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摘 要 目的：评价SPH0396与乳腺癌耐药蛋白（BCRP）的关系，从而推测其在临床上与其底物或抑制剂合用时发生药物-药物相互作用的可能性，为临床研究提供参考。方法：采用Caco-2细胞模型，测定SPH0396（1 μmol/L）的校正外排比（corrected efflux ratio，CER），并且以E3S為底物时1 μmol/L和5 μmol/L的SPH0396对BCRP的抑制率。结果：SPH0396的校正外排比为1.33，对BCRP的抑制率不到阳性抑制剂KO143的50%。结论：SPH0396不是BCRP潜在底物和抑制剂，因此SPH0396与BCRP的底物和抑制剂发生药物-药物相互作用的可能性很低。
关键词 酪氨酸激酶抑制剂 乳腺癌耐药蛋白 药物-药物相互作用
中图分类号：R969.2 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）15-0083-05
Interactions of anti-tumor candidate SPH0396 with breast cancer resistance protein
XU Jia， MAO Yu
（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd. Shanghai 201203， China）
ABSTRACT Objective： To evaluate the interactions of anti-tumor candidate SPH0396 with breast cancer resistance protein （BCRP）， and its potential drug-drug interaction （DDI） with BCRP substrates or inhibitors in clinic， which can provide a reference for clinical drug-drug interaction study. Methods： Caco-2 cells in vitro were used throughout the experiment to determine the corrected efflux ratio of SPH0396 at 1 μmol/L and the inhibition rate of SPH0396 at 1 μmol/L and 5 μmol/L when estrone-3-sulfate was used as a substrate. Results： The corrected efflux rate of SPH0396 was 1.33. The inhibitory rate of SPH0396 on BCRP was less than 50% of KO143 positive inhibitors. Conclusion： The present studies demonstrate that SPH0396 may be neither a substrate nor an inhibitor for BCRP， and have low potential to cause drug-drug interactions with BCRP substrate drugs.
KEY WORDS tyrosine kinase inhibitors； breast cancer resistance protein； drug-drug interaction
众多癌症的发生和发展被证明与酪氨酸激酶的活性紊乱有关，多种小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）被批准上市用于治疗肿瘤[1-3] 。针对Bcr-Abl靶点，我院自主设计并合成的SPH0396（图1）在激酶和细胞水平的抗肿瘤活性、体内外药代特性均表现良好，与上市药物博舒替尼相当甚至更优[4-5]，因此将其作为候选化合物进一步研究。
乳腺癌耐药蛋白BCRP（breast cancer resistance protein， BCRP/ABCG2）是由655个氨基酸包含6个跨膜区域和1个核苷酸结合区域的外排转运蛋白[6-8]，在人体肿瘤细胞中广泛表达[9-10]，与癌症及炎症化疗耐药相关[11-13]。BCRP对药物吸收形成障碍并影响药物的口服生物利用度，同时对肝胆的排泄产生影响[14-15]。文献报道BCRP限制拓扑替康在老鼠和人体内的口服吸收[16]。药物与转运体的相互作用是药物理化性质之外决定药物体内药动学性质的决定性因素，因此，在新药开发早期应考察药物与转运体的相互作用，筛选并优化药物，使其到达作用靶点 [17-19]。
