越冬后苹果褐斑病菌产孢的影响[J]. 中国农业科学， 2011， 44（7）： 1367-1374.
[8] 王洁. 利用组织细胞学技术研究苹果褐斑病菌对富士、山定子的侵染过程差异[D]. 杨凌：西北农林科技大学， 2012.
[9] Chisholm S T， Coaker G， Day B， et al. Host-microbe interactions： shaping the evolution of the plant immune response[J]. Cell， 2006， 124（4）： 803-814.
[10]Zhao H， Han Q， Wang J， et al. Cytology of infection of apple leaves by Diplocarpon mali[J]. European Journal of Plant Pathology， 2013，136（1）：41-49.
[11]谢为龙， 冷怀琼. 苹果褐斑病的研究——品种间抗病性差异与理化性状的关系[J]. 四川农业大学学报， 1990，8（1）：51-54.
[12]谢为龙， 冷怀琼. 苹果褐斑病的研究——Ⅰ病原的侵入和生物学特性[J]. 四川农业大学学报， 1988，7（3）：223-227.
[13]董金皋， 黄梧芳. 植物的形态结构与抗病性[J]. 植物病理学报， 1995，25（1）：1-3.
[14]赵华. 苹果褐斑病病原学、组织细胞学和化学防治研究[D]. 杨凌：西北农林科技大学， 2012.
关键词：苹果；褐斑病抗性；叶片；显微结构
中图分类号：S661.101 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）04-0038-04
Comparison of Leaf Microstructure between Two Apple Cultivars
with Different Resistance to Brown Spot Disease
Kong Xianghua， Zhang Wei， Hou Dongliang， Tian Yike， Yang Shaolan， Xiao Yuxiong
（College of Horticulture， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China）
Abstract Apple brown spot disease mainly damages leaves which can lead to earlier defoliation and result in serious effects on apple tree growth and yield. Breeding resistant apple cultivars is the final way to solve this problem. Qinguan and Fuji are two main cultivars in apple production currently with great difference on resistant level to this disease. The leaf structure of the resistant cultivar Qinguan and the susceptible cultivar Fuji were observed by the method of scanning electron microscopy and paraffin. Compared with Qinguan， the leaf surface of Fuji in front and back side was much rougher， and the cuticle thickness was smaller， moreover， the stoma density was significantly larger. It was speculated that the different resistance to apple brown spot disease of these two cultivars might derived from their different structure characters in leaves.
