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摘要：以巨菌草幼茎作为试验材料，研究不同浓度的防褐化物质对巨菌草组织培养褐化的影响，应用正交测验法研究生长激素2，4-D、KT、IAA不同的浓度对巨菌草愈伤组织诱导的影响。结果表明：最佳防褐化物质是1.0 mg/L PVP；2，4-D对巨菌草幼茎愈伤组织诱导的影响最小，KT居于二者之间，没有达到显著水平，而IAA影响最大，达到了显著水平（P<0.05）；巨菌草诱导愈伤组织的最佳培养基配方是MS 2，4-D 1.0 mg/L IAA 0.2 mg/L KT 1.0 mg/L。
关键词：巨菌草；防褐化；正交测验法；愈伤组织；培养基；激素
中图分类号： S646.904文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0074-03
收稿日期：2014-09-06
基金项目：国家菌草工程技术研究中心开放基金（编号：JCJJ13003）。
作者简介：黄静（1988—），女，山东泗水人，硕士研究生，研究方向为草业育种学。Tel：（0591）83789338；E-mail：[email protected]。
通信作者：郑燕，博士，副教授，从事草业育种学研究。Tel：（0591）83789338；E-mail：[email protected]。巨菌草（Pennisetum sp.）属于单子叶植物禾本科狼尾草属，是一种适宜在热带、亚热带和温带生长的高产优质菌草。其抗逆性强，根系发达，为直立丛生的多年生植物，植株高大，一般为3～5 m，有的也可达到6～8 m[1-2]。巨菌草是典型的C4植物，光合效率很高，是其他阔叶树的4～7.46倍，年产鲜草达200～400 t/hm2[3]。巨菌草原产于南非，1983年引入我国，并由于其巨大的经济价值得到了广泛推广。
巨菌草是一种高产优质的菌草，抗逆性极强，一般不会有病虫害发生，管理简单，利用期长，生长速度快，粗蛋白含量很高，营养价值丰富[3]，可作为生产饲料和保持水土、绿化环境的优良草种[4]，也被用作香菇、灵芝、平菇、猴头菇等的栽培培养料[5]。此外，巨菌草还是能源草的典型草种，可用于生产乙醇等生物燃料。巨菌草种植简单，既可以进行有性繁殖，也可以进行无性繁殖。无性繁殖一般用腋芽进行，有性繁殖用种子，但是发芽率一般都很低[4]。目前，巨菌草在我国南方的种植范围越来越广，由于不耐寒，在北方寒冷的冬季无法自然越冬，使得在北方的推广受到严重限制[6]。
长期以来，巨菌草品种选育方面基本是依靠常规育种的方法，因而无法快速解决巨菌草耐寒性、品质及产量改良等问题。植物基因工程技术是解决品种改良的一种高效手段，而完整的巨菌草组织培养体系是对其进行基因工程遗传改良的前提和技术保障。目前国内尚未见巨菌草组织培养体系构建的报道。本研究拟参考其他禾本科植物如甘蔗、杂交狼尾草、绒毛狼尾草等的组织培养方法，优选巨菌草诱导培养基，为巨菌草品种改良提供试验依据，也为其更大范围的应用和推广提供理论基础。
1材料与方法
1.1材料
试验材料为巨菌草幼茎，由福建农林大学国家菌草工程技术研究中心提供。
1.2方法
1.2.1外植体的准备及消毒选取幼嫩并且生长良好的巨菌草茎秆，用75%乙醇逐层擦拭较老的叶鞘表面并剥除直至所需要材料的前2层，用刀切下茎尖部分，然后置于2%次氯酸钠中消毒10 min，用无菌水冲洗3～ 5次，在无菌滤纸上吸干水分[7]。
1.2.2防止褐化为了防止外植体的褐变，采用组织培养中常用的活性炭（activated carbon，AC）和聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）2种防褐化物质，在相同培养基下添加不同浓度的2种物质，观察对巨菌草出愈率的影响[8]。所用培养基组合如表1所示。
表12种防褐化物质浓度设计
处理编号防褐化物质 浓度（ mg/L）Ⅰ1AC0.1Ⅰ2AC0.2Ⅰ3AC0.3Ⅰ4PVP0.5Ⅰ5PVP1.0Ⅰ6PVP1.5注：基本培养基均为MS 2，4-D 3.0 mg/L。
用手术刀把茎尖分生组织部分切成0.1～ 0.2 cm厚的小薄片，接种于表1中培养基上，每瓶接种6块外植体，3次重复。然后置于26～28 ℃的暗培养箱中培养[9-10]，10 d后比较出愈情况，运用Excel 和统计分析软件DPS进行统计分析。
1.2.3正交测验法筛选最佳诱导培养基配方采用L9（33）正交设计，使用的正交表如表2所示[8]，设置3个影响因子，分别为2，4-D、KT和IAA。基本培养基为MS，3种激素 2，4-D、KT 和IAA各设3个浓度水平，2，4-D浓度为1.0、2.0、3.0 mg/L；KT浓度为0.5、1.0、1.5 mg/L；IAA浓度为 0.1、 0.2、0.3 mg/L[7，9，11-12]。共9个处理，每个处理接种3瓶，每瓶5块外植体，3次生物学重复（时间重复），统计愈伤率，运用Excel 和DPS进行方差分析和差异显著性测验，确定最佳激素组合。
