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[摘 要]目的：探究三种中药制剂微生物限度检查方法学验证。方法：通过阳性菌回收率实验来验证抑菌性。结果：祛痰止咳胶囊用培养基稀释法验证、参松养心胶囊运用培养基稀释联合离心沉淀来验证、其对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌及金黄色葡萄球菌具有抑菌作用。结论：3种制剂均存在抑菌作用，但是需要通过不同的验证方法进行检测。
[关键词]微生物限度检查；抑菌；控制菌
中图分类号：TE219 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2017）34-0339-01
在临床中，中药制剂的成分相对较多，部分制剂成分具有明显的抑菌作用，根据《中国药典》[1]需求，需要对中药制剂的微生物限度进行验证，在本次研究中，3种药剂经过灭菌处理，通过药剂的微生物限度檢查方法学进行验证。
1 材料与方法
1.1 材料
3种中药制剂分别为参松养心胶囊、祛痰止咳胶囊以及银杏叶片，每个中药制剂均抽取3个批次，且未添加抗菌剂，培养基采用营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基以及胆盐硫乳琼脂培养基等。试验菌株包括：（1）金黄色葡萄球菌；（2）大肠埃希菌；（3）枯草芽孢杆菌；（4）白色念珠菌；（5）黑曲霉；（6）乙型副伤寒沙门菌。
1.2 检查方法
1.2.1 制备试验菌液
选择金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌以及乙型副伤寒沙门菌。均经过35℃培养，置入无菌生理盐水，10倍稀释，稀释后浓度为50-100cfu/m；对于黑曲霉，保证其在25℃环境下培养，加入5ml生理盐水，将其10倍稀释，稀释后浓度为50-100cfu/m。
1.2.2 检验方法验证
验证方法如下：（1）制作供试液，取样品10g研磨，加入PH为7.0的无菌氯化钠-蛋白胨，制作成为浓度1：10的供试液，另外，将其稀释成为1：100以及1：1000的供试液；（2）常规验证，取1ml的10倍供试液，加入菌株，倾注20ml琼脂培养基，保证凝固24-72h后观察结果。将菌落数计算为试验组。另外，采用同种方式测定实验菌，计为菌液组，将供试品的菌数作为对照组。（3）培养基稀释法。取1ml的10倍供试液，分别加入0.5和0.2ml的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌以及金黄色葡萄球菌，观察统计结果。（4）离心沉淀集菌培养基稀释法，取10ml的10倍供试液，500r/min离心处理，取上清液行3000r/min离心处理，每1ml接种两个平皿，4个为1组，加入枯草芽孢杆菌、白色念珠菌以及金黄色葡萄球菌，统计结果。（5）稀释液对照组，取10ml样本，按照试验组方法，每个菌种制作2个平板。
1.2.3 控制菌检查方法验证
验证方法如下：（1）制备供试液，取样品10g研磨，加入PH为7.0的无菌氯化钠-蛋白胨至100ml，制作成为1：10、1：100以及1：1000的供试液。（2）大肠埃希菌，取胆盐乳糖培养基5份，分别加入1ml大肠埃希菌悬液、10ml的1：10供试液及1ml金黄色葡萄球菌悬液、1：10供试液及大肠埃希菌悬液、10ml的1：10供试液、10ml稀释液。（3）大肠菌群，10ml胆盐乳糖发酵培养基3个，分别加入不同浓度的稀释液，另外取一个作为对照；取3支10ml胆盐乳糖发酵培养基，分别加入不同浓度稀释液，同时加入1ml大肠埃希菌菌液；之后再取3支，加入稀释液和1ml金黄色葡萄球菌。最后取1支加入大肠埃希菌悬液1ml作为阳性对照。
1.2.4 对照菌液验证
对使用期限进行验证，每天行1次培养，时间为7d。
2 结果
2.1 常规方法验证结果
在本次研究中，三种制剂对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌及金黄色葡萄球菌具有抑菌作用，在对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌以及黑曲霉的抑菌作用中，祛痰止咳的抑菌率分别为42.8%，23.9%，85.6%，17.6%以及73.9%。参松养心胶囊的抑菌率分别为3.5%，8.1%，80.9%，15.5%以及92.9%。银杏叶片分别为77.1%，57.9%，88.9%，95.1%以及96.1%。