Keywords Apple； Resistance to brown spot disease； Leaf； Microstructure
蘋果产业的发展在我国水果生产上具有举足轻重的地位。近年来，苹果栽培面积和产量迅速上升，但栽培品种相对单一，应对大规模病虫害及其它自然灾害的能力较差，给苹果生产造成了潜在的威胁。‘富士’是目前我国苹果生产上栽培面积最大的主栽品种，但病害和抗性一直是困扰生产者的主要问题。‘秦冠’是我国自主选育的在生产上推广面积最大的苹果品种。长期栽培实践证明‘秦冠’苹果具有结果早、丰产稳产、抗逆性强等特点。尽管‘秦冠’肉质较粗、风味品质稍差，但由于易于栽培管理，目前仍是我国黄土高原产区最受果农青睐的主栽品种之一。
抗性品种的选育是降低生产成本和进行无公害生产的根本途径。苹果褐斑病是造成苹果树早期落叶的主要病害，在我国各大苹果产区均有发生。众多研究表明，‘富士’是受褐斑病危害严重的品种（为感病品种），相对来说，‘秦冠’的抗褐斑病能力较强（为抗病品种）[1-4]，是栽培苹果种内极其珍贵的抗性种质。因此，有效利用这一基因资源进行栽培品种的遗传改良，对苹果生产具有重要意义。
已有研究发现，苹果对褐斑病的抗性表现在抗侵入和抗扩展能力两个方面[5]。因此，本研究拟通过电镜扫描技术和石蜡切片技术，对 ‘富士’和‘秦冠’的成熟叶片进行显微结构比较，为探讨二者抗性差异产生的原因提供一些形态解剖上的证据，同时，为杂交后代的早期选择提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供試苹果品种为‘秦冠’和‘富士’。试验材料取自青岛农业大学胶州试验站。
1.2 方法
1.2.1 石蜡切片法 于生长季选择植株中部外围一年生枝条，取春梢中下部成熟叶片，用酒精棉球擦掉叶片表面的灰尘，从叶片中部以中脉为中轴，用双面刀片快速切取大小为0.5 cm×0.5 cm 的叶面，迅速放入FAA固定液中固定24 h。酒精脱水、浸蜡包埋、切片及染色观察等参考陈宝印等[6]的方法进行。每个种类抽取10个样片，用Nikon ECLIPSE 80i显微镜观察并拍照，每片镜检3个视野。用E-ruler 软件测量叶片总厚度、栅栏组织与海绵组织厚度以及角质层厚度，用DPS 7.05软件进行差异显著性检验（t测验法）。 1.2.2 扫描电镜法 材料取样和固定同上。将FAA固定好的样品用0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH=6.8）冲洗6～8次，每次30 min，后经梯度乙醇（30%→50%→70%→80%→90%→100%）脱水，每梯度脱水时间为30 min，再经1/2乙醇+1/2叔丁醇（30 min）过渡至叔丁醇（30 min）。处理好的样品经JFD-320冷冻干燥机干燥，再经JFC-1600离子溅射仪镀金后，在JSM-7500F扫描电镜下观察并照相。用E-ruler软件测量扫描电镜所拍图片中气孔长、宽（外径）并根据比例尺进行换算，每次观察10个气孔，重复3次，平均值即为该植株气孔的长度与宽度。测定气孔密度时计数10个视野的气孔数目，求其平均值作为气孔密度。长度测定及分析软件同1.2.1。
2 结果与分析
2.1 两个苹果品种叶片表面显微结构特征比较
通过电镜观察发现，两个供试苹果品种的叶片上表皮表面形状明显不同（图1）。 ‘富士’的叶片表面极为粗糙，形成较深的凹沟，有利于雨水的附着，为病原菌的侵染创造了有利条件。而‘秦冠’的叶片表面相对光滑，凹沟较浅，容易保持干燥，可减少病原菌侵染的机会。
与上表皮相似，‘富士’下表皮的粗糙程度也明显高于‘秦冠’（图2）。另外，两个品种的气孔特征也存在较大差异，‘秦冠’的气孔密度极显著小于‘富士’（表1）。
2.2 两个苹果品种叶片纵切面显微结构特征比较
石蜡切片观察结果显示：与‘富士’相比，抗病品种‘秦冠’具有明显偏厚的角质层和致密的栅栏组织（图3）。测量分析结果表明，‘秦冠’ 的上表皮角质层厚度极显著大于‘富士’，下表皮角质层厚度显著大于‘富士’（表2）。
3 讨论与结论
苹果褐斑病的初侵染源主要来自越冬病叶上病菌产生的子囊孢子，其后以分生孢子作为繁殖体在果树生长季进行多次再侵染[7]。苹果褐斑病原菌的侵染过程为先与叶片接触，产生胶状物质以便附着，然后开始侵染[8]，所以叶片表皮结构对植物的抗病性有重要影响。本研究通过扫描電镜观察发现，与抗病品种‘秦冠’相比，感病品种‘富士’的叶片上表面呈较深的凹槽状，这种结构有利于雨水的存留，为病菌的附着与生长创造了有利条件，且下表皮也较粗糙。可见，‘秦冠’叶片具有明显优于‘富士’的抗性结构特征。
