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关键词氟唑菌酰羟胺;超高效液相色谱一串联质谱;麦穗;消解
氟唑菌酰羟胺是瑞士先正达公司开发的新型杀菌剂，为琥珀酸脱氢酶抑制剂，其分子式为C16H16Cl3F2N302，分子量为426.67。该药剂主要通过影响病原菌的呼吸链电子传导系统，阻碍其能量代谢，从而抑制病原菌的生长，具有广谱、高效的特点，适用于多种作物。
据报道氟唑菌酰羟胺对小麦赤霉病菌具有较高的活性，并具有提高小麦产量的作用。近年来，氟唑菌酰羟胺陆续在美国、加拿大、阿根廷等国家登记上市。美国环境保护署规定，氟唑菌酰羟胺在小麦中的最大残留限量标准为0.3μg/g。由于该药剂在国内刚刚登记上市，目前暂未规定其最大残留限量和检测方法。氟唑菌酰羟胺悬浮液的高效液相色谱分析方法及其在西瓜中的残留动态已有报道，但其在小麦中的残留分析暂无报道。
本文引入超声辅助提取技术提取扬花期和收获期麦穗中氟唑菌酰羟胺，并建立其UPLC-MS/MS分析方法，研究氟唑菌酰羟胺在麦穗中的消解动态，掌握其消解规律，为小麦安全生产提供一定的理论基础。
1材料与方法
1.1仪器和试剂
三重四级杆串联液相质谱联用仪（Agilent1290，ABsciex 4500），安捷伦科技有限公司;XPl05DR型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司;AWL-020I-P超纯水系统，艾科浦仪器有限公司;KQ_250E型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司;H2050R型医用离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。
甲醇和乙腈（色谱纯，美国默克公司），甲酸铵（≥98%，德国CNW公司），质谱用水为屈臣氏蒸馏水，氟唑菌酰羟胺（≥98%）标准样品和20%氟唑苯酰羟胺悬浮剂（SC）购自先正达生物科技有限公司。
1.2田间试验
试验于2017年和2018年4月中旬在江苏省句容市镇江农业科学院行香园区试验田进行，小麦品种为‘镇麦13’，试验地水、肥条件良好，常规田间管理。
采用20%氟唑菌酰羟胺SC按照推荐用量8g/667m2（有效成分）分别施药1次和2次。首次施药时间为扬花初期。2次施药的问隔期为7d。每处理3次重复，随机区组排列。小区面积20m2，小区问设保护行，以清水处理作为空白对照。分别于施药后1h及1、3、5、7、10、15、14、20、25、30d按照对角线5点取样法取样，每点取麦穗10株，麦穗在40℃下烘干粉碎后于-20℃保存，待测。
1.3样品分析方法建立
液相色谱柱为Agilent C18色谱柱（100mm×2.1mm，1.7μm）。流动相为含0.1%甲酸的5mmol/L甲酸铵溶液（A）一甲醇（B），75%甲醇等度洗脱10min。流速为200μL/min，柱温40℃;进样量1μL。
质谱检测条件：正离子模式（ESI ），检测方式为多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM），气帘气：35 psi;噴雾电压：5 500 V;雾化温度：450℃;雾化气：40 psi;辅助气：40 psi;其他MRM参数见表1。
1.4样品提取方式和提取条件的优化
