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摘 要： 目的 对羟基喜树碱的凍干工艺进行研究，探讨包被材料对其溶出度、药动和药效的影响。方法 以环糊精作为包被材料，使用冻干机冻成粉针，HPLC法测定药物含量，使用大鼠做药动研究，肿瘤细胞做体外药效研究。结果 使用环糊精包被后使羟基喜树碱在水中的溶解度提高了120倍，主药经5min完全溶出，经过包被冻干提高了主药的生物利用度，药效明显提高。结论 环糊精能提高羟基喜树碱在水中的溶解度，冻干粉针溶出快，生物利用度高，药效增强。
关键词： 羟基喜树碱；环糊精；冻干；工艺研究
喜树碱是从中国特有的植物—喜树中提取的一种生物碱，羟基喜树碱是喜树碱的天然衍生物，具有广谱抗肿瘤活性，在肺癌、直肠癌、乳腺癌等各种临床癌症上都表现出抗肿瘤活性[1-3]。羟基喜树碱在水中溶解度低，稳定性差，易分解，限制了其临床应用。为了提高该药的临床应用，本研究以临床上有广泛应用，且具有水中溶解度高、安全稳定、耐碱、光和热等良好性质的环糊精为包被材料，开发了一种羟基喜树碱冻干粉针的制备方法，并对其溶出度、生物利用度、药效和药动进行了研究。
1材料与方法
1.1 材料
羟基喜树碱（CAS编号：19685-09-7，纯度：99.5%以上，供应商：四川南部诚信科技有限公司）。
环糊精（CAS编号：7585-39-9，纯度：99%以上，供应商：山东汇益科技有限公司）。
DMEM/F12培养基（货号：D9785-lkg，供应商：sigma公司）
高效液相色谱仪（型号：Ultimate 3000 SD HPLC，Thermo Fisher scientific）
冻干机（型号：VS-801FDP，无锡沃信仪器制造有限公司）
大鼠（性别：雄性，体重：180±20g，上海实验动物中心）
细胞（American type culture collection）
1.2 方法
1.2.1 包被物的制备
精确称量10g环糊精，转移至100ml烧杯内，加入20ml pH值为5.0的PBS缓冲液溶解，加入过量的羟基喜树碱，避光搅拌2～3h，加热45℃促进包被，过滤后加入赋形物，按照常规冻干工艺冻干成粉末，备用。
1.2.2 溶出
调整溶出仪转速70rpm，温度37℃，将1mg原料药和等量的包被物加入至800ml溶出介质中，定时取样，HPLC法测定药品含量。
1.2.3 药动实验
大鼠眼球取血，12000rpm离心3min，分离血浆，加入预冷的乙腈甲醇混合物，12000rpm离心3min，取上清，HPLC法测羟基喜树碱含量。
1.2.4 药效学研究
肿瘤细胞经贴壁传代培养后，胰酶消化，按照5～6×103接种96孔板，静置过夜培养，加入不同浓度的药物继续培养，在不同时间段分别加入MTT，培养5h，每孔加入适量DMSO，酶标仪震荡5min，490nm测定吸光度，计算IC50。
1.3 统计学分析
使用统计学软件SPSS16.0对药动数据进行分析，以平均值±标准差表示，行t检验，以p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 包被工艺
经过单因素考察，最终确定包被温度45℃，搅拌时间2h，溶液pH值为4.8，配制成的内酯型水溶液在水中的溶解度为0.492mg/ml，比原料药在水中溶解度提高近120倍。
2.2 溶出度
经环糊精包被后，在介质的经5min完全溶出，而原料药经1和溶出度仅达到90%溶出。
2.3 药动学研究
药物回收率介于98.22～113.54%，日内和日间精密度均小于5%。通过对药代动力学参数研究发现，环糊精包被的羟基喜树碱的半衰期、药时曲线下面积均显著优于对照的原料药，说明环糊精包被能提升主药的生物利用度。
2.4 肿瘤细胞药效学研究
经细胞毒性研究发现，经环糊精包被的羟基喜树碱的IC50值显著低于羟基喜树碱溶液的树脂。
3 讨论
羟基喜树碱具有广谱抗肿瘤活性，但由于水中溶解度低，限制了其临床研究，如何提高其水中溶解度，一直是临床研究的重点。郭宏红[4]将羟基喜树碱用聚电解质铁和硫酸葡聚糖包裹成微胶囊，起到缓释作用，提升了体内的半衰期和生物利用度。使用优化的碱溶梯度酸联合高压均质技术制备纳米晶[5-9]，体外研究表明能显著抑制肿瘤细胞的活性，体内研究表明，显著提高血浆半衰期，且与市售注射剂相比，抑瘤效果更好。在本研究中，以环糊精为包被剂，研究制备工艺，经溶出试验可见，在水中的溶解度提高了120倍，主药经5min完全溶出，经过包被冻干提高了主药的生物利用度，药效明显提高。本研究结果与郭宏红和杨晓凤的研究结果基本一致。
本研究通过对羟基喜树碱小试包被工艺、溶出度、体内和体外研究，初步获得了较为理想的效果，为进一步的工艺放大提供了借鉴。
参考文献
[1] Liu Z， Zheng Q， Chen W， et al. Chemosensitizing effect of Paris Saponin I on Camptothecin and 10-hydroxycamptothecin in lung cancer cells via p38 MAPK， ERK， and Akt signaling pathways[J]. European Journal of Medicinal Chemistry， 2017， 125：760-769.
