本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒（ASFV）p72蛋白阻断ELISA抗体检测方法。以纯化的重组p72蛋白作为包被抗原，HRP标记的6E5抗体作为阻断抗体，通过对反应条件进行优化，建立了基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测119份临床阴性血清，计算血清阻断率确定临界值，确定了该方法的判定标准：当阻断率PI≥50%时判定为ASFV抗体阳性；PI≤40%时判定为ASFV抗体阴性；当阻断率介于两者之间时，判定为可疑。该方法与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、A型塞内卡病毒、猪口蹄疫病毒、猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪格拉瑟菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的抗体阳性血清无交叉反应，批间、批内试验的变异系数均小于15%。用该方法与商品化ASFV抗体检测试剂盒同时检测447份猪临床血清样品，两种方法的相对敏感性和相对特异性分别为95.3%和94.5%，符合率为94.9%。本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的敏感性和良好的特异性，可用于ASFV感染诊断和流行病学调查。