【摘 要】
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目的 探讨单纯Ⅱ型胶原酶消化法体外分离并培养成年小鼠耳蜗血管纹边缘细胞( marginal cell,MC)的方法.方法 选取6只出生75±3d的健康C57BL/6J小鼠,显微分离其耳蜗血管纹组织
【机 构】
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武汉市妇幼儿童保健中心(武汉市儿童医院)耳鼻咽喉头颈外科华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉头颈外科(武汉430030);
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目的 探讨单纯Ⅱ型胶原酶消化法体外分离并培养成年小鼠耳蜗血管纹边缘细胞( marginal cell,MC)的方法.方法 选取6只出生75±3d的健康C57BL/6J小鼠,显微分离其耳蜗血管纹组织,以Ⅱ型胶原酶原代消化培养边缘细胞.倒置显微镜观察细胞形态,噻唑蓝(MTT)法测细胞生长曲线,透射电镜观察细胞的超微结构,免疫荧光法检测上皮细胞标志物——中间丝角蛋白18(CK18)和耳蜗血管纹的独特标志物KCNQ1的表达,RT-PCR法检测CK18和KCNQlmRNA的表达.结果 接种24～48 h后可见细胞贴壁增殖,形成大小不等的细胞岛,一周后细胞迅速生长,相互融合,紧密莲接,形成单层极性上皮层,呈典型的“铺路石”样外观.透射电镜观察可见多角形细胞表面有较多微绒毛,胞浆内线粒体、内质网等细胞器丰富.免疫荧光检测显示CK18和KCNQ1蛋白表达阳性,RT- PCR结果示CK18和KCNQ1mRNA均有表达.结论 采用原代消化培养技术可成功建立成年小鼠耳蜗血管纹MC的体外原代培养,为进一步研究成年期MC的功能和某些内耳疾病的发病机制提供了实验基础.
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