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摘要利用小孢子加倍培养技术可以培育基因纯合、稳定的遗传材料,掌握该技术对加速育种进度有重要意义。从选取花蕾、游离小孢子分离、小孢子加倍培养、胚诱导培养、胚状体培养、再生苗培养、再生植株倍性鉴定等方面总结了甘蓝型油菜小孢子加倍培养技术。
关键词甘蓝型油菜;小孢子;加倍培养
中图分类号S565.4文献标识码B文章编号 1007-5739(2010)03-0091-01
自Lichter等[1]1981年首次报道了甘蓝型油菜游離小孢子培养并成功获得了再生苗,在后来的20多年里,国内外学者已经成功地在甘蓝型油菜中建立了小孢子培养技术体系,特别是用此种方法从培育的DH群体中获得的多种油菜品种已经在生产中得到了广泛的认可。现将甘蓝型油菜小孢子加倍培养技术介绍如下。
1选取花蕾
一般在天气晴朗的8~10时取材,如遇阴雨天气,为了不影响试验进程也可取材,但一定要选取生长良好的花序,研究报道低温有利于小孢子的胚胎发生。尽量选取主花序或生长状态较好的花序,然后在实验室选取大小在2.5~3.5mm的花蕾备用。不同的材料花蕾的发育时期不尽相同,可以剥蕾挑取小孢子进行镜检以确定发育时期,最佳时期为单核晚期至二核期。花药为淡绿色呈透明状。取蕾以后如果不能立刻进行小孢子的提取,应将花蕾放置于湿润的条件下低温保存。
2游离小孢子分离
先用75%的医用酒精将花蕾表面灭菌30～60s,再用0.1%升汞消毒花蕾表面15min,再用无菌水冲漂洗3次,每次5min。将消毒的花蕾置于灭过菌的玻璃管中,加约2mL B5提取液,用灭菌玻璃棒将花蕾研碎,压出花粉小孢子,通过2层槽式无菌滤纸,或45μm的尼龙网,或0.22μm孔径的微孔滤膜过滤,把滤液倒入灭菌了的带盖的10mL离心管里,用滴管吸B5抽提培养液冲洗过滤器中的花粉,冲2~3次后,在10mL离心管中将花粉悬浮液稀释;将花粉悬浮液离心,800rpm,离心5min;将离心管中的上层清液吸去,再加液体B5抽提液,并将沉淀的花粉用吸管冲散,再次悬浮离心(用封口膜封口),1 800rpm,离心5min,吸去上层清液。
3小孢子加倍培养
将沉淀的花粉用NLN-16 液体培养基稀释,稀释不要超过10mL,因为加倍后还要在10mL的离心管中再次稀释离心,倒入三角瓶在32℃条件下暗培养2d左右(48~72h);然后检查是否有污染,如果没有污染,则分皿继续培养。
4胚诱导培养
将加倍后的NLN-16花粉悬浮液倒入离心管离心,800rpm,离心5min,倒掉NLN-16液体;将沉淀的花粉用NLN-13培养液稀释,稀释后的悬浮液分装入7.5cm培养皿,一般每皿加入悬浮液3mL左右,含花蕾1.5~2.0个/mL,小孢子密度为10~50万个/mL,用封口膜封口;将封口的培养皿在25℃的条件下进行暗培养,10d左右开始查看是否有可见的颗粒状胚,如果没有则继续培养[2]。
5胚状体培养
当肉眼可见的小胚状体出现时,把培养皿放在摇床上振荡暗培养5~7d,转速为80～100rpm。然后将鱼雷形、子叶形胚状体移植到B5固体培养基上,在25℃光暗交替条件下持续培养,诱导植株再生[3]。
6再生苗培养
培养1~2周后,见到子叶长大变绿,胚根伸长,长满白色根毛。继续培养后形成真叶,胚根不再伸长。当达到3～4片真叶时,再转移到生根培养基上生根,或在附加1mg/L 6-BA的B5培养基上进行扦插繁殖,获得完整植株。
7再生植株倍性鉴定
对再生植株进行细胞学鉴定(染色体数目)或在开花以后根据花器形态(雄蕊和花瓣形态)进行鉴定[4-7]。若是单倍体植株,需要再加倍培养成双倍体,可以把带有秋水仙碱溶液的脱脂棉盖在植株的顶芽、腋芽上;或者初花期把单倍体植株从土壤中取出,洗净根部泥土后用0.2%～0.4%秋水仙碱溶液泡1.5～8.0h,再移栽田间;或者胚状体再生获得的试管苗,在含10～100mg/L秋水仙碱的B5液体培养基中无菌培养4～8d,转到无秋水仙碱的B5培养基中培养7～14d,然后移栽到土壤中[8,9]。
8参考文献
[1] LICHTER R.Introduction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus L[J].ZPflanzenphysiol,1982(105):427-434.
