论文部分内容阅读
摘 要：以植物乳杆菌ZR09为研究对象，研究其发酵上清液的抗菌谱、抑菌活性及抑菌机理。结果表明：植物乳杆菌ZR09的发酵上清液对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、变形杆菌、铜绿假单孢杆菌和鲍曼不动杆菌有抑菌活性，其中对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和藤黄八叠球菌的抑菌率均达90%以上，对变形杆菌和铜绿假单孢杆菌的抑菌率稍差，为80%左右。初步推断植物乳杆菌ZR09的抑菌机理是通过其产生的活性物质破坏细菌细胞壁膜，导致胞内物质外泄，从而引起细菌死亡。
关键词：植物乳杆菌；抑菌；机理
中图分类号：S816.6 文献标识码：A
抗生素作为饲料添加剂之一对畜禽疾病的防治有显著作用，但是由于饲用抗生素的普及甚至滥用，其在畜禽产品的残留直接危害了人类健康及生态环境的安全。益生素具有调节和促进肠道菌群平衡、抑制有害细菌、增强机体免疫力及提高饲料转化率等功能[1-2]，可在一定程度上起到替代抗生素的作用，已日益受到业界人士的关注。乳酸菌可以产生有机酸、细菌素、过氧化氢、双乙酰等多种天然抑菌物质，是一类具有益生素开发前景的微生物。植物乳杆菌ZR09（Lactobacillus plantarum，ZR09）是从发酵蔬菜汁中筛选到的一株乳酸菌。本文主要展开其体外抑菌试验，包括抗菌谱和抑菌活性测定，并对其抑菌机理进行了初步探讨，以期为植物乳酸菌类益生素的开发应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 菌株和培养基
植物乳杆菌ZR09和检测菌均由浙江省农科院植物保护与微生物研究所保存。培养基：脱脂乳培养基、MRS和普通肉汤培养基。
1.2 检测菌种子液的制备
将斜面保存的检测菌分别接种于肉汤培养基中，37℃培养18～24h，使菌体浓度达到108CFU/mL左右，作为种子菌液备用。
1.3 植物乳杆菌的活化
用接种环转接冻干管中的植物乳杆菌ZR09至灭菌脱脂乳培养基中，37℃培养5～7h至凝固，反复活化3～4代。将活化的菌株转至MRS液体培养基中，37℃培养16～18h。
1.4 植物乳杆菌发酵上清液的制备
将菌体浓度约为3.5×107CFU/mL的ZR09在无菌条件下按1%接种到MRS液体培养液中，37℃培养48h，8000r/min离心10min。取上清液，经细菌过滤器（滤膜直径为0.22μm）过滤除菌，收集滤液即为无菌发酵上清液，4℃下保存备用。
1.5 抗菌谱的测定
将检测菌液（菌数约为107cfu/mL）0.1mL分别均匀涂在肉汤固体平板上，自然干燥30 min后，将牛津杯（内径为6mm）均匀放置在平板上，吸取0.1mLZR09发酵上清液于杯中，37℃培养24～48h，测量抑菌圈直径。各重复3次，取平均值。在牛津杯中添加MRS液体培养基0.1mL作为对照。
1.6 抑菌活性的测定
在30mL肉汤培养液中按1%的接种量接入检测菌种子液，加入ZR09发酵上清液1mL，对照试管中加入MRS液体培养基1mL。37℃、200r/min振荡培养，8h后取少量菌液测定其OD600，按公式计算抑菌率。
抑菌率=（对照组OD600一试验组OD600）/对照组OD600×100%
1.7 抑菌机理初探
在30mL肉汤培养液中按1%的接种量接入金黄色葡萄球菌种子液，37℃、200r/min振荡培养8h，加入ZR09发酵上清液1mL，对照试管中加入MRS液体培养基1mL。30min后各取对照组和试验组中的少量菌体于JEM-1400透射电子显微镜下观察菌体内部结构。
2 结果与分析
2.1 抗菌谱测定结果
