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摘 要 目的：建立定量测定大鼠血浆中抗肿瘤药aSPH0396的LC-MS/MS方法，并将其应用于大鼠体内药代动力学研究。方法：血浆样品在Waters BEH C18柱上以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液进行梯度洗脱；采用MRM方式进行定量测定，监测离子对为m/z 553.4→453.4（SPH0396）和m/z 533.3→259.9（内标ponatinib）。结果：SPH0396在1.11～2 488.50 ng/ml的浓度范围内呈良好的线性关系（R2=0.999），定量下限为1.11 ng/ml，回收率和精密度均符合生物样品检测要求。大鼠静注3 mg/kg SPH0396后，t1/2为3.43±0.37 h，CL为2.13±0.21L/h·kg，Vdss为6.76±0.26 L/kg。大鼠口服5、15 和50 mg/kg的SPH0396后吸收较慢，Tmax为4～6 h。大鼠口服不同剂量的SPH0396，Cmax和AUC（0-t）的增加比例均高于剂量增加比例，生物利用度分别为17.15%、25.58%和36.19%。结论：本研究首次建立了特异、灵敏、便捷的定量检测大鼠血浆中SPH0396的LC-MS/MS方法，并成功应用于SPH0396的大鼠药代动力学研究。
关键词 酪氨酸激酶抑制剂 药代动力学 LC-MS/MS
中图分类号：R969.1 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2015）11-0070-05
ABSTRACT Objective： To develop and validate an LC-MS/MS method for the quantitative analysis of a new anti-tumor candidate SPH0396 in rat plasma so as to be applied to the pharmacokinetic study in rats. Methods： The chromatographic separation of SPH0396 was performed on BEH C18 column by a gradient elution with water containing 0.1% formic acid and acetonitrile containing 0.1% formic acid. The MS detection was conducted on MRM mode and the ion-pairs monitored were m/z 553.4→453.4 （SPH0396） and m/z 533.3→259.9 with ponatinib as an internal standard. Results： A standard curve for the determination of SPH0396 showed a good linearity over the range of 1.11～2 488.50 ng/ml （R2=0.999） with the lower limit of quantification at 1.11 ng/ml. The recovery and precision could meet the requirement of bioanalysis. After intravenous administration of SPH0396， the t1/2， CL and Vdss in rats were 3.43±0.37 h， 2.13±0.21 L/h·kg and 6.76±0.26 L/kg， respectively. The absorption of SPH0396 in rats was slow after oral administration. The peak level was reached at 4～6 h. The oral bioavailability was 17.15%， 25.58% and 36.19% at different doses， respectively. Conclusion： The LC-MS/MS method is specific， sensitive， rapid and simple and is suitable for pharmacokinetic study of SPH0396 in rats.