[2] 石淑稳,周永明,吴江生,等.甘蓝型油菜小孢子培养、染色体加倍、试管苗继越夏和田间移栽配套技术的研究及其在油菜育种中的应用[J].中国农学通报,2001,17(2):57-59.
[3] 余凤群,刘后利.提高甘蓝型油菜小孢子胚状体成苗率的某些培养因素研究[J].作物学报,1997,23(2):165-168.
[4] 祁永琼,林良斌.油菜小孢子再生体系的研究进展[J].云南农业大学学报,2003,18(2):208-211.
[5] 姜凤英,冯辉.羽衣甘蓝游离小孢子培养初报[J].园艺学报,2005,32(5):884.
[6] 石淑稳,吴江生,周永明,等.甘蓝型油菜小孢子单倍体二倍化技术的研究[J].中国油料作物学报,2002,24(1):1-5.
[7] 汤清林,宋明,张钟灵.甘蓝类蔬菜游离小孢子培养研究进展[J].西南农业学报,2000,13(3):98-103.
[8] 张德双,曹鸣庆,秦智伟.绿菜花游离小孢子培养、胚胎发生和植株再生[J].华北农学报,1998,13(3):102-106.
[9] 周伟军,唐桂香,张国庆,等.甘蓝型油菜小孢子秋水仙碱处理提高双单倍体频率研究[J].中国农业科学,2002,35(4):410-414.
关键词甘蓝型油菜;小孢子;加倍培养
中图分类号S565.4文献标识码B文章编号 1007-5739(2010)03-0091-01
自Lichter等[1]1981年首次报道了甘蓝型油菜游離小孢子培养并成功获得了再生苗,在后来的20多年里,国内外学者已经成功地在甘蓝型油菜中建立了小孢子培养技术体系,特别是用此种方法从培育的DH群体中获得的多种油菜品种已经在生产中得到了广泛的认可。现将甘蓝型油菜小孢子加倍培养技术介绍如下。
1选取花蕾
一般在天气晴朗的8~10时取材,如遇阴雨天气,为了不影响试验进程也可取材,但一定要选取生长良好的花序,研究报道低温有利于小孢子的胚胎发生。尽量选取主花序或生长状态较好的花序,然后在实验室选取大小在2.5~3.5mm的花蕾备用。不同的材料花蕾的发育时期不尽相同,可以剥蕾挑取小孢子进行镜检以确定发育时期,最佳时期为单核晚期至二核期。花药为淡绿色呈透明状。取蕾以后如果不能立刻进行小孢子的提取,应将花蕾放置于湿润的条件下低温保存。
2游离小孢子分离
先用75%的医用酒精将花蕾表面灭菌30～60s,再用0.1%升汞消毒花蕾表面15min,再用无菌水冲漂洗3次,每次5min。将消毒的花蕾置于灭过菌的玻璃管中,加约2mL B5提取液,用灭菌玻璃棒将花蕾研碎,压出花粉小孢子,通过2层槽式无菌滤纸,或45μm的尼龙网,或0.22μm孔径的微孔滤膜过滤,把滤液倒入灭菌了的带盖的10mL离心管里,用滴管吸B5抽提培养液冲洗过滤器中的花粉,冲2~3次后,在10mL离心管中将花粉悬浮液稀释;将花粉悬浮液离心,800rpm,离心5min;将离心管中的上层清液吸去,再加液体B5抽提液,并将沉淀的花粉用吸管冲散,再次悬浮离心(用封口膜封口),1 800rpm,离心5min,吸去上层清液。
3小孢子加倍培养
将沉淀的花粉用NLN-16 液体培养基稀释,稀释不要超过10mL,因为加倍后还要在10mL的离心管中再次稀释离心,倒入三角瓶在32℃条件下暗培养2d左右(48~72h);然后检查是否有污染,如果没有污染,则分皿继续培养。