[2] Lin Q， Ma L， Wang D， et al. A novel Camptothecin analogue inhibits colon cancer development and downregulates the expression of miR-155 in vivo and in vitro[J]. Translational Cancer Research， 2017， 6（3）：511-520.
[3] Gao Y， Zhang W， Sun T， et al. Local transdermal delivery of 10，11-methylenedioxycamptothecin by nanoemulsion for breast cancer prevention[J]. Journal of Controlled Release， 2017， 259：e180-e181.
[4] 郭宏红. 羟基喜树碱微胶囊药代动力学研究[D]. 东北林业大学， 2011.
[5] 杨晓凤. 羟基喜树碱纳米晶的制备和体内外研究[D]. 北京协和医学院中国医学科学院， 北京协和医学院， 中国医学科学院， 清华大学医学部， 2016.
[6] 王珏. 冻干粉针剂无菌工艺模拟试验研究[J]. 工业， 2017（3）：00017-00017.
[7] 袁海建， 安益强， 王卉，等. 银杏内酯B冻干粉针处方和冻干工艺的研究[J]. 中成药， 2015， 37（7）：1600-1602.
[8] 宋艳艳. 一种注射用替加环素冻干粉针药学研究及其初步安全性评价[D]. 吉林大学， 2017.
关键词： 羟基喜树碱；环糊精；冻干；工艺研究
喜树碱是从中国特有的植物—喜树中提取的一种生物碱，羟基喜树碱是喜树碱的天然衍生物，具有广谱抗肿瘤活性，在肺癌、直肠癌、乳腺癌等各种临床癌症上都表现出抗肿瘤活性[1-3]。羟基喜树碱在水中溶解度低，稳定性差，易分解，限制了其临床应用。为了提高该药的临床应用，本研究以临床上有广泛应用，且具有水中溶解度高、安全稳定、耐碱、光和热等良好性质的环糊精为包被材料，开发了一种羟基喜树碱冻干粉针的制备方法，并对其溶出度、生物利用度、药效和药动进行了研究。
1材料与方法
1.1 材料
羟基喜树碱（CAS编号：19685-09-7，纯度：99.5%以上，供应商：四川南部诚信科技有限公司）。
环糊精（CAS编号：7585-39-9，纯度：99%以上，供应商：山东汇益科技有限公司）。
DMEM/F12培养基（货号：D9785-lkg，供应商：sigma公司）
高效液相色谱仪（型号：Ultimate 3000 SD HPLC，Thermo Fisher scientific）
冻干机（型号：VS-801FDP，无锡沃信仪器制造有限公司）
大鼠（性别：雄性，体重：180±20g，上海实验动物中心）
细胞（American type culture collection）
1.2 方法
1.2.1 包被物的制备
精确称量10g环糊精，转移至100ml烧杯内，加入20ml pH值为5.0的PBS缓冲液溶解，加入过量的羟基喜树碱，避光搅拌2～3h，加热45℃促进包被，过滤后加入赋形物，按照常规冻干工艺冻干成粉末，备用。
1.2.2 溶出
调整溶出仪转速70rpm，温度37℃，将1mg原料药和等量的包被物加入至800ml溶出介质中，定时取样，HPLC法测定药品含量。
1.2.3 药动实验
大鼠眼球取血，12000rpm离心3min，分离血浆，加入预冷的乙腈甲醇混合物，12000rpm离心3min，取上清，HPLC法测羟基喜树碱含量。
1.2.4 药效学研究
肿瘤细胞经贴壁传代培养后，胰酶消化，按照5～6×103接种96孔板，静置过夜培养，加入不同浓度的药物继续培养，在不同时间段分别加入MTT，培养5h，每孔加入适量DMSO，酶标仪震荡5min，490nm测定吸光度，计算IC50。
1.3 统计学分析