KEY WORDS tyrosine kinase inhibitors； pharmacokinetics； LC-MS/MS
酪氨酸激酶（TKs）在许多生理过程都发挥关键性作用，而它的活性失调被证明与多种癌症的发生、发展相关。近年来，以酪氨酸激酶为靶点进行药物研发已成为国际上抗肿瘤药物研究的热点，多种小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）被批准上市用于肿瘤治疗[1-3]。本研究院针对Bcr-Abl靶点[4-7]，设计并合成了一系列化合物，并对其中部分化合物进行了体外药效学和早期代谢性质的评价。其中SPH0396（图1）在激酶和细胞水平的抗肿瘤活性均接近或优于上市药物bosutinib[8-11]（图1），体内外药代性质良好。因此将其选为候选化合物进一步开发，用于对伊马替尼耐药的慢性粒细胞白血病（CML）。本文对SPH0396在雄性大鼠体内的药代动力学性质进行了研究。
材料与仪器
药品与试剂
SPH0396由上海医药中央研究院提供，纯度99.69%；内标帕纳替尼（ponatinib，图1；Molttl公司）；色谱纯级乙腈（德国Merck公司）；色谱纯级甲酸（德国CNW公司）；其它分析纯级试剂均购自中国医药（集团）上海化学试剂公司；实验用纯水由Milli-Q纯水仪制备而成。 仪器
Acquity UPLC液相色谱系统（美国Waters公司）串联API4000 Q-trap型三重四级杆质谱检测器（美国Applied Biosystems公司），配有ESI源、四元梯度泵、自动进样器和数据处理系统；CPA225D分析天平（德国Satroious公司）；Mulrifuge X3R高速冷冻离心机（美国Thermo公司）；V230多管振荡器（美国Fisher公司）；Milli-QTM型超纯水净化器（美国Millipore公司）。
实验动物
SD大鼠，雄性，180～220 g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供。许可证号SCXK（沪）2013～0016。
实验方法
LC/MS检测条件
色谱条件：色谱柱为BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 mm，美国 Waters公司）。流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液，洗脱程序如下：0～0.5 min 流动相A和B的比例为95∶5，0.5～1.0 min线性变至5∶95，1.0～2.2 min维持5∶95，2.2～2.5 min线性恢复至95∶5，2.5～3 min保持95∶5。流速0.3 ml/min，柱温40 ℃，进样量5 ml。
质谱条件：离子源为ESI源，正离子模式检测；毛细管电压5 500 V，离子源温度500 ℃，干燥气10 L/min，雾化气50 psi，碰撞气压力（CAD）为Medium；扫描方式为多反应监测（MRM），用于定量分析的离子对分别为SPH0396，m/z 553.4→453.4，去簇电压（DP）80 V，碰撞能量（CE）30 V；内标ponatinib，m/z 533.3→259.9，DP143 V，CE 30 V。
样品处理方法
大鼠血浆样品50 ml，加入200 ml含内标（ponatinib，0.25 mmol/L）的乙腈沉淀蛋白，涡旋振荡10 min后，于6 000 g离心10 min，取200 ml上清于6 000 g再次离心10 min，取上清50 ml于96孔板中进样，进样量5 ml。
LC/MS方法学验证
标准曲线的配制
精密称取SPH0396粉末5.03 mg，加入90.9 ml的DMSO，配制为100 mmol/L的储备液。再将此储备液用乙腈逐级稀释成浓度为22.14、55.35、166.04、553.46、1 600.38、5 534.60、16 603.80、33 207.60、49 811.40 ng/ml的系列工作液。取95 ml的空白大鼠血浆加入5 ml的上述工作液，配制成浓度为1.11、2.77、8.30、27.67、83.02、276.73、830.19、1 600.38、2 490.57 ng/ml的标准曲线。取50 ml的含药血浆按2.2项下方法处理后进样。
内标液的配制
精密称取ponatinib 2.53 mg，加入47.5 ml的DMSO，配制为100 mmol/L的储备液。取上述储备液2.5 ml，加入1 L乙腈，配制为0.25 mmol/L的内标液。
质控样品的配制