以2017年施药1次麦穗样品为材料进行提取方式和条件的优化。分别取施药后10 d（扬花期）和施药后30d（收获期）麦穗样品，冷冻干燥粉碎后准确称取1g，加入20mL乙腈，在室温条件下，分别采用振荡和超声破碎两种方式提取30min，比较两种提取方式下氟唑菌酰羟胺的提取量，选择最优提取方式进一步对提取条件进行优化。
乙腈浓度筛选：在30℃条件下，按液固比100 mL/g，乙腈浓度分别在0、20%、40%、60%、80%和100%的条件下超声提取15 min，检测氟唑菌酰羟胺的提取量;液固比筛选：采用最适宜的乙腈浓度，在30℃条件下，分别采用液固比10、25、50、100 mL/g和200mL/g超声提取15min，检测氟唑菌酰羟胺的提取量;温度筛选：采用最适宜的乙腈浓度和液固比，分别在30、40、50、60。C和70℃条件下超声提取15min，检测氟唑菌酰羟胺的提取量。
1.5样品前处理
采用优化的条件提取不同时问采集的麦穗样品中的氟唑菌酰羟胺，以及收获的麦穗经人工脱壳并粉碎后获得的麦粒样品中的氟唑菌酰羟胺。
2结果与分析
2.1 LC-MS方法的建立
用50%乙腈溶液溶解标样，考察氟唑菌酰羟胺特征峰在正、负离子扫描模式下的电离强度，发现正离子扫描模式下的电离强度明显高于负离子模式。以[M H] 作为母离子进行子离子扫描分析，选择丰度较大的2个离子作为特征碎片离子，如图1所示，根据特征碎片离子对去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）等参数进行优化，使得离子对的信号最强。
采用UPLC常用的C18色谱柱，考察了以5mmol/L甲酸铵为水相，分别以甲醇和乙腈为有机相时的色谱分离情况。发现以甲醇为有机相时响应值较高，基线平稳，水相中加入0.1%的甲酸，响应值提高l倍。经过反复试验，可在5min内获得良好的分离效果。图1和图2分别为50ng/mL氟唑菌酰羟胺标准溶液的质谱扫描图和MRM色谱图。
氟唑菌酰羟胺标样在0.05～50 ng/mL浓度范围内标准曲线为y=35 654w 26 164.89，R2=0.998 77，在此范围内，本试验建立的方法的检出限为0.03ng/mL，定量限为0.15ng/mL。
2.2样品前处理方式和条件优化
试验首次施药时小麦处于扬花期，试验过程麦穗从绿逐渐变黄。扬花期麦穗主要基质以叶绿素为主，收获期麦穗主要基质为淀粉、糖、蛋白质等。基质不同，提取条件可能存在差异，因此分别针对扬花期和收获期麦穗进行提取条件优化。 2.2.1提取方式的优化
图3为超声和振荡两种提取方式对氟唑菌酰羟胺提取量的影响，扬花期和收获期氟唑菌酰羟胺提取量均在提取15 min时达到较高水平。扬花期样品超声处理后，最大提取量从振荡提取的1.69μg/g提高至2.28μg/g;收获期样品从振荡提取的0.68μg/g提高至0.85μg/g，说明超声条件更有利于氟唑菌酰羟胺的溶出，由于超声波辐射可产生破碎、混合搅拌、空化作用等多级效应，从而使分子运动速度和频率加快，使物料内部组织和结构崩溃，从而促进了氟唑菌酰羟胺溶出。
2.2.2超声提取条件的优化
从图4可知，乙腈浓度对氟唑菌酰羟胺提取量有明显影响，乙腈浓度在40%～80%之间时提取效果较好，其中浓度为60%时，扬花期和收获期样品的提出量均为较高，且维持在稳定水平，分别为3.34μg/g和1.12μg/g，当乙腈浓度超过80%，氟唑菌酰羟胺的提取量明显下降，这可能是由于氟唑菌酰羟胺为非极性化合物，当乙腈溶液浓度低时溶液极性相对较大，不利于氟唑菌酰羟胺的溶出，适量水的溶胀作用可以促进氟唑菌酰羟胺的溶出，而当乙腈浓度过大，水的溶胀作用减弱，使氟唑菌酰羟胺提取量下降。温度和液固比对氟唑菌酰羟胺提取量无明显影响。
