观察人血管内皮生长因子(VEGF)转染后的人脂肪组织来源干细胞(ADSCs)对VEGF蛋白的分泌和表达情况及转染后细胞的成骨活性变化。
方法胶原酶消化脂肪获取人ADSCs,经鉴定后进行培养传代。采用Trizol法获取编码人VEGF成熟肽的基因序列,将获得的目的基因VEGF与含绿色荧光蛋白的双顺反子表达载体连接成重组质粒pSELECT-GFP zeo-VEGF,分别转染第2、3、4、5代ADSCs。荧光显微镜下验证转染结果,酶联免疫(ELISA)检测转染后细胞的VEGF分泌。对第2代转染后的ADSCs于成骨条件下培养,检测上清液中碱性磷酸酶(ALP)和骨钙蛋白(OC)的分泌。
结果脂质体介导的VEGF目的基因片段能够成功转染至体外培养的ADSCs;经ELISA定量检测,上清液中VEGF mRNA表达水平在转染组显著增高,对照组无明显变化。成骨条件培养下于转染后第3、5、7天ELISA检测人VEGF转染组对ALP(29.2±2.4)、(38.0±2.3)、(46.7±2.4)U/L(金氏单位)和OC的分泌量(13.2±1.6)、(18.3±1.6)、(25.3±1.5)μg/L以及实时聚合酶链反应(PCR)检测对ALP(0.1±0.0)、(0.2±0.0)、(0.3±0.0)和OC的分泌量(0.042±0.004)、(0.071±0.008)、(0.127±0.011)均明显高于空载体转染组及空白细胞组(P<0.01)。免疫印迹法检测人VEGF转染组中ALP/GAPD H和OC/GAPDH灰度比值明显高于空载体转染组和空白细胞组(P<0.01)。
结论经脂质体介导可成功将人VEGF目的基因片段转染至人ADSCs,并能够在体外持续有效地表达具有生物学活性的VEGF mRNA;转染后的ADSCs成骨定向分化能力明显增强。