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摘要：为获取丁酸梭菌芽孢高密度发酵工艺，以丁酸梭菌DSY-1为试验材料，以芽孢数为指标，通过单因素试验，探究碳源、氮源、接种量、初始pH值、培养温度和正交试验，并通过5 L发酵罐进行中和剂选择。结果表明，菌株DSY-1以C6H12O6 30 g/L、酵母提取粉10 g/L、NaCl 5 g/L、乙酸钠 5 g/L、K2HPO4 3 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、L-半胱氨酸酸盐 0.5 g/L为发酵培养基，初始pH值为6.5，培养温度为35 ℃，接种量为2.5%，5 L发酵灌发酵使用12.5%氨水作中和剂时，菌株 DSY-1 芽孢数最大，达9.3亿CFU/mL。
关键词：丁酸梭菌;正交试验;芽孢生物量;发酵工艺
中图分类号：S182 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2021）16-0148-05
随着我国养殖业的发展，养殖模式已经转向集约化、规模化发展。为了减少病害，人们在饲料中添加抗生素，虽起到了促进动物生长的作用，但也造成了抗生素的滥用。我国每年约8 000 t的抗生素被用于动物疾病预防和治疗[1]。在禁抗大背景下，禁抗替抗已成为养殖行业持续健康发展和食品安全的重点话题。近年来，益生菌作为替抗产品，乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌等已被广泛应用于养殖业中[2-3]。
丁酸梭菌（Clostridium butyricum）属于梭菌科梭菌属，为革兰氏阳性厌氧杆菌，具有耐胃酸、耐胆盐特性。自1933年，日本Miyairy博士首次从粪便中分离出丁酸梭菌便引起了科学家广泛关注。目前，丁酸梭菌被广泛应用于养殖行业中。研究发现，在基础日粮中添加丁酸梭菌能够增强机体的免疫力、提高抗氧化性能[3-4]、改善肉品质[5-6]和肠道组织形态[7-11]、抑制肠道中有害菌群、提高有益菌群丰度[11-12]。
目前，制约丁酸梭菌微生态制剂大规模生产的主要因素是制备过程中菌体量和芽孢量过低。本试验采用单因素试验和正交试验优化发酵培养基和5 L发酵罐培养优化，探究对丁酸梭菌芽孢产量的影响，为丁酸梭菌芽孢的高密度发酵提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 丁酸梭菌DSY-1由笔者所在实验室筛选获得。
1.1.2 培养基 种子液：蛋白胨10 g/L、牛肉膏 10 g/L、葡萄糖5 g/L、氯化钠 5 g/L、可溶性淀粉 1 g/L、乙酸钠3 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L。pH值7.0±0.1，121 ℃灭菌20 min。
LB液体培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取粉 5 g/L、NaCl 10 g/L。固體培养基加20 g/L琼脂。121 ℃灭菌20 min。
LB固体培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取粉5 g/L、NaCl 10 g/L、20 g/L琼脂。121 ℃灭菌20 min。
活化培养基：同种子液，加20 g/L琼脂。pH值 7.0±0.1，121 ℃灭菌20 min。
芽孢计数培养基：下层为TSC培养基 5 g/L琼脂，上层：18 g/L海藻酸钠 30 g/L TSC培养基。121 ℃灭菌20 min。
基础发酵培养基：C6H12O6 30 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、乙酸钠 5 g/L、K2HPO4 3 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、L-半胱氨酸酸盐 0.5 g/L，pH值6.4±0.1，115 ℃灭菌20 min。
1.1.3 试验药品 蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、可溶性淀粉、琼脂（BR），广东环凯生物科技有限公司生产;K2HPO4、MgSO4·7H2O、C6H12O6、NaCl、乙酸钠、L-半胱氨酸盐酸盐、海藻酸钠（AR），国药集团化学试剂有限公司生产;TSC培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司生产。
1.1.4 试验仪器 雷磁pH计（pH-3C），上海仪电科学仪器股份有限公司生产;厌氧袋（C-11），日本三菱公司生产;鼓风干燥箱（DHG-9246A），上海精宏实验设备有限公司生产;恒温培养箱（DNP-9052），上海精宏实验设备有限公司生产;高压灭菌锅（YXQ-LS-100S），上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产;显微镜（CX-23），日本奥林巴斯;电子天平（ME204E），梅特勒-托利多仪器有限公司生产;超净工作台（SW-CJ-ID），苏州净化设备有限公司生产。