来源于人结肠腺癌的Caco-2细胞很容易在体外培养并保持稳定，培养成熟的Caco-2细胞与小肠上皮细胞类似，分化出绒毛面AP（apical，肠腔一侧） 和基底面BL （basolateral，肠内壁一侧），表达多种转运系统相关蛋白（例如BCRP等）[20-21]，BCRP已经被证明存在于肠道上皮细胞顶膜[16]，本研究利用Caco-2细胞模型初步预测SPH0396与BCRP的底物或抑制剂发生药物-药物相互作用（drug-drug interaction，DDI）的可能性，为临床DDI研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
SPH0396来源于中央研究院药化室；高糖DMEM培养基、谷氨酰胺、双抗生素、胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA均购自美国Gibco公司；普萘洛尔、阿替洛尔和双氯芬酸购自中国药品生物制品检定所；肝素和阿霉素购自国药集团化学试剂有限公司；替硝唑、环孢素A（简称CsA）、Estrone-3-Sulfate（简称E3S）、 KO143购自美国Sigma公司；人结肠癌细胞系Caco-2细胞（中国科学院上海生化细胞所细胞库）。 1.2 实验仪器
API4000 QTRAP 型串联质谱仪（美国 Applied Biosystem 公司）；Waters Acquity UPLC 系统（美国Waters 公司）；生物安全柜（美国Labconco公司）；CO2恒溫培养箱和酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；细胞电阻仪（美国Millipore 公司）；TS100 型倒置显微镜（日本尼康公司）；3K15台式离心机（美国Sigma公司）；ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；插入式培养器（美国Millipore 公司）；24孔培养板（美国Corning公司）。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养
细胞按6×104个细胞/ml的浓度接种到Caco-2细胞培养系统（图2）的绒毛面（apical，A侧，简称AP，肠腔一侧），每孔0.4 ml，向基底面（basolateral，B侧，简称BL；肠内壁一侧）加入空白细胞培养液0.6 ml，接种后间隔1 d更换新鲜的细胞培养液培养至21 d。
1.3.2 细胞模型的建立及验证
Caco-2细胞接种后的21 d内测定Caco-2细胞单层膜上的跨膜电阻TEER值。实验同时选用普萘洛尔（Hanks’）作为高渗透的阳性对照，阿替洛尔（Hanks’）作为低渗透的阴性对照，验证Caco-2细胞单层的完整性。
1.3.3 评价SPH0396是否为BCRP的底物
细胞培养至第21天，测定细胞的TEER值，进行转运体实验。AP侧和BL侧的给药体积分别是0.4 ml和0.6 ml，37 ℃震荡孵育90 min后，用移液器吸取接收侧样品。具体实验设计见表1。
1.3.4 评价SPH0396是否抑制BCRP
细胞培养至第21天，测定细胞的TEER值，进行转运体实验。AP侧和BL侧的给药体积分别是0.4 ml和0.6 ml，37 ℃震荡孵育90 min后，用移液器吸取接收侧样品。具体实验设计见表2。
1.3.5 样品处理及测定
取接收侧样品100 ml，加入100 ml含内标的乙腈（E3S内标为含0.5 μmol/L的双氯芬酸，剩余化合物内标为0.1 mg/mL的替硝唑）沉淀蛋白，震荡、离心（6 000 g，10 min）后取70 ml测定。
E3S为负离子检测，其余均是正离子检测，用于定量分析的质谱条件见表3。
1.3.6 数据分析
评价SPH0396是否为BCRP的底物，通过表观透过系数Papp来判定，校正外排比（corrected efflux ratio，CER）表示BCRP外排能力[19]，评价SPH0396是否是BCRP的抑制剂抑制率（inhibition degree）按文献[22]计算。
2 实验结果
2.1 细胞模型的完整性考察
2.1.1 光学显微镜观察
通过光学显微镜观察到细胞生长均匀，边界清晰（图3）。
2.1.2 TEER值
对Caco-2单层细胞进行跨膜电阻检测，结果显示：随着生长时间的延长，细胞跨膜电阻逐渐增大，在第21天会达到平台（图4），用于药物吸收转运的研究具有良好的准确性。
2.1.3 细胞功能完整性检测
跨细胞转运阳性对照药物普萘洛尔（5 μmol/L）的表观透过系数Papp为1.04×10-5 cm/s，与文献报道（3.0×10-5 cm/s）相似[20]。跨细胞转运阴性对照药物阿替洛尔（1 μmol/L）的表观透过系数Papp为8.71×10-7 cm/s，满足试验要求。结果表明，本研究建立的Caco-2细胞模型用于评价药物透过性具有良好的准确性。
2.2 评价SPH0396是否为BCRP的底物
以BCRP的底物E3S作为阳性药，KO143为抑制剂，计算E3S的校正外排比为9.08，这就验证多药耐药转运体BCRP。SPH0396的校正外排比为1.33（表4），FDA规定大于2即为BCRP的潜在底物[19]，所以SPH0396不是BCRP的潜在底物。
2.3 评价SPH0396是否抑制BCRP