2.2 培养基稀释法结果
在本次研究中，培养基稀释法可以清除银杏叶片对金黄色葡萄球菌的抑菌行；同时可以消除祛痰止咳胶囊对金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌的抑菌性。但是无法消除参松养心胶囊对菌种的抑菌性。
2.3 离心沉淀法对参松养心胶囊的验证结果
在本次研究中，经过离心沉淀，可以消除参松养心胶囊的抑菌性，参松养心胶囊对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌以及金黄色葡萄球菌的抑菌性分别为79.0%，83.1%以及88.6%。对照组分别为82.0%，88.7%以及91.3%。
2.4 控制菌验证结果
在本次研究中，试剂对阳性菌无抑制性，见表1。
3 讨论
在本次研究中，供试样品对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及大肠埃希菌具有抑菌性，而对于阳性菌的检测，可以采用常规方法啊，其可以有效的降低成本。其主要是由于中药试剂均存在差异性的抑菌作用，常规方法进行检测存在一定的限度，无法确定检查结果，因而容易出现偏差[2]，因此，在检测验证过程中，需要通過不同的处理方式来进行验证，如对于参松养心胶囊运用培养基稀释联合离心沉淀来验证，可以保证验证的准确性[3]。另外，在对阳性菌的验证中发现，三种制剂均对阳性菌无抑制性，可以通过常规方法来进行检测。
总之，3种制剂均存在抑菌作用，但是需要通过不同的验证方法进行检测。以便可以保证验证结果的准确性。但是在本次研究中，由于实验条件以及医师经验可能存在一定的缺陷，导致验证结果可能存在一定的误差，但是总体而言，其仍然具有一定的临床借鉴意义。
参考文献
[1] 施敏，管敏，周琴妹.三种具有抑菌成分的外用制剂的微生物限度检查方法验证[J].安徽医药，2015，（12）：2314-2316.
[2] 杨晓琴，司马义江.阿布都热西提.7种维吾尔医医院制剂微生物限度检查方法学验证[J].中国民族民间医药，2014，（06）：1-2.
[3] 李晓东，李娟，郭朝晖，等.几种医院外用中药制剂微生物限度检查方法的建立[J].西部中医药，2012，（02）：25-27.
[关键词]微生物限度检查；抑菌；控制菌
中图分类号：TE219 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2017）34-0339-01
在临床中，中药制剂的成分相对较多，部分制剂成分具有明显的抑菌作用，根据《中国药典》[1]需求，需要对中药制剂的微生物限度进行验证，在本次研究中，3种药剂经过灭菌处理，通过药剂的微生物限度檢查方法学进行验证。
1 材料与方法
1.1 材料
3种中药制剂分别为参松养心胶囊、祛痰止咳胶囊以及银杏叶片，每个中药制剂均抽取3个批次，且未添加抗菌剂，培养基采用营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基以及胆盐硫乳琼脂培养基等。试验菌株包括：（1）金黄色葡萄球菌；（2）大肠埃希菌；（3）枯草芽孢杆菌；（4）白色念珠菌；（5）黑曲霉；（6）乙型副伤寒沙门菌。
1.2 检查方法
1.2.1 制备试验菌液
选择金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌以及乙型副伤寒沙门菌。均经过35℃培养，置入无菌生理盐水，10倍稀释，稀释后浓度为50-100cfu/m；对于黑曲霉，保证其在25℃环境下培养，加入5ml生理盐水，将其10倍稀释，稀释后浓度为50-100cfu/m。
1.2.2 检验方法验证