1.2 试验方法
1.2.1 菌种活化及种子液制备 吸取于-80 ℃甘油管保藏的菌种DSY-1 1 mL，接种于液体种子液中，并置于厌氧培养箱中37 ℃培养24 h。
1.2.2 发酵培养 将培养24 h的种子液按3 ∶ 100（体积比）接种于装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，置于37 ℃厌氧培养箱中培养48 h。
1.2.3 芽孢计数 芽孢计数方法与李雯静等的方法[13]相同。
1.2.4 不同因素对菌株DS-1芽孢产量的影响 为了探究菌株DSY-1最佳碳源，选取淀粉、乳糖、蔗糖、麦芽糖来替换基础发酵培养基中的葡萄糖，添加量均为1%;在最佳氮源选择试验中，选取牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵来替换基础发酵培养基中的氮源，添加量均为3%;为了研究接种量对菌株 DSY-1 芽孢产量的影响，分别以体积分数为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3%的接种量将种子液接入发酵培养基中;为了探究初始pH值对菌株芽孢产量的影响，利用3 mol/L HCl或3 mol/L NaOH调节培养基中的pH值至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5;上述试验接种量均为2.5%，置于37 ℃恒温培养箱中培养48 h。在上述试验的基础上，探究不同培养温度对菌株DSY-1生长的影响，将发酵培养基置于25、30、35、40、45 ℃恒温培养箱中培养。以上所有试验均进行3次重复。 1.2.5 正交试验 在单因素试验结果的基础上，采用正交试验优化菌株DSY-1产芽孢最佳条件。本试验选取初始pH值（A）、培养温度（B）、接种量（C）3个对菌株产芽孢影响较大的因素，对其进行3因素3水平试验，以确定上述3因素对菌株DSY-1产芽孢最佳组合，其正交试验设计见表1。
1.2.6 5 L发酵罐发酵试验 在“1.2.5”节试验结果的基础上配制培养基，装液量70%，接种量3%，转速50 r/min，培养温度为35 ℃，培养时间为48 h。发酵过程不控制pH值自然发酵;发酵过程中前 24 h，用12.5%氨水将pH值维持在6.5±0.2。
1.2.7 不同中和剂对菌株DSY-1芽孢产量的影响 在上述单因素试验和正交试验结果的基础上，以12.5%、25.0%、50.0%氨水，3 mol/L NaOH、3 mol/L Ca（OH）2、3 mol/L KOH调节pH值。
1.2.8 数据分析 使用Excel统计数据，采用统计软件SPSS 25中的One-Way ANOVA进行单因素方差分析，用Turkey多重比较法对处理间的差异性进行比较分析，结果以“平均值±标准差”表示，P
关键词：丁酸梭菌;正交试验;芽孢生物量;发酵工艺
中图分类号：S182 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2021）16-0148-05
随着我国养殖业的发展，养殖模式已经转向集约化、规模化发展。为了减少病害，人们在饲料中添加抗生素，虽起到了促进动物生长的作用，但也造成了抗生素的滥用。我国每年约8 000 t的抗生素被用于动物疾病预防和治疗[1]。在禁抗大背景下，禁抗替抗已成为养殖行业持续健康发展和食品安全的重点话题。近年来，益生菌作为替抗产品，乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌等已被广泛应用于养殖业中[2-3]。
丁酸梭菌（Clostridium butyricum）属于梭菌科梭菌属，为革兰氏阳性厌氧杆菌，具有耐胃酸、耐胆盐特性。自1933年，日本Miyairy博士首次从粪便中分离出丁酸梭菌便引起了科学家广泛关注。目前，丁酸梭菌被广泛应用于养殖行业中。研究发现，在基础日粮中添加丁酸梭菌能够增强机体的免疫力、提高抗氧化性能[3-4]、改善肉品质[5-6]和肠道组织形态[7-11]、抑制肠道中有害菌群、提高有益菌群丰度[11-12]。
目前，制约丁酸梭菌微生态制剂大规模生产的主要因素是制备过程中菌体量和芽孢量过低。本试验采用单因素试验和正交试验优化发酵培养基和5 L发酵罐培养优化，探究对丁酸梭菌芽孢产量的影响，为丁酸梭菌芽孢的高密度发酵提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 丁酸梭菌DSY-1由笔者所在实验室筛选获得。
1.1.2 培养基 种子液：蛋白胨10 g/L、牛肉膏 10 g/L、葡萄糖5 g/L、氯化钠 5 g/L、可溶性淀粉 1 g/L、乙酸钠3 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L。pH值7.0±0.1，121 ℃灭菌20 min。