2.3回收率和标准偏差
在空白样品中分别添加4个浓度水平的标准品溶液进行提取，标准溶液采用60%的乙腈配制而成，每个浓度平行测定3次，在液固比为20 mL/g的条件下，超声破碎15min。由表2可知，扬花期样品平均回收率为80.3%～115.8%，相对标准偏差为2.4%～10.5%;收获期样品平均回收率为99.8%～109.6%，相对标准偏差为3.6%～8.5%，揚花期和收获期样品均符合检测要求。
2.4氟唑菌酰羟胺消解动态
20%氟唑菌酰羟胺SC以8 g/667 m2的用量于2017年和2018年连续两年在麦穗上施用，施药1次的原始积累量分别为37.4μg/g和47.2μg/g，施药2次的原始积累量分别为60.4μg/g和89.0μg/g。氟唑菌酰羟胺在麦穗上的残留动态如图5所示。在麦穗上的消解率与时间的关系符合一级动力学模型，施药1次的半衰期约为3.2 d，施药2次的半衰期为3.49～4.35 d，不同年份对氟唑菌酰羟胺消解半衰期无明显影响。
收获的麦穗中，2017年和2018年施药1次氟唑菌酰羟胺含量分别为0.98μg/g和0.62μg/g，施药2次分别为2.66μg/g和0.89μg/g，而2年试验收获的麦穗脱壳后，麦粒中氟唑菌酰羟胺含量均约为0.12μg/g，说明氟唑菌酰羟胺大部分集中于麦穗表皮，本试验收获的麦粒中氟唑菌酰羟胺含量均未超过美国规定的最大残留限量。
3结论
本文采用超声提取，对提取溶剂、温度、液固比3个主要提取条件进行优化，建立了氟唑菌酰羟胺在麦穗中的液相色谱串联质谱分析方法，该方法适合不同时期麦穗中氟唑菌酰羟胺的提取和检测，方法的灵敏度、准确度和回收率均符合农药残留检测要求。2017年和2018年两年在江苏句容消解动态试验表明，氟唑菌酰羟胺在麦穗中消解速率较快，属于易降解农药（T1/z
氟唑菌酰羟胺是瑞士先正达公司开发的新型杀菌剂，为琥珀酸脱氢酶抑制剂，其分子式为C16H16Cl3F2N302，分子量为426.67。该药剂主要通过影响病原菌的呼吸链电子传导系统，阻碍其能量代谢，从而抑制病原菌的生长，具有广谱、高效的特点，适用于多种作物。
据报道氟唑菌酰羟胺对小麦赤霉病菌具有较高的活性，并具有提高小麦产量的作用。近年来，氟唑菌酰羟胺陆续在美国、加拿大、阿根廷等国家登记上市。美国环境保护署规定，氟唑菌酰羟胺在小麦中的最大残留限量标准为0.3μg/g。由于该药剂在国内刚刚登记上市，目前暂未规定其最大残留限量和检测方法。氟唑菌酰羟胺悬浮液的高效液相色谱分析方法及其在西瓜中的残留动态已有报道，但其在小麦中的残留分析暂无报道。
本文引入超声辅助提取技术提取扬花期和收获期麦穗中氟唑菌酰羟胺，并建立其UPLC-MS/MS分析方法，研究氟唑菌酰羟胺在麦穗中的消解动态，掌握其消解规律，为小麦安全生产提供一定的理论基础。
1材料与方法
1.1仪器和试剂
三重四级杆串联液相质谱联用仪（Agilent1290，ABsciex 4500），安捷伦科技有限公司;XPl05DR型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司;AWL-020I-P超纯水系统，艾科浦仪器有限公司;KQ_250E型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司;H2050R型医用离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。