阿霉素是P-GP和BCRP的共同底物，CsA是P-GP和BCRP的共同抑制剂[23]，以阿霉素为底物时， SPH0396对外排转运体P-GP和BCRP有抑制，E3S为BCRP的特异性底物，1 μmol/L和5 μmol/L的SPH0396对BCRP无抑制。
3 討论
随着药代动力学体外研究技术的发展进步，利用临床前的体外试验预测药物在体内发生相互作用，可以大大减少上市后因严重相互作用而被淘汰的巨大风险，对开发新药具有重大意义[24]。乳腺癌、肺癌、白血病等恶性肿瘤均有BCRP的相关文献报道，大部分研究提示其与预后有关[25-27]。研究抗肿瘤候选药SPH0396与乳腺癌耐药蛋白（BCRP）的关系，可以为临床试验提供一定的理论依据。
Caco-2细胞上同时存在外排转运体P-GP和BCRP，因此Caco-2细胞可以用来研究药物与P-GP和BCRP转运体的相互关系。E3S是BCRP的特异性底物，KO143为BCRP特异性抑制剂，E3S的校正外排比为9.08（FDA规定应大于2），说明Caco-2细胞可用于试验研究。结果显示，SPH0396的校正外排比为1.33，说明其不是BCRP的潜在底物。阿霉素是P-GP和BCRP的共同底物，而CsA是P-GP和BCRP共同的抑制剂[26]，1 μmol/L和5 μmol/L的SPH0396可不同程度地减小底物阿霉素的转运外排比（从11.14降到2.78和1.15），同时还发现抑制率有浓度依耐性（1 μmol/L的SPH0396的抑制率3.98%，5 μmol/L的SPH0396的抑制率72.03%），但以E3S为底物时，1 μmol/L的SPH0396的抑制率14.93%，5 μmol/L的SPH0396的抑制率28.85%，本实验可以确认SPH0396抑制P-GP的程度比抑制BCRP的大。
BCRP已经被证明存在于肠道上皮细胞顶膜[16]，即AP侧，以E3S为底物时，1 μmol/L和5 μmol/L的SPH0396并没有增大底物E3S的转运，Papp（AP-BL）值从2.19E-07到2.31E-07和1.90E-07，进一步说明SPH0396没有抑制BCRP对底物E3S的外排作用，同时抑制率也达不到阳性抑制剂KO143的50%[19]，根据文献报道，认为化合物达到阳性药抑制率的50%即为抑制剂[19]，所以初步认为SPH0396不抑制BCRP。
我们的结果表明SPH0396既不是BCRP的底物也不是抑制剂，所以SPH0396与BCRP的抑制剂和底物发生DDI的可能性并不高，临床无需特别关注。
参考文献
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关键词 酪氨酸激酶抑制剂 乳腺癌耐药蛋白 药物-药物相互作用
中图分类号：R969.2 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）15-0083-05
Interactions of anti-tumor candidate SPH0396 with breast cancer resistance protein
XU Jia， MAO Yu
（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd. Shanghai 201203， China）
ABSTRACT Objective： To evaluate the interactions of anti-tumor candidate SPH0396 with breast cancer resistance protein （BCRP）， and its potential drug-drug interaction （DDI） with BCRP substrates or inhibitors in clinic， which can provide a reference for clinical drug-drug interaction study. Methods： Caco-2 cells in vitro were used throughout the experiment to determine the corrected efflux ratio of SPH0396 at 1 μmol/L and the inhibition rate of SPH0396 at 1 μmol/L and 5 μmol/L when estrone-3-sulfate was used as a substrate. Results： The corrected efflux rate of SPH0396 was 1.33. The inhibitory rate of SPH0396 on BCRP was less than 50% of KO143 positive inhibitors. Conclusion： The present studies demonstrate that SPH0396 may be neither a substrate nor an inhibitor for BCRP， and have low potential to cause drug-drug interactions with BCRP substrate drugs.