LB液体培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取粉 5 g/L、NaCl 10 g/L。固體培养基加20 g/L琼脂。121 ℃灭菌20 min。
LB固体培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取粉5 g/L、NaCl 10 g/L、20 g/L琼脂。121 ℃灭菌20 min。
活化培养基：同种子液，加20 g/L琼脂。pH值 7.0±0.1，121 ℃灭菌20 min。
芽孢计数培养基：下层为TSC培养基 5 g/L琼脂，上层：18 g/L海藻酸钠 30 g/L TSC培养基。121 ℃灭菌20 min。
基础发酵培养基：C6H12O6 30 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、乙酸钠 5 g/L、K2HPO4 3 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、L-半胱氨酸酸盐 0.5 g/L，pH值6.4±0.1，115 ℃灭菌20 min。
1.1.3 试验药品 蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、可溶性淀粉、琼脂（BR），广东环凯生物科技有限公司生产;K2HPO4、MgSO4·7H2O、C6H12O6、NaCl、乙酸钠、L-半胱氨酸盐酸盐、海藻酸钠（AR），国药集团化学试剂有限公司生产;TSC培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司生产。
1.1.4 试验仪器 雷磁pH计（pH-3C），上海仪电科学仪器股份有限公司生产;厌氧袋（C-11），日本三菱公司生产;鼓风干燥箱（DHG-9246A），上海精宏实验设备有限公司生产;恒温培养箱（DNP-9052），上海精宏实验设备有限公司生产;高压灭菌锅（YXQ-LS-100S），上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产;显微镜（CX-23），日本奥林巴斯;电子天平（ME204E），梅特勒-托利多仪器有限公司生产;超净工作台（SW-CJ-ID），苏州净化设备有限公司生产。
1.2 试验方法
1.2.1 菌种活化及种子液制备 吸取于-80 ℃甘油管保藏的菌种DSY-1 1 mL，接种于液体种子液中，并置于厌氧培养箱中37 ℃培养24 h。
1.2.2 发酵培养 将培养24 h的种子液按3 ∶ 100（体积比）接种于装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，置于37 ℃厌氧培养箱中培养48 h。
1.2.3 芽孢计数 芽孢计数方法与李雯静等的方法[13]相同。
1.2.4 不同因素对菌株DS-1芽孢产量的影响 为了探究菌株DSY-1最佳碳源，选取淀粉、乳糖、蔗糖、麦芽糖来替换基础发酵培养基中的葡萄糖，添加量均为1%;在最佳氮源选择试验中，选取牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵来替换基础发酵培养基中的氮源，添加量均为3%;为了研究接种量对菌株 DSY-1 芽孢产量的影响，分别以体积分数为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3%的接种量将种子液接入发酵培养基中;为了探究初始pH值对菌株芽孢产量的影响，利用3 mol/L HCl或3 mol/L NaOH调节培养基中的pH值至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5;上述试验接种量均为2.5%，置于37 ℃恒温培养箱中培养48 h。在上述试验的基础上，探究不同培养温度对菌株DSY-1生长的影响，将发酵培养基置于25、30、35、40、45 ℃恒温培养箱中培养。以上所有试验均进行3次重复。 1.2.5 正交试验 在单因素试验结果的基础上，采用正交试验优化菌株DSY-1产芽孢最佳条件。本试验选取初始pH值（A）、培养温度（B）、接种量（C）3个对菌株产芽孢影响较大的因素，对其进行3因素3水平试验，以确定上述3因素对菌株DSY-1产芽孢最佳组合，其正交试验设计见表1。
1.2.6 5 L发酵罐发酵试验 在“1.2.5”节试验结果的基础上配制培养基，装液量70%，接种量3%，转速50 r/min，培养温度为35 ℃，培养时间为48 h。发酵过程不控制pH值自然发酵;发酵过程中前 24 h，用12.5%氨水将pH值维持在6.5±0.2。
1.2.7 不同中和剂对菌株DSY-1芽孢产量的影响 在上述单因素试验和正交试验结果的基础上，以12.5%、25.0%、50.0%氨水，3 mol/L NaOH、3 mol/L Ca（OH）2、3 mol/L KOH调节pH值。
1.2.8 数据分析 使用Excel统计数据，采用统计软件SPSS 25中的One-Way ANOVA进行单因素方差分析，用Turkey多重比较法对处理间的差异性进行比较分析，结果以“平均值±标准差”表示，P