甲醇和乙腈（色谱纯，美国默克公司），甲酸铵（≥98%，德国CNW公司），质谱用水为屈臣氏蒸馏水，氟唑菌酰羟胺（≥98%）标准样品和20%氟唑苯酰羟胺悬浮剂（SC）购自先正达生物科技有限公司。
1.2田间试验
试验于2017年和2018年4月中旬在江苏省句容市镇江农业科学院行香园区试验田进行，小麦品种为‘镇麦13’，试验地水、肥条件良好，常规田间管理。
采用20%氟唑菌酰羟胺SC按照推荐用量8g/667m2（有效成分）分别施药1次和2次。首次施药时间为扬花初期。2次施药的问隔期为7d。每处理3次重复，随机区组排列。小区面积20m2，小区问设保护行，以清水处理作为空白对照。分别于施药后1h及1、3、5、7、10、15、14、20、25、30d按照对角线5点取样法取样，每点取麦穗10株，麦穗在40℃下烘干粉碎后于-20℃保存，待测。
1.3样品分析方法建立
液相色谱柱为Agilent C18色谱柱（100mm×2.1mm，1.7μm）。流动相为含0.1%甲酸的5mmol/L甲酸铵溶液（A）一甲醇（B），75%甲醇等度洗脱10min。流速为200μL/min，柱温40℃;进样量1μL。
质谱检测条件：正离子模式（ESI ），检测方式为多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM），气帘气：35 psi;噴雾电压：5 500 V;雾化温度：450℃;雾化气：40 psi;辅助气：40 psi;其他MRM参数见表1。
1.4样品提取方式和提取条件的优化
以2017年施药1次麦穗样品为材料进行提取方式和条件的优化。分别取施药后10 d（扬花期）和施药后30d（收获期）麦穗样品，冷冻干燥粉碎后准确称取1g，加入20mL乙腈，在室温条件下，分别采用振荡和超声破碎两种方式提取30min，比较两种提取方式下氟唑菌酰羟胺的提取量，选择最优提取方式进一步对提取条件进行优化。
乙腈浓度筛选：在30℃条件下，按液固比100 mL/g，乙腈浓度分别在0、20%、40%、60%、80%和100%的条件下超声提取15 min，检测氟唑菌酰羟胺的提取量;液固比筛选：采用最适宜的乙腈浓度，在30℃条件下，分别采用液固比10、25、50、100 mL/g和200mL/g超声提取15min，检测氟唑菌酰羟胺的提取量;温度筛选：采用最适宜的乙腈浓度和液固比，分别在30、40、50、60。C和70℃条件下超声提取15min，检测氟唑菌酰羟胺的提取量。
1.5样品前处理
采用优化的条件提取不同时问采集的麦穗样品中的氟唑菌酰羟胺，以及收获的麦穗经人工脱壳并粉碎后获得的麦粒样品中的氟唑菌酰羟胺。
2结果与分析
2.1 LC-MS方法的建立
用50%乙腈溶液溶解标样，考察氟唑菌酰羟胺特征峰在正、负离子扫描模式下的电离强度，发现正离子扫描模式下的电离强度明显高于负离子模式。以[M H] 作为母离子进行子离子扫描分析，选择丰度较大的2个离子作为特征碎片离子，如图1所示，根据特征碎片离子对去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）等参数进行优化，使得离子对的信号最强。
采用UPLC常用的C18色谱柱，考察了以5mmol/L甲酸铵为水相，分别以甲醇和乙腈为有机相时的色谱分离情况。发现以甲醇为有机相时响应值较高，基线平稳，水相中加入0.1%的甲酸，响应值提高l倍。经过反复试验，可在5min内获得良好的分离效果。图1和图2分别为50ng/mL氟唑菌酰羟胺标准溶液的质谱扫描图和MRM色谱图。