2结果与分析
2.1不同防褐化物质对愈伤组织诱导的影响
从表3可看出，在相同培养基MS 2，4-D 3.0 mg/L下，采用不同浓度的防褐化物质AC与PVP对巨菌草幼茎愈伤组织诱导的效率明显不同。用AC作为防褐化物质时，不同浓度下出愈率虽然有变化，但差异不显著；用PVP作为防2种不同防褐化物质AC与PVP相比，采用PVP比AC产生的出愈率明显更高（表3）。从图1可以看出，巨菌草幼茎在接种10 d后，培养基加入PVP的外植体已经长出一点愈伤组织，而培养基加入AC的外植体还没有长出愈伤组织。特别是采用浓度为1.0 mg/L的PVP产生的出愈率最高，故本研究都采用此浓度。 表3不同防褐化物质对愈伤组织诱导的影响
处理
编号防褐化物质浓度
（ mg/L）出愈率
（%）P0.05P0.01Ⅰ1AC0.12.96cBⅠ2AC0.21.85cBⅠ3AC0.34.81cBⅠ4PVP0.558.52abAⅠ5PVP1.076.30aAⅠ6PVP1.555.93bA注：基本培养基均为MS 2，4-D 3.0 mg/L。
2.2正交测验法筛选最佳诱导培养基配方
生长素和细胞分裂素对植物生长影响很大，其浓度大小是组织培养研究的关键环节，本研究以2，4-D、KT 和IAA 作为巨菌草外植体诱导愈伤组织的主要激素，并运用正交测验法研究了三者不同浓度的组合对外植体诱导愈伤组织的影响[10-11]。
以上述各处理的3次重复数据平均值为结果数据（表4），运用Excel 和DPS进行数据的显著性测验和分析。从方差分析结果（表5）可以看出，IAA对巨菌草幼茎愈伤组织诱导率的影响最大，达到显著水平（P<0.05），2，4-D的影响最小，各因素的影响显著性依次为IAA>KT>2，4-D。从单因素的水平上来看，2，4-D的浓度差异对愈伤组织的诱导影响不明显；而IAA的浓度水平使愈伤组织的诱导率差异达到显著水平，其中IAA的浓度为0.2 mg/L时的诱导率最高；不同浓度的KT对愈伤组织的诱导率差异不显著。
3讨论与结论
褐化是植物组织培养中经常碰到的问题，本试验在未加入防褐化物质前，也发现了大量的褐化现象，这严重影响了愈伤组织的诱导。吸附剂活性炭（AC）和抗氧化剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是高效的防褐化物质[13]。前人研究表明，在甘蔗茎尖诱导培养基中加入0.02
关键词：巨菌草；防褐化；正交测验法；愈伤组织；培养基；激素
中图分类号： S646.904文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0074-03
收稿日期：2014-09-06
基金项目：国家菌草工程技术研究中心开放基金（编号：JCJJ13003）。
作者简介：黄静（1988—），女，山东泗水人，硕士研究生，研究方向为草业育种学。Tel：（0591）83789338；E-mail：[email protected]。
通信作者：郑燕，博士，副教授，从事草业育种学研究。Tel：（0591）83789338；E-mail：[email protected]。巨菌草（Pennisetum sp.）属于单子叶植物禾本科狼尾草属，是一种适宜在热带、亚热带和温带生长的高产优质菌草。其抗逆性强，根系发达，为直立丛生的多年生植物，植株高大，一般为3～5 m，有的也可达到6～8 m[1-2]。巨菌草是典型的C4植物，光合效率很高，是其他阔叶树的4～7.46倍，年产鲜草达200～400 t/hm2[3]。巨菌草原产于南非，1983年引入我国，并由于其巨大的经济价值得到了广泛推广。
巨菌草是一种高产优质的菌草，抗逆性极强，一般不会有病虫害发生，管理简单，利用期长，生长速度快，粗蛋白含量很高，营养价值丰富[3]，可作为生产饲料和保持水土、绿化环境的优良草种[4]，也被用作香菇、灵芝、平菇、猴头菇等的栽培培养料[5]。此外，巨菌草还是能源草的典型草种，可用于生产乙醇等生物燃料。巨菌草种植简单，既可以进行有性繁殖，也可以进行无性繁殖。无性繁殖一般用腋芽进行，有性繁殖用种子，但是发芽率一般都很低[4]。目前，巨菌草在我国南方的种植范围越来越广，由于不耐寒，在北方寒冷的冬季无法自然越冬，使得在北方的推广受到严重限制[6]。