植物乳杆菌ZR09对各类细菌的抑制作用见表1。由此可知，ZR09对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌的抑制作用最强，对变形杆菌、铜绿假单孢杆菌和鲍曼不动杆菌的作用次之，对蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌无抑制作用。
2.2 抑菌活性測定结果
在细菌培养液中加入3.2%的ZR09的发酵上清液，培养8h。结果表明，ZR09对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和藤黄八叠球菌的生长具有很强的抑制作用，抑菌率均达90%以上，对变形杆菌和铜绿假单孢杆菌的抑菌率稍差，为80%左右，对鲍曼不动杆菌的抑菌率为70.2%。
2.3 抑菌机理的研究
经ZR09发酵上清液作用30min后的金黄色葡萄球菌在透射电镜下形态结构发生改变，菌体皱缩、扭曲，菌体破裂，胞内物质外流（图1-1）。对照组中的金黄色葡萄球菌成圆球状，表面光滑，饱满（图1-2）。说明植物乳杆菌的抑菌机理极可能是其活性物质通过破坏细菌细胞壁膜，从而导致胞内物质外泄，引起细菌死亡。
3 小 结
植物乳杆菌ZR09的抑菌活性测定结果表明其对多种致病菌包括沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌率均大于90%，对变形杆菌、铜绿假单孢杆菌的抑菌为80%左右，具有良好的益生素开发前景。透射电镜结果表明经ZR09发酵上清液能使金黄色葡萄球菌菌体皱缩、扭曲，菌体破裂，胞内物质外流，初步推断其抑菌机理是通过产生的活性物质破坏靶标细菌细胞壁膜，导致胞内物质外泄，从而引起细菌死亡，至于其杀死细菌的具体作用机制及对其他细菌的作用是否有所差异，还有待于进一步的研究。
参考文献
[1] 杨雪海，赵娜，魏金涛，李绍章.植物乳杆菌对致病性大肠杆菌的抑制效果研究[J].饲料研究，2011（1）：27-28.
[2] Shah NP. Functional cultures and health benefits[J].International Dairy Journal，2007，17（11）：1262-1277
作者简介：尹小良（1971- ），男，浙江绍兴人，畜牧师，从事畜牧生产管理与技术研究推广。
关键词：植物乳杆菌；抑菌；机理
中图分类号：S816.6 文献标识码：A
抗生素作为饲料添加剂之一对畜禽疾病的防治有显著作用，但是由于饲用抗生素的普及甚至滥用，其在畜禽产品的残留直接危害了人类健康及生态环境的安全。益生素具有调节和促进肠道菌群平衡、抑制有害细菌、增强机体免疫力及提高饲料转化率等功能[1-2]，可在一定程度上起到替代抗生素的作用，已日益受到业界人士的关注。乳酸菌可以产生有机酸、细菌素、过氧化氢、双乙酰等多种天然抑菌物质，是一类具有益生素开发前景的微生物。植物乳杆菌ZR09（Lactobacillus plantarum，ZR09）是从发酵蔬菜汁中筛选到的一株乳酸菌。本文主要展开其体外抑菌试验，包括抗菌谱和抑菌活性测定，并对其抑菌机理进行了初步探讨，以期为植物乳酸菌类益生素的开发应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 菌株和培养基
植物乳杆菌ZR09和检测菌均由浙江省农科院植物保护与微生物研究所保存。培养基：脱脂乳培养基、MRS和普通肉汤培养基。
1.2 检测菌种子液的制备
将斜面保存的检测菌分别接种于肉汤培养基中，37℃培养18～24h，使菌体浓度达到108CFU/mL左右，作为种子菌液备用。
1.3 植物乳杆菌的活化
用接种环转接冻干管中的植物乳杆菌ZR09至灭菌脱脂乳培养基中，37℃培养5～7h至凝固，反复活化3～4代。将活化的菌株转至MRS液体培养基中，37℃培养16～18h。
1.4 植物乳杆菌发酵上清液的制备