使用统计学软件SPSS16.0对药动数据进行分析，以平均值±标准差表示，行t检验，以p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 包被工艺
经过单因素考察，最终确定包被温度45℃，搅拌时间2h，溶液pH值为4.8，配制成的内酯型水溶液在水中的溶解度为0.492mg/ml，比原料药在水中溶解度提高近120倍。
2.2 溶出度
经环糊精包被后，在介质的经5min完全溶出，而原料药经1和溶出度仅达到90%溶出。
2.3 药动学研究
药物回收率介于98.22～113.54%，日内和日间精密度均小于5%。通过对药代动力学参数研究发现，环糊精包被的羟基喜树碱的半衰期、药时曲线下面积均显著优于对照的原料药，说明环糊精包被能提升主药的生物利用度。
2.4 肿瘤细胞药效学研究
经细胞毒性研究发现，经环糊精包被的羟基喜树碱的IC50值显著低于羟基喜树碱溶液的树脂。
3 讨论
羟基喜树碱具有广谱抗肿瘤活性，但由于水中溶解度低，限制了其临床研究，如何提高其水中溶解度，一直是临床研究的重点。郭宏红[4]将羟基喜树碱用聚电解质铁和硫酸葡聚糖包裹成微胶囊，起到缓释作用，提升了体内的半衰期和生物利用度。使用优化的碱溶梯度酸联合高压均质技术制备纳米晶[5-9]，体外研究表明能显著抑制肿瘤细胞的活性，体内研究表明，显著提高血浆半衰期，且与市售注射剂相比，抑瘤效果更好。在本研究中，以环糊精为包被剂，研究制备工艺，经溶出试验可见，在水中的溶解度提高了120倍，主药经5min完全溶出，经过包被冻干提高了主药的生物利用度，药效明显提高。本研究结果与郭宏红和杨晓凤的研究结果基本一致。
本研究通过对羟基喜树碱小试包被工艺、溶出度、体内和体外研究，初步获得了较为理想的效果，为进一步的工艺放大提供了借鉴。
参考文献
[1] Liu Z， Zheng Q， Chen W， et al. Chemosensitizing effect of Paris Saponin I on Camptothecin and 10-hydroxycamptothecin in lung cancer cells via p38 MAPK， ERK， and Akt signaling pathways[J]. European Journal of Medicinal Chemistry， 2017， 125：760-769.
[2] Lin Q， Ma L， Wang D， et al. A novel Camptothecin analogue inhibits colon cancer development and downregulates the expression of miR-155 in vivo and in vitro[J]. Translational Cancer Research， 2017， 6（3）：511-520.
[3] Gao Y， Zhang W， Sun T， et al. Local transdermal delivery of 10，11-methylenedioxycamptothecin by nanoemulsion for breast cancer prevention[J]. Journal of Controlled Release， 2017， 259：e180-e181.
[4] 郭宏红. 羟基喜树碱微胶囊药代动力学研究[D]. 东北林业大学， 2011.
[5] 杨晓凤. 羟基喜树碱纳米晶的制备和体内外研究[D]. 北京协和医学院中国医学科学院， 北京协和医学院， 中国医学科学院， 清华大学医学部， 2016.
[6] 王珏. 冻干粉针剂无菌工艺模拟试验研究[J]. 工业， 2017（3）：00017-00017.
[7] 袁海建， 安益强， 王卉，等. 银杏内酯B冻干粉针处方和冻干工艺的研究[J]. 中成药， 2015， 37（7）：1600-1602.
[8] 宋艳艳. 一种注射用替加环素冻干粉针药学研究及其初步安全性评价[D]. 吉林大学， 2017.