长期以来，巨菌草品种选育方面基本是依靠常规育种的方法，因而无法快速解决巨菌草耐寒性、品质及产量改良等问题。植物基因工程技术是解决品种改良的一种高效手段，而完整的巨菌草组织培养体系是对其进行基因工程遗传改良的前提和技术保障。目前国内尚未见巨菌草组织培养体系构建的报道。本研究拟参考其他禾本科植物如甘蔗、杂交狼尾草、绒毛狼尾草等的组织培养方法，优选巨菌草诱导培养基，为巨菌草品种改良提供试验依据，也为其更大范围的应用和推广提供理论基础。
1材料与方法
1.1材料
试验材料为巨菌草幼茎，由福建农林大学国家菌草工程技术研究中心提供。
1.2方法
1.2.1外植体的准备及消毒选取幼嫩并且生长良好的巨菌草茎秆，用75%乙醇逐层擦拭较老的叶鞘表面并剥除直至所需要材料的前2层，用刀切下茎尖部分，然后置于2%次氯酸钠中消毒10 min，用无菌水冲洗3～ 5次，在无菌滤纸上吸干水分[7]。
1.2.2防止褐化为了防止外植体的褐变，采用组织培养中常用的活性炭（activated carbon，AC）和聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）2种防褐化物质，在相同培养基下添加不同浓度的2种物质，观察对巨菌草出愈率的影响[8]。所用培养基组合如表1所示。
表12种防褐化物质浓度设计
处理编号防褐化物质 浓度（ mg/L）Ⅰ1AC0.1Ⅰ2AC0.2Ⅰ3AC0.3Ⅰ4PVP0.5Ⅰ5PVP1.0Ⅰ6PVP1.5注：基本培养基均为MS 2，4-D 3.0 mg/L。
用手术刀把茎尖分生组织部分切成0.1～ 0.2 cm厚的小薄片，接种于表1中培养基上，每瓶接种6块外植体，3次重复。然后置于26～28 ℃的暗培养箱中培养[9-10]，10 d后比较出愈情况，运用Excel 和统计分析软件DPS进行统计分析。
1.2.3正交测验法筛选最佳诱导培养基配方采用L9（33）正交设计，使用的正交表如表2所示[8]，设置3个影响因子，分别为2，4-D、KT和IAA。基本培养基为MS，3种激素 2，4-D、KT 和IAA各设3个浓度水平，2，4-D浓度为1.0、2.0、3.0 mg/L；KT浓度为0.5、1.0、1.5 mg/L；IAA浓度为 0.1、 0.2、0.3 mg/L[7，9，11-12]。共9个处理，每个处理接种3瓶，每瓶5块外植体，3次生物学重复（时间重复），统计愈伤率，运用Excel 和DPS进行方差分析和差异显著性测验，确定最佳激素组合。
2结果与分析
2.1不同防褐化物质对愈伤组织诱导的影响
从表3可看出，在相同培养基MS 2，4-D 3.0 mg/L下，采用不同浓度的防褐化物质AC与PVP对巨菌草幼茎愈伤组织诱导的效率明显不同。用AC作为防褐化物质时，不同浓度下出愈率虽然有变化，但差异不显著；用PVP作为防2种不同防褐化物质AC与PVP相比，采用PVP比AC产生的出愈率明显更高（表3）。从图1可以看出，巨菌草幼茎在接种10 d后，培养基加入PVP的外植体已经长出一点愈伤组织，而培养基加入AC的外植体还没有长出愈伤组织。特别是采用浓度为1.0 mg/L的PVP产生的出愈率最高，故本研究都采用此浓度。 表3不同防褐化物质对愈伤组织诱导的影响
处理
编号防褐化物质浓度
（ mg/L）出愈率
（%）P0.05P0.01Ⅰ1AC0.12.96cBⅠ2AC0.21.85cBⅠ3AC0.34.81cBⅠ4PVP0.558.52abAⅠ5PVP1.076.30aAⅠ6PVP1.555.93bA注：基本培养基均为MS 2，4-D 3.0 mg/L。
2.2正交测验法筛选最佳诱导培养基配方
生长素和细胞分裂素对植物生长影响很大，其浓度大小是组织培养研究的关键环节，本研究以2，4-D、KT 和IAA 作为巨菌草外植体诱导愈伤组织的主要激素，并运用正交测验法研究了三者不同浓度的组合对外植体诱导愈伤组织的影响[10-11]。
以上述各处理的3次重复数据平均值为结果数据（表4），运用Excel 和DPS进行数据的显著性测验和分析。从方差分析结果（表5）可以看出，IAA对巨菌草幼茎愈伤组织诱导率的影响最大，达到显著水平（P<0.05），2，4-D的影响最小，各因素的影响显著性依次为IAA>KT>2，4-D。从单因素的水平上来看，2，4-D的浓度差异对愈伤组织的诱导影响不明显；而IAA的浓度水平使愈伤组织的诱导率差异达到显著水平，其中IAA的浓度为0.2 mg/L时的诱导率最高；不同浓度的KT对愈伤组织的诱导率差异不显著。
3讨论与结论
褐化是植物组织培养中经常碰到的问题，本试验在未加入防褐化物质前，也发现了大量的褐化现象，这严重影响了愈伤组织的诱导。吸附剂活性炭（AC）和抗氧化剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是高效的防褐化物质[13]。前人研究表明，在甘蔗茎尖诱导培养基中加入0.02