验证方法如下：（1）制作供试液，取样品10g研磨，加入PH为7.0的无菌氯化钠-蛋白胨，制作成为浓度1：10的供试液，另外，将其稀释成为1：100以及1：1000的供试液；（2）常规验证，取1ml的10倍供试液，加入菌株，倾注20ml琼脂培养基，保证凝固24-72h后观察结果。将菌落数计算为试验组。另外，采用同种方式测定实验菌，计为菌液组，将供试品的菌数作为对照组。（3）培养基稀释法。取1ml的10倍供试液，分别加入0.5和0.2ml的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌以及金黄色葡萄球菌，观察统计结果。（4）离心沉淀集菌培养基稀释法，取10ml的10倍供试液，500r/min离心处理，取上清液行3000r/min离心处理，每1ml接种两个平皿，4个为1组，加入枯草芽孢杆菌、白色念珠菌以及金黄色葡萄球菌，统计结果。（5）稀释液对照组，取10ml样本，按照试验组方法，每个菌种制作2个平板。
1.2.3 控制菌检查方法验证
验证方法如下：（1）制备供试液，取样品10g研磨，加入PH为7.0的无菌氯化钠-蛋白胨至100ml，制作成为1：10、1：100以及1：1000的供试液。（2）大肠埃希菌，取胆盐乳糖培养基5份，分别加入1ml大肠埃希菌悬液、10ml的1：10供试液及1ml金黄色葡萄球菌悬液、1：10供试液及大肠埃希菌悬液、10ml的1：10供试液、10ml稀释液。（3）大肠菌群，10ml胆盐乳糖发酵培养基3个，分别加入不同浓度的稀释液，另外取一个作为对照；取3支10ml胆盐乳糖发酵培养基，分别加入不同浓度稀释液，同时加入1ml大肠埃希菌菌液；之后再取3支，加入稀释液和1ml金黄色葡萄球菌。最后取1支加入大肠埃希菌悬液1ml作为阳性对照。
1.2.4 对照菌液验证
对使用期限进行验证，每天行1次培养，时间为7d。
2 结果
2.1 常规方法验证结果
在本次研究中，三种制剂对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌及金黄色葡萄球菌具有抑菌作用，在对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌以及黑曲霉的抑菌作用中，祛痰止咳的抑菌率分别为42.8%，23.9%，85.6%，17.6%以及73.9%。参松养心胶囊的抑菌率分别为3.5%，8.1%，80.9%，15.5%以及92.9%。银杏叶片分别为77.1%，57.9%，88.9%，95.1%以及96.1%。
2.2 培养基稀释法结果
在本次研究中，培养基稀释法可以清除银杏叶片对金黄色葡萄球菌的抑菌行；同时可以消除祛痰止咳胶囊对金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌的抑菌性。但是无法消除参松养心胶囊对菌种的抑菌性。
2.3 离心沉淀法对参松养心胶囊的验证结果
在本次研究中，经过离心沉淀，可以消除参松养心胶囊的抑菌性，参松养心胶囊对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌以及金黄色葡萄球菌的抑菌性分别为79.0%，83.1%以及88.6%。对照组分别为82.0%，88.7%以及91.3%。
2.4 控制菌验证结果
在本次研究中，试剂对阳性菌无抑制性，见表1。
3 讨论
在本次研究中，供试样品对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及大肠埃希菌具有抑菌性，而对于阳性菌的检测，可以采用常规方法啊，其可以有效的降低成本。其主要是由于中药试剂均存在差异性的抑菌作用，常规方法进行检测存在一定的限度，无法确定检查结果，因而容易出现偏差[2]，因此，在检测验证过程中，需要通過不同的处理方式来进行验证，如对于参松养心胶囊运用培养基稀释联合离心沉淀来验证，可以保证验证的准确性[3]。另外，在对阳性菌的验证中发现，三种制剂均对阳性菌无抑制性，可以通过常规方法来进行检测。
总之，3种制剂均存在抑菌作用，但是需要通过不同的验证方法进行检测。以便可以保证验证结果的准确性。但是在本次研究中，由于实验条件以及医师经验可能存在一定的缺陷，导致验证结果可能存在一定的误差，但是总体而言，其仍然具有一定的临床借鉴意义。
参考文献
[1] 施敏，管敏，周琴妹.三种具有抑菌成分的外用制剂的微生物限度检查方法验证[J].安徽医药，2015，（12）：2314-2316.
[2] 杨晓琴，司马义江.阿布都热西提.7种维吾尔医医院制剂微生物限度检查方法学验证[J].中国民族民间医药，2014，（06）：1-2.
[3] 李晓东，李娟，郭朝晖，等.几种医院外用中药制剂微生物限度检查方法的建立[J].西部中医药，2012，（02）：25-27.