氟唑菌酰羟胺标样在0.05～50 ng/mL浓度范围内标准曲线为y=35 654w 26 164.89，R2=0.998 77，在此范围内，本试验建立的方法的检出限为0.03ng/mL，定量限为0.15ng/mL。
2.2样品前处理方式和条件优化
试验首次施药时小麦处于扬花期，试验过程麦穗从绿逐渐变黄。扬花期麦穗主要基质以叶绿素为主，收获期麦穗主要基质为淀粉、糖、蛋白质等。基质不同，提取条件可能存在差异，因此分别针对扬花期和收获期麦穗进行提取条件优化。 2.2.1提取方式的优化
图3为超声和振荡两种提取方式对氟唑菌酰羟胺提取量的影响，扬花期和收获期氟唑菌酰羟胺提取量均在提取15 min时达到较高水平。扬花期样品超声处理后，最大提取量从振荡提取的1.69μg/g提高至2.28μg/g;收获期样品从振荡提取的0.68μg/g提高至0.85μg/g，说明超声条件更有利于氟唑菌酰羟胺的溶出，由于超声波辐射可产生破碎、混合搅拌、空化作用等多级效应，从而使分子运动速度和频率加快，使物料内部组织和结构崩溃，从而促进了氟唑菌酰羟胺溶出。
2.2.2超声提取条件的优化
从图4可知，乙腈浓度对氟唑菌酰羟胺提取量有明显影响，乙腈浓度在40%～80%之间时提取效果较好，其中浓度为60%时，扬花期和收获期样品的提出量均为较高，且维持在稳定水平，分别为3.34μg/g和1.12μg/g，当乙腈浓度超过80%，氟唑菌酰羟胺的提取量明显下降，这可能是由于氟唑菌酰羟胺为非极性化合物，当乙腈溶液浓度低时溶液极性相对较大，不利于氟唑菌酰羟胺的溶出，适量水的溶胀作用可以促进氟唑菌酰羟胺的溶出，而当乙腈浓度过大，水的溶胀作用减弱，使氟唑菌酰羟胺提取量下降。温度和液固比对氟唑菌酰羟胺提取量无明显影响。
2.3回收率和标准偏差
在空白样品中分别添加4个浓度水平的标准品溶液进行提取，标准溶液采用60%的乙腈配制而成，每个浓度平行测定3次，在液固比为20 mL/g的条件下，超声破碎15min。由表2可知，扬花期样品平均回收率为80.3%～115.8%，相对标准偏差为2.4%～10.5%;收获期样品平均回收率为99.8%～109.6%，相对标准偏差为3.6%～8.5%，揚花期和收获期样品均符合检测要求。
2.4氟唑菌酰羟胺消解动态
20%氟唑菌酰羟胺SC以8 g/667 m2的用量于2017年和2018年连续两年在麦穗上施用，施药1次的原始积累量分别为37.4μg/g和47.2μg/g，施药2次的原始积累量分别为60.4μg/g和89.0μg/g。氟唑菌酰羟胺在麦穗上的残留动态如图5所示。在麦穗上的消解率与时间的关系符合一级动力学模型，施药1次的半衰期约为3.2 d，施药2次的半衰期为3.49～4.35 d，不同年份对氟唑菌酰羟胺消解半衰期无明显影响。
收获的麦穗中，2017年和2018年施药1次氟唑菌酰羟胺含量分别为0.98μg/g和0.62μg/g，施药2次分别为2.66μg/g和0.89μg/g，而2年试验收获的麦穗脱壳后，麦粒中氟唑菌酰羟胺含量均约为0.12μg/g，说明氟唑菌酰羟胺大部分集中于麦穗表皮，本试验收获的麦粒中氟唑菌酰羟胺含量均未超过美国规定的最大残留限量。
3结论
本文采用超声提取，对提取溶剂、温度、液固比3个主要提取条件进行优化，建立了氟唑菌酰羟胺在麦穗中的液相色谱串联质谱分析方法，该方法适合不同时期麦穗中氟唑菌酰羟胺的提取和检测，方法的灵敏度、准确度和回收率均符合农药残留检测要求。2017年和2018年两年在江苏句容消解动态试验表明，氟唑菌酰羟胺在麦穗中消解速率较快，属于易降解农药（T1/z