将2.3.1中100 mmol/L的SPH0396储备液用乙腈逐级稀释成浓度为49.81、11 069.20和38 742.20 ng/ml的系列质控工作液。取95 ml的空白大鼠血浆加入5 ml的质控工作液，配制成浓度为2.49、553.46、1 937.11 ng/ml的质控样品。取50 ml的含药血浆按2.2项下方法处理后进样。
大鼠体内实验
SD大鼠16只，雄性，180～220 g。分为4组，每组4只。分别静脉注射3 mg/kg或灌胃给予5、15和50 mg/kg的SPH0396，于给药前和给药后2、5、15、30、60、90、120、240、360、480、600、1 440 min分别于大鼠眼底静脉丛取血0.2 ml。血样于8 000 r/min离心5 min，取血浆于离心管中-20 ℃保存待测。
数据处理方法
SPH0396的血药浓度-时间曲线用Kinetica软件（Version 5.1，美国）的非房室模型进行拟合，得到药代动力学参数。Cmax为实测的最大血药浓度，Tmax为口服给药后血药浓度达峰时间，t1/2为末端消除半衰期，MRT为体内平均滞留时间，血药浓度-时间曲线下面积AUC（0-t）由梯形面积法计算得到，Vdss为稳态时表观分布容积，CL为清除率。绝对生物利用度计算公式如下：
实验结果
方法的专属性
用来自6只大鼠的空白血浆配制标准样品，空白血样、空白血样加标准品和大鼠给药后4 h血样的MRM色谱图见图2。大鼠血浆中的内源性物质不干扰SPH0396和内标ponatinib的测定，SPH0396的保留时间为1.59 min，ponatinib的保留时间为1.95 min，表明方法专属性良好。
标准曲线与线性范围
按2.3.1项下方法配制标准曲线样品并进行测定，以SPH0396样品峰面积比ponatinib内标峰面积（As/Ai）对浓度（C）作图，得到标准曲线方程为y=0.265 7x+0.007 6，相关系数R2=0.999。线性范围为1.11～2 490.57 ng/ml，定量下限为1.11 ng/ml。
精密度和准确度
配制低、中、高3个浓度（2.49、553.46、1 937.11 ng/ml）的SPH0396质控样品各6份，用随行标准曲线计算质控样品测得浓度。以质控样品测得浓度与加样浓度相比计算方法的准确度与精密度（表1）。RSD均小于10%。 大鼠静脉注射SPH0396后的药代动力学
大鼠单次静脉注射3 mg/kg的SPH0396后采集血样，按2.2项下方法处理后进样，测定SPH0396在大鼠血浆中的浓度，采用Kinetica计算药动学参数（表2）。大鼠静脉注射SPH0396后，AUC（0-t）为1 391.08±132.92 h·ng/ml，消除半衰期为3.43±0.37 h，清除率为2.13±0.21 L/h·kg，表观分布容积为6.76±0.26 L/kg。
大鼠灌胃给予SPH0396后的药代动力学
大鼠单次口服5、15和50 mg/kg的SPH0396后的血药浓度-时间曲线见图3。口服SPH0396在大鼠体内吸收较慢，血药浓度在4～6 h才能达到峰值；Cmax分别为45.68±10.97、156.36±15.01和668.42±104.72 ng/ml；AUC（0-t）分别为397.65±15.15、1 779.44±358.00和8 389.82±1 805.81 h·ng/ml。大鼠口服不同剂量的SPH0396，Cmax和AUC（0-t）的增加比例均高于剂量增加比例。相应的大鼠口服不同剂量的SPH0396生物利用度分别为17.15%、25.58%和36.19%。
讨论
SPH0396是一个新结构的抗CML候选化合物。静脉给药后，SPH0396在大鼠体内的消除半衰期较长，表观分布容积大于大鼠总体液量，说明SPH0396在大鼠体内分布较广。大鼠口服不同剂量的SPH0396，Cmax和AUC（0-t）的增加比例均高于剂量增加比例，表明SPH0396在大鼠体内的吸收是非线性的，提示可能有外排转运体参与SPH0396的吸收过程，需要进一步实验加以证实。SPH0396为bosutinib的结构类似物，我们的研究表明，其在大鼠体内的药动学性质接近或优于bosutinib，在激酶和细胞水平的抗肿瘤活性也均接近或优于bosutinib[9-11]，可做为候选化合物进一步开发。
本研究建立并验证了定量测定大鼠血浆中SPH0396的LC-MS/MS方法。该方法的专属性好，灵敏度高，回收率和精密度均符合生物样品的定量分析要求，可用于该化合物在大鼠体内的药代动力学研究。
参考文献
Levitzki A. Tyrosine kinase inhibitors： views of selectivity， sensitivity， and clinical performance[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol， 2013， 53： 161-85.