KEY WORDS tyrosine kinase inhibitors； breast cancer resistance protein； drug-drug interaction
众多癌症的发生和发展被证明与酪氨酸激酶的活性紊乱有关，多种小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）被批准上市用于治疗肿瘤[1-3] 。针对Bcr-Abl靶点，我院自主设计并合成的SPH0396（图1）在激酶和细胞水平的抗肿瘤活性、体内外药代特性均表现良好，与上市药物博舒替尼相当甚至更优[4-5]，因此将其作为候选化合物进一步研究。
乳腺癌耐药蛋白BCRP（breast cancer resistance protein， BCRP/ABCG2）是由655个氨基酸包含6个跨膜区域和1个核苷酸结合区域的外排转运蛋白[6-8]，在人体肿瘤细胞中广泛表达[9-10]，与癌症及炎症化疗耐药相关[11-13]。BCRP对药物吸收形成障碍并影响药物的口服生物利用度，同时对肝胆的排泄产生影响[14-15]。文献报道BCRP限制拓扑替康在老鼠和人体内的口服吸收[16]。药物与转运体的相互作用是药物理化性质之外决定药物体内药动学性质的决定性因素，因此，在新药开发早期应考察药物与转运体的相互作用，筛选并优化药物，使其到达作用靶点 [17-19]。
来源于人结肠腺癌的Caco-2细胞很容易在体外培养并保持稳定，培养成熟的Caco-2细胞与小肠上皮细胞类似，分化出绒毛面AP（apical，肠腔一侧） 和基底面BL （basolateral，肠内壁一侧），表达多种转运系统相关蛋白（例如BCRP等）[20-21]，BCRP已经被证明存在于肠道上皮细胞顶膜[16]，本研究利用Caco-2细胞模型初步预测SPH0396与BCRP的底物或抑制剂发生药物-药物相互作用（drug-drug interaction，DDI）的可能性，为临床DDI研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
SPH0396来源于中央研究院药化室；高糖DMEM培养基、谷氨酰胺、双抗生素、胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA均购自美国Gibco公司；普萘洛尔、阿替洛尔和双氯芬酸购自中国药品生物制品检定所；肝素和阿霉素购自国药集团化学试剂有限公司；替硝唑、环孢素A（简称CsA）、Estrone-3-Sulfate（简称E3S）、 KO143购自美国Sigma公司；人结肠癌细胞系Caco-2细胞（中国科学院上海生化细胞所细胞库）。 1.2 实验仪器
API4000 QTRAP 型串联质谱仪（美国 Applied Biosystem 公司）；Waters Acquity UPLC 系统（美国Waters 公司）；生物安全柜（美国Labconco公司）；CO2恒溫培养箱和酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；细胞电阻仪（美国Millipore 公司）；TS100 型倒置显微镜（日本尼康公司）；3K15台式离心机（美国Sigma公司）；ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；插入式培养器（美国Millipore 公司）；24孔培养板（美国Corning公司）。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养
细胞按6×104个细胞/ml的浓度接种到Caco-2细胞培养系统（图2）的绒毛面（apical，A侧，简称AP，肠腔一侧），每孔0.4 ml，向基底面（basolateral，B侧，简称BL；肠内壁一侧）加入空白细胞培养液0.6 ml，接种后间隔1 d更换新鲜的细胞培养液培养至21 d。
1.3.2 细胞模型的建立及验证
Caco-2细胞接种后的21 d内测定Caco-2细胞单层膜上的跨膜电阻TEER值。实验同时选用普萘洛尔（Hanks’）作为高渗透的阳性对照，阿替洛尔（Hanks’）作为低渗透的阴性对照，验证Caco-2细胞单层的完整性。
1.3.3 评价SPH0396是否为BCRP的底物
细胞培养至第21天，测定细胞的TEER值，进行转运体实验。AP侧和BL侧的给药体积分别是0.4 ml和0.6 ml，37 ℃震荡孵育90 min后，用移液器吸取接收侧样品。具体实验设计见表1。
1.3.4 评价SPH0396是否抑制BCRP
细胞培养至第21天，测定细胞的TEER值，进行转运体实验。AP侧和BL侧的给药体积分别是0.4 ml和0.6 ml，37 ℃震荡孵育90 min后，用移液器吸取接收侧样品。具体实验设计见表2。