4胚诱导培养
将加倍后的NLN-16花粉悬浮液倒入离心管离心,800rpm,离心5min,倒掉NLN-16液体;将沉淀的花粉用NLN-13培养液稀释,稀释后的悬浮液分装入7.5cm培养皿,一般每皿加入悬浮液3mL左右,含花蕾1.5~2.0个/mL,小孢子密度为10~50万个/mL,用封口膜封口;将封口的培养皿在25℃的条件下进行暗培养,10d左右开始查看是否有可见的颗粒状胚,如果没有则继续培养[2]。
5胚状体培养
当肉眼可见的小胚状体出现时,把培养皿放在摇床上振荡暗培养5~7d,转速为80～100rpm。然后将鱼雷形、子叶形胚状体移植到B5固体培养基上,在25℃光暗交替条件下持续培养,诱导植株再生[3]。
6再生苗培养
培养1~2周后,见到子叶长大变绿,胚根伸长,长满白色根毛。继续培养后形成真叶,胚根不再伸长。当达到3～4片真叶时,再转移到生根培养基上生根,或在附加1mg/L 6-BA的B5培养基上进行扦插繁殖,获得完整植株。
7再生植株倍性鉴定
对再生植株进行细胞学鉴定(染色体数目)或在开花以后根据花器形态(雄蕊和花瓣形态)进行鉴定[4-7]。若是单倍体植株,需要再加倍培养成双倍体,可以把带有秋水仙碱溶液的脱脂棉盖在植株的顶芽、腋芽上;或者初花期把单倍体植株从土壤中取出,洗净根部泥土后用0.2%～0.4%秋水仙碱溶液泡1.5～8.0h,再移栽田间;或者胚状体再生获得的试管苗,在含10～100mg/L秋水仙碱的B5液体培养基中无菌培养4～8d,转到无秋水仙碱的B5培养基中培养7～14d,然后移栽到土壤中[8,9]。
8参考文献
[1] LICHTER R.Introduction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus L[J].ZPflanzenphysiol,1982(105):427-434.
[2] 石淑稳,周永明,吴江生,等.甘蓝型油菜小孢子培养、染色体加倍、试管苗继越夏和田间移栽配套技术的研究及其在油菜育种中的应用[J].中国农学通报,2001,17(2):57-59.
[3] 余凤群,刘后利.提高甘蓝型油菜小孢子胚状体成苗率的某些培养因素研究[J].作物学报,1997,23(2):165-168.
[4] 祁永琼,林良斌.油菜小孢子再生体系的研究进展[J].云南农业大学学报,2003,18(2):208-211.
[5] 姜凤英,冯辉.羽衣甘蓝游离小孢子培养初报[J].园艺学报,2005,32(5):884.
[6] 石淑稳,吴江生,周永明,等.甘蓝型油菜小孢子单倍体二倍化技术的研究[J].中国油料作物学报,2002,24(1):1-5.
[7] 汤清林,宋明,张钟灵.甘蓝类蔬菜游离小孢子培养研究进展[J].西南农业学报,2000,13(3):98-103.
[8] 张德双,曹鸣庆,秦智伟.绿菜花游离小孢子培养、胚胎发生和植株再生[J].华北农学报,1998,13(3):102-106.
[9] 周伟军,唐桂香,张国庆,等.甘蓝型油菜小孢子秋水仙碱处理提高双单倍体频率研究[J].中国农业科学,2002,35(4):410-414.