许娇红， 游育红， 许建华. 酪氨酸激酶抑制剂的研究进展[J]. 海峡药学， 2010， 22（7）： 8-11.
李欣， 高金恒， 陈国良. 蛋白酪氨酸激酶抑制剂的研究进展[J]. 沈阳药科大学学报， 2011， 28（12）： 1005-1012.
刘舒畅， 张健存， 陈赛娟. BCR-ABL蛋白激酶抑制剂的研究进展[J]. 中国医药工业杂志， 2010， 41（4）： 293-297.
Druker BJ， Tamura S， Buchdrunger I， et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positivie cells[J]. Nat Med， 1996， 2（5）： 561-566.
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Puttini M， Coiluccia AM， Boschelli F， et al. In vitro and in vivo activity of SKI-606， a novel Src-Abl inhibitor， against imatinib-resistant Bcr-Abl+ neoplastic cells[J]. Cancer Res， 2006， 66（23）： 11314-11322.
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United States Food and Drug Administration. Pharmacology review approved on 09/04/2012 （PDF） for bosutinib[EB/OL]. （2012-08-15） [2014-12-17]. http： //www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2012/203341Orig1s000PharmR.pdf.
（收稿日期：2015-01-16）
关键词 酪氨酸激酶抑制剂 药代动力学 LC-MS/MS
中图分类号：R969.1 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2015）11-0070-05
ABSTRACT Objective： To develop and validate an LC-MS/MS method for the quantitative analysis of a new anti-tumor candidate SPH0396 in rat plasma so as to be applied to the pharmacokinetic study in rats. Methods： The chromatographic separation of SPH0396 was performed on BEH C18 column by a gradient elution with water containing 0.1% formic acid and acetonitrile containing 0.1% formic acid. The MS detection was conducted on MRM mode and the ion-pairs monitored were m/z 553.4→453.4 （SPH0396） and m/z 533.3→259.9 with ponatinib as an internal standard. Results： A standard curve for the determination of SPH0396 showed a good linearity over the range of 1.11～2 488.50 ng/ml （R2=0.999） with the lower limit of quantification at 1.11 ng/ml. The recovery and precision could meet the requirement of bioanalysis. After intravenous administration of SPH0396， the t1/2， CL and Vdss in rats were 3.43±0.37 h， 2.13±0.21 L/h·kg and 6.76±0.26 L/kg， respectively. The absorption of SPH0396 in rats was slow after oral administration. The peak level was reached at 4～6 h. The oral bioavailability was 17.15%， 25.58% and 36.19% at different doses， respectively. Conclusion： The LC-MS/MS method is specific， sensitive， rapid and simple and is suitable for pharmacokinetic study of SPH0396 in rats.