将菌体浓度约为3.5×107CFU/mL的ZR09在无菌条件下按1%接种到MRS液体培养液中，37℃培养48h，8000r/min离心10min。取上清液，经细菌过滤器（滤膜直径为0.22μm）过滤除菌，收集滤液即为无菌发酵上清液，4℃下保存备用。
1.5 抗菌谱的测定
将检测菌液（菌数约为107cfu/mL）0.1mL分别均匀涂在肉汤固体平板上，自然干燥30 min后，将牛津杯（内径为6mm）均匀放置在平板上，吸取0.1mLZR09发酵上清液于杯中，37℃培养24～48h，测量抑菌圈直径。各重复3次，取平均值。在牛津杯中添加MRS液体培养基0.1mL作为对照。
1.6 抑菌活性的测定
在30mL肉汤培养液中按1%的接种量接入检测菌种子液，加入ZR09发酵上清液1mL，对照试管中加入MRS液体培养基1mL。37℃、200r/min振荡培养，8h后取少量菌液测定其OD600，按公式计算抑菌率。
抑菌率=（对照组OD600一试验组OD600）/对照组OD600×100%
1.7 抑菌机理初探
在30mL肉汤培养液中按1%的接种量接入金黄色葡萄球菌种子液，37℃、200r/min振荡培养8h，加入ZR09发酵上清液1mL，对照试管中加入MRS液体培养基1mL。30min后各取对照组和试验组中的少量菌体于JEM-1400透射电子显微镜下观察菌体内部结构。
2 结果与分析
2.1 抗菌谱测定结果
植物乳杆菌ZR09对各类细菌的抑制作用见表1。由此可知，ZR09对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌的抑制作用最强，对变形杆菌、铜绿假单孢杆菌和鲍曼不动杆菌的作用次之，对蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌无抑制作用。
2.2 抑菌活性測定结果
在细菌培养液中加入3.2%的ZR09的发酵上清液，培养8h。结果表明，ZR09对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和藤黄八叠球菌的生长具有很强的抑制作用，抑菌率均达90%以上，对变形杆菌和铜绿假单孢杆菌的抑菌率稍差，为80%左右，对鲍曼不动杆菌的抑菌率为70.2%。
2.3 抑菌机理的研究
经ZR09发酵上清液作用30min后的金黄色葡萄球菌在透射电镜下形态结构发生改变，菌体皱缩、扭曲，菌体破裂，胞内物质外流（图1-1）。对照组中的金黄色葡萄球菌成圆球状，表面光滑，饱满（图1-2）。说明植物乳杆菌的抑菌机理极可能是其活性物质通过破坏细菌细胞壁膜，从而导致胞内物质外泄，引起细菌死亡。
3 小 结
植物乳杆菌ZR09的抑菌活性测定结果表明其对多种致病菌包括沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌率均大于90%，对变形杆菌、铜绿假单孢杆菌的抑菌为80%左右，具有良好的益生素开发前景。透射电镜结果表明经ZR09发酵上清液能使金黄色葡萄球菌菌体皱缩、扭曲，菌体破裂，胞内物质外流，初步推断其抑菌机理是通过产生的活性物质破坏靶标细菌细胞壁膜，导致胞内物质外泄，从而引起细菌死亡，至于其杀死细菌的具体作用机制及对其他细菌的作用是否有所差异，还有待于进一步的研究。
参考文献
[1] 杨雪海，赵娜，魏金涛，李绍章.植物乳杆菌对致病性大肠杆菌的抑制效果研究[J].饲料研究，2011（1）：27-28.
[2] Shah NP. Functional cultures and health benefits[J].International Dairy Journal，2007，17（11）：1262-1277
作者简介：尹小良（1971- ），男，浙江绍兴人，畜牧师，从事畜牧生产管理与技术研究推广。