1.3.5 样品处理及测定
取接收侧样品100 ml，加入100 ml含内标的乙腈（E3S内标为含0.5 μmol/L的双氯芬酸，剩余化合物内标为0.1 mg/mL的替硝唑）沉淀蛋白，震荡、离心（6 000 g，10 min）后取70 ml测定。
E3S为负离子检测，其余均是正离子检测，用于定量分析的质谱条件见表3。
1.3.6 数据分析
评价SPH0396是否为BCRP的底物，通过表观透过系数Papp来判定，校正外排比（corrected efflux ratio，CER）表示BCRP外排能力[19]，评价SPH0396是否是BCRP的抑制剂抑制率（inhibition degree）按文献[22]计算。
2 实验结果
2.1 细胞模型的完整性考察
2.1.1 光学显微镜观察
通过光学显微镜观察到细胞生长均匀，边界清晰（图3）。
2.1.2 TEER值
对Caco-2单层细胞进行跨膜电阻检测，结果显示：随着生长时间的延长，细胞跨膜电阻逐渐增大，在第21天会达到平台（图4），用于药物吸收转运的研究具有良好的准确性。
2.1.3 细胞功能完整性检测
跨细胞转运阳性对照药物普萘洛尔（5 μmol/L）的表观透过系数Papp为1.04×10-5 cm/s，与文献报道（3.0×10-5 cm/s）相似[20]。跨细胞转运阴性对照药物阿替洛尔（1 μmol/L）的表观透过系数Papp为8.71×10-7 cm/s，满足试验要求。结果表明，本研究建立的Caco-2细胞模型用于评价药物透过性具有良好的准确性。
2.2 评价SPH0396是否为BCRP的底物
以BCRP的底物E3S作为阳性药，KO143为抑制剂，计算E3S的校正外排比为9.08，这就验证多药耐药转运体BCRP。SPH0396的校正外排比为1.33（表4），FDA规定大于2即为BCRP的潜在底物[19]，所以SPH0396不是BCRP的潜在底物。
2.3 评价SPH0396是否抑制BCRP
阿霉素是P-GP和BCRP的共同底物，CsA是P-GP和BCRP的共同抑制剂[23]，以阿霉素为底物时， SPH0396对外排转运体P-GP和BCRP有抑制，E3S为BCRP的特异性底物，1 μmol/L和5 μmol/L的SPH0396对BCRP无抑制。
3 討论
随着药代动力学体外研究技术的发展进步，利用临床前的体外试验预测药物在体内发生相互作用，可以大大减少上市后因严重相互作用而被淘汰的巨大风险，对开发新药具有重大意义[24]。乳腺癌、肺癌、白血病等恶性肿瘤均有BCRP的相关文献报道，大部分研究提示其与预后有关[25-27]。研究抗肿瘤候选药SPH0396与乳腺癌耐药蛋白（BCRP）的关系，可以为临床试验提供一定的理论依据。
Caco-2细胞上同时存在外排转运体P-GP和BCRP，因此Caco-2细胞可以用来研究药物与P-GP和BCRP转运体的相互关系。E3S是BCRP的特异性底物，KO143为BCRP特异性抑制剂，E3S的校正外排比为9.08（FDA规定应大于2），说明Caco-2细胞可用于试验研究。结果显示，SPH0396的校正外排比为1.33，说明其不是BCRP的潜在底物。阿霉素是P-GP和BCRP的共同底物，而CsA是P-GP和BCRP共同的抑制剂[26]，1 μmol/L和5 μmol/L的SPH0396可不同程度地减小底物阿霉素的转运外排比（从11.14降到2.78和1.15），同时还发现抑制率有浓度依耐性（1 μmol/L的SPH0396的抑制率3.98%，5 μmol/L的SPH0396的抑制率72.03%），但以E3S为底物时，1 μmol/L的SPH0396的抑制率14.93%，5 μmol/L的SPH0396的抑制率28.85%，本实验可以确认SPH0396抑制P-GP的程度比抑制BCRP的大。
BCRP已经被证明存在于肠道上皮细胞顶膜[16]，即AP侧，以E3S为底物时，1 μmol/L和5 μmol/L的SPH0396并没有增大底物E3S的转运，Papp（AP-BL）值从2.19E-07到2.31E-07和1.90E-07，进一步说明SPH0396没有抑制BCRP对底物E3S的外排作用，同时抑制率也达不到阳性抑制剂KO143的50%[19]，根据文献报道，认为化合物达到阳性药抑制率的50%即为抑制剂[19]，所以初步认为SPH0396不抑制BCRP。
我们的结果表明SPH0396既不是BCRP的底物也不是抑制剂，所以SPH0396与BCRP的抑制剂和底物发生DDI的可能性并不高，临床无需特别关注。
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