KEY WORDS tyrosine kinase inhibitors； pharmacokinetics； LC-MS/MS
酪氨酸激酶（TKs）在许多生理过程都发挥关键性作用，而它的活性失调被证明与多种癌症的发生、发展相关。近年来，以酪氨酸激酶为靶点进行药物研发已成为国际上抗肿瘤药物研究的热点，多种小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）被批准上市用于肿瘤治疗[1-3]。本研究院针对Bcr-Abl靶点[4-7]，设计并合成了一系列化合物，并对其中部分化合物进行了体外药效学和早期代谢性质的评价。其中SPH0396（图1）在激酶和细胞水平的抗肿瘤活性均接近或优于上市药物bosutinib[8-11]（图1），体内外药代性质良好。因此将其选为候选化合物进一步开发，用于对伊马替尼耐药的慢性粒细胞白血病（CML）。本文对SPH0396在雄性大鼠体内的药代动力学性质进行了研究。
材料与仪器
药品与试剂
SPH0396由上海医药中央研究院提供，纯度99.69%；内标帕纳替尼（ponatinib，图1；Molttl公司）；色谱纯级乙腈（德国Merck公司）；色谱纯级甲酸（德国CNW公司）；其它分析纯级试剂均购自中国医药（集团）上海化学试剂公司；实验用纯水由Milli-Q纯水仪制备而成。 仪器
Acquity UPLC液相色谱系统（美国Waters公司）串联API4000 Q-trap型三重四级杆质谱检测器（美国Applied Biosystems公司），配有ESI源、四元梯度泵、自动进样器和数据处理系统；CPA225D分析天平（德国Satroious公司）；Mulrifuge X3R高速冷冻离心机（美国Thermo公司）；V230多管振荡器（美国Fisher公司）；Milli-QTM型超纯水净化器（美国Millipore公司）。
实验动物
SD大鼠，雄性，180～220 g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供。许可证号SCXK（沪）2013～0016。
实验方法
LC/MS检测条件
色谱条件：色谱柱为BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 mm，美国 Waters公司）。流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液，洗脱程序如下：0～0.5 min 流动相A和B的比例为95∶5，0.5～1.0 min线性变至5∶95，1.0～2.2 min维持5∶95，2.2～2.5 min线性恢复至95∶5，2.5～3 min保持95∶5。流速0.3 ml/min，柱温40 ℃，进样量5 ml。
质谱条件：离子源为ESI源，正离子模式检测；毛细管电压5 500 V，离子源温度500 ℃，干燥气10 L/min，雾化气50 psi，碰撞气压力（CAD）为Medium；扫描方式为多反应监测（MRM），用于定量分析的离子对分别为SPH0396，m/z 553.4→453.4，去簇电压（DP）80 V，碰撞能量（CE）30 V；内标ponatinib，m/z 533.3→259.9，DP143 V，CE 30 V。
样品处理方法
大鼠血浆样品50 ml，加入200 ml含内标（ponatinib，0.25 mmol/L）的乙腈沉淀蛋白，涡旋振荡10 min后，于6 000 g离心10 min，取200 ml上清于6 000 g再次离心10 min，取上清50 ml于96孔板中进样，进样量5 ml。
LC/MS方法学验证
标准曲线的配制
精密称取SPH0396粉末5.03 mg，加入90.9 ml的DMSO，配制为100 mmol/L的储备液。再将此储备液用乙腈逐级稀释成浓度为22.14、55.35、166.04、553.46、1 600.38、5 534.60、16 603.80、33 207.60、49 811.40 ng/ml的系列工作液。取95 ml的空白大鼠血浆加入5 ml的上述工作液，配制成浓度为1.11、2.77、8.30、27.67、83.02、276.73、830.19、1 600.38、2 490.57 ng/ml的标准曲线。取50 ml的含药血浆按2.2项下方法处理后进样。
内标液的配制
精密称取ponatinib 2.53 mg，加入47.5 ml的DMSO，配制为100 mmol/L的储备液。取上述储备液2.5 ml，加入1 L乙腈，配制为0.25 mmol/L的内标液。
质控样品的配制