植物在与病原菌长期协同进化的过程中形成了一套复杂的防卫机制[9]。植物本身的某些物理结构屏障以及自身的特殊成分，如细胞壁表皮上的蜡质、角质、皮孔、气孔、细胞壁的一些化学成分（木质素、角质素等）以及各种病程相关蛋白和自身分泌的某些化学成分，都会对植物的抗病性造成重要影响。Zhao等[10]通过显微观察发现，苹果褐斑病菌通过芽管或附着胞穿透角质层，形成吸器后在寄主表皮细胞和叶肉细胞间隙扩展。接种试验也表明，寄主品种对褐斑病的抗性与叶片角质层厚度呈正相关[11]。因此，角质层是植物抵抗病原菌入侵的一道重要屏障。本研究发现，抗病品种‘秦冠’的叶片表面角质层厚度明显大于感病品种‘富士’，这可能对其抵抗病原菌入侵能力的提高具有重要意义。
气孔也是外源病菌侵入植物的主要通道之一。在苹果叶片上，气孔分布于叶片的背面。苹果褐斑病菌从叶片的正面和背面均可侵入，但从背面侵入的量大一些[12]。有研究认为气孔是植物预先形成的抗病性防御体系[13]。党志国等[1]研究发现不同苹果品种间气孔密度差异很大，褐斑病抗病品种的叶片气孔密度明显小于感病品种，且与发病程度呈正相关。本研究对抗病品种‘秦冠’和感病品种‘富士’的气孔密度比较分析也支持了这一结论。然而，赵华[14]在研究苹果褐斑病过程中并未发现病原菌从叶片气孔侵入的现象。由于植物的抗病机制十分复杂，气孔是否对褐斑病的入侵有重要影响，叶片的气孔密度是否可作为苹果抗褐斑病种质的形态鉴定指标加以应用，还需进一步探讨。
参 考 文 献：
[1] 党志国， 高华， 王雷存， 等. 不同苹果品种对褐斑病抗性的鉴定及抗性生理研究[J]. 植物生理学报， 2011， 47 （7）： 691-698.
[2] 李燕， 周倩， 高華， 等. 苹果主栽品种的褐斑病和斑点病抗性评价[J]. 西北林学院学报， 2012， 27（1）： 132-136.
[3] 王洁， 赵华， 苏苏， 等. 苹果属不同种对褐斑病菌生长发育的影响[J]. 西北农业学报， 2012， 21（5）： 60-64，83.
[4] 殷丽华. 苹果属资源对苹果褐斑病的抗性机理及抗性诱导研究[D]. 杨凌：西北农林科技大学， 2013.
[5] 赵晶， 朱刚， 黄园， 等. 冠盘二胞Marssonina coronaria侵染不同抗性苹果叶片的组织病理学研究[J]. 菌物学报， 2012， 31（4）： 548-559.
[6] 陈宝印， 王彩虹， 初庆刚， 等. 外源油菜素内酯对矮生梨试管苗茎、叶生长及解剖特性的影响[J]. 北方园艺，2014（11）：7-11.
[7] 高月娥， 李保华， 董向丽， 等. 温度和湿度对越冬后苹果褐斑病菌产孢的影响[J]. 中国农业科学， 2011， 44（7）： 1367-1374.
[8] 王洁. 利用组织细胞学技术研究苹果褐斑病菌对富士、山定子的侵染过程差异[D]. 杨凌：西北农林科技大学， 2012.
[9] Chisholm S T， Coaker G， Day B， et al. Host-microbe interactions： shaping the evolution of the plant immune response[J]. Cell， 2006， 124（4）： 803-814.
[10]Zhao H， Han Q， Wang J， et al. Cytology of infection of apple leaves by Diplocarpon mali[J]. European Journal of Plant Pathology， 2013，136（1）：41-49.
[11]谢为龙， 冷怀琼. 苹果褐斑病的研究——品种间抗病性差异与理化性状的关系[J]. 四川农业大学学报， 1990，8（1）：51-54.
[12]谢为龙， 冷怀琼. 苹果褐斑病的研究——Ⅰ病原的侵入和生物学特性[J]. 四川农业大学学报， 1988，7（3）：223-227.
[13]董金皋， 黄梧芳. 植物的形态结构与抗病性[J]. 植物病理学报， 1995，25（1）：1-3.
[14]赵华. 苹果褐斑病病原学、组织细胞学和化学防治研究[D]. 杨凌：西北农林科技大学， 2012.