将2.3.1中100 mmol/L的SPH0396储备液用乙腈逐级稀释成浓度为49.81、11 069.20和38 742.20 ng/ml的系列质控工作液。取95 ml的空白大鼠血浆加入5 ml的质控工作液，配制成浓度为2.49、553.46、1 937.11 ng/ml的质控样品。取50 ml的含药血浆按2.2项下方法处理后进样。
大鼠体内实验
SD大鼠16只，雄性，180～220 g。分为4组，每组4只。分别静脉注射3 mg/kg或灌胃给予5、15和50 mg/kg的SPH0396，于给药前和给药后2、5、15、30、60、90、120、240、360、480、600、1 440 min分别于大鼠眼底静脉丛取血0.2 ml。血样于8 000 r/min离心5 min，取血浆于离心管中-20 ℃保存待测。
数据处理方法
SPH0396的血药浓度-时间曲线用Kinetica软件（Version 5.1，美国）的非房室模型进行拟合，得到药代动力学参数。Cmax为实测的最大血药浓度，Tmax为口服给药后血药浓度达峰时间，t1/2为末端消除半衰期，MRT为体内平均滞留时间，血药浓度-时间曲线下面积AUC（0-t）由梯形面积法计算得到，Vdss为稳态时表观分布容积，CL为清除率。绝对生物利用度计算公式如下：
实验结果
方法的专属性
用来自6只大鼠的空白血浆配制标准样品，空白血样、空白血样加标准品和大鼠给药后4 h血样的MRM色谱图见图2。大鼠血浆中的内源性物质不干扰SPH0396和内标ponatinib的测定，SPH0396的保留时间为1.59 min，ponatinib的保留时间为1.95 min，表明方法专属性良好。
标准曲线与线性范围
按2.3.1项下方法配制标准曲线样品并进行测定，以SPH0396样品峰面积比ponatinib内标峰面积（As/Ai）对浓度（C）作图，得到标准曲线方程为y=0.265 7x+0.007 6，相关系数R2=0.999。线性范围为1.11～2 490.57 ng/ml，定量下限为1.11 ng/ml。
精密度和准确度
配制低、中、高3个浓度（2.49、553.46、1 937.11 ng/ml）的SPH0396质控样品各6份，用随行标准曲线计算质控样品测得浓度。以质控样品测得浓度与加样浓度相比计算方法的准确度与精密度（表1）。RSD均小于10%。 大鼠静脉注射SPH0396后的药代动力学
大鼠单次静脉注射3 mg/kg的SPH0396后采集血样，按2.2项下方法处理后进样，测定SPH0396在大鼠血浆中的浓度，采用Kinetica计算药动学参数（表2）。大鼠静脉注射SPH0396后，AUC（0-t）为1 391.08±132.92 h·ng/ml，消除半衰期为3.43±0.37 h，清除率为2.13±0.21 L/h·kg，表观分布容积为6.76±0.26 L/kg。
大鼠灌胃给予SPH0396后的药代动力学
大鼠单次口服5、15和50 mg/kg的SPH0396后的血药浓度-时间曲线见图3。口服SPH0396在大鼠体内吸收较慢，血药浓度在4～6 h才能达到峰值；Cmax分别为45.68±10.97、156.36±15.01和668.42±104.72 ng/ml；AUC（0-t）分别为397.65±15.15、1 779.44±358.00和8 389.82±1 805.81 h·ng/ml。大鼠口服不同剂量的SPH0396，Cmax和AUC（0-t）的增加比例均高于剂量增加比例。相应的大鼠口服不同剂量的SPH0396生物利用度分别为17.15%、25.58%和36.19%。
讨论
SPH0396是一个新结构的抗CML候选化合物。静脉给药后，SPH0396在大鼠体内的消除半衰期较长，表观分布容积大于大鼠总体液量，说明SPH0396在大鼠体内分布较广。大鼠口服不同剂量的SPH0396，Cmax和AUC（0-t）的增加比例均高于剂量增加比例，表明SPH0396在大鼠体内的吸收是非线性的，提示可能有外排转运体参与SPH0396的吸收过程，需要进一步实验加以证实。SPH0396为bosutinib的结构类似物，我们的研究表明，其在大鼠体内的药动学性质接近或优于bosutinib，在激酶和细胞水平的抗肿瘤活性也均接近或优于bosutinib[9-11]，可做为候选化合物进一步开发。
本研究建立并验证了定量测定大鼠血浆中SPH0396的LC-MS/MS方法。该方法的专属性好，灵敏度高，回收率和精密度均符合生物样品的定量分析要求，可用于该化合物在大鼠体内的药代动力学研究。
参考文献
Levitzki A. Tyrosine kinase inhibitors： views of selectivity， sensitivity， and clinical performance[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol， 2013， 53： 161-85.
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（收稿日期：2015-01-16）