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摘 要：为有效降解环境中的石油污染，在现有可降解石油的菌株中筛选出了高效石油降解菌：赤红球菌、GP3A、鞘氨醇杆菌以及无色杆菌，通过细菌相互组合构建出26个复合菌群，其中赤红球菌、鞘氨醇杆菌以及无色杆菌三株细菌组合对石油降解率最高，达到70.32%。通过正交实验法确定了三株细菌最优比例为，赤红球菌∶鞘氨醇杆菌∶无色杆菌=2∶1∶2。该石油降解菌群的最佳培养条件是培养基温度35 ℃，初始培养pH值7.0，石油浓度为5%，降解率达到77.12%。
关键词：石油；石油降解的复合菌群；降解率
石油泄漏造成环境污染，石油组分非常复杂，主要成分是烷烃、苯、甲苯和二甲苯等复杂芳香烃[1]。单一菌株很难将油污降解完全，因此，筛选石油降解复合菌群是非常必要的。
1 材料与方法
实验所用菌种苍白杆菌（Ochrobactrum sp.）、赤红球菌（Rhodococcus ruber）、不动杆菌（Acinetobacter sp.）以及铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）为实验室筛选。
菌种假单胞菌（Pseudomonas sp.）、鞘氨醇杆菌（Sphingomonas sp.）以及无色杆菌（Achromobacter sp.）来源于华南理工大学生态修复实验室。
供试石油取自唐海冀东油田。
1.1 高效石油降解菌的筛选
在已知可降解石油的细菌中通过测定石油降解菌周降解率，筛选出降解率较高的细菌作为石油降解菌群构建的菌种资源。
1.2 石油降解复合菌群的构建
将筛选出的石油降解菌用排列组合的方法进行组合，加入石油降解培养基中测定复合菌剂的周降解率。
1.3 高效石油降解复合菌群降油条件优化
利用正交试验分析方法对石油降解复合菌群中各个菌株的配比进行优化，并对其降解条件优化，条件包括培养温度、培养基初始pH值以及原油浓度。
2 结果与分析
2.1 筛选高效石油降解菌
将活化后的细菌6（苍白杆菌）、7（赤红球菌）、10（不动杆菌）、11（铜绿假单胞菌）、12（假单胞菌）、13（GY2B：鞘氨醇杆菌）以及14（GD1A：无色杆菌）加入到石油培养基中，用紫外分光光度法测量其周降解率，结果如图1所示。
赤红球菌对石油有很好的降解作用而且最早起作用。苍白杆菌、假单胞菌、GP3A、GY2B、GD1A等菌株对石油有很高的降解性能，但是11菌株-铜绿假单胞菌为致病菌株不予以使用，确定最终苍白杆菌、赤红球菌、GP3A、GY2B以及GD1A。
2.2 石油降解复合菌群的构建
将筛选得到的细菌通过排列组合的方法进行组合编号如表1，加入石油降解培养基后测量周降解率。
如图2结果表明，组合19石油降解率最高，达到70.32%，组合菌株包括：赤红球菌、GY2B和GD1A。
2.3 石油降解复合菌群降油条件优化
2.3.1 正交实验法选择复合菌群的最佳配比 如表2，正交设计实验中降解效果最好的菌种配比为赤红球菌∶GY2B∶CD1A=2∶1∶22.3.2 培养基温度对复合菌群降解石油的影响 对培养基温度的研究结果见图3，20～25 ℃培养石油降解率在35%～55%；在25～35 ℃培养时石油降解效率升高，到35 ℃达到峰值7132%；40 ℃降解效果明显下降。
培养温度对微生物降解原油的影响主要是表现在三个方面：影响石油烃的物理状态、化学组成和微生物本身的代谢活性[2]。25～30 ℃石油降解率较低，因为温度较低时，细菌活性受到限制，细菌本身及其代谢产物活性不大，对石油降解性能不高。30～35 ℃红球菌对石油降解效果显著升高，最大达到70%以上，说明在此温度范围内，细菌活性增加，石油状态也变得有利于细菌的分解。40 ℃时降解率下降可能因为温度超过了细菌的耐受范围，导致降解率下降。
2.3.3 培养基初始pH对复合菌群降解石油的影响 初始pH对于微生物生长代谢有着极其重要的作用，影响微生物细胞内的酶活性以及培养基营养状况[3]。如图4，对培养基的初始pH研究表明：pH值在5.0～7.0之间菌群的降解效率呈现上升趋势。在pH为7.0时降解效果最高达到77.12%；pH值大于7.0以后降解效果明显下降。初始pH对于微生物生长代谢有着极其重要的作用，影响微生物细胞内的酶活性以及培养基营养状况[4]。因此微生物只有在最佳pH值下才能进行良好的生长和代谢。该株赤红球菌降解石油的最佳pH值为7.0 。
2.3.4 石油浓度对复合菌群降解石油的影响 如图5，石油浓度对菌株的降解效果影响不如前两个指标剧烈，但可以看出在随着石油浓度增大，细菌的石油降解率呈先上升后下降的趋势，在石油浓度为5 g/L时降解效果最好，达到70%以上。
石油浓度是微生物代谢过程的一个重要因素，对微生物降解性能有一定影响[5]。石油浓度较低时，碳源不足，细菌生长缓慢，对石油降解效果不佳。随着石油浓度增加，碳源可以满足细菌生长，细菌的降解效果也随着增大，当石油浓度继续增大，开始抑制石油降解菌的活性，使得细菌对石油降解效果下降。
3 讨论与结论
生物降解法由于见效快、无残毒、低成本，逐渐成为目前国际上关于石油污染研究的重点。微生物降解石油烃的速率主要与微生物种类、数量及其介质的温度，石油组分的性质等有关，因此高效石油烃降解菌的分离、筛选，以及石油降解菌群的构建是生物法处理石油污染的关键。
此次试验，在7株石油降解菌中筛选出5株高效石油降解菌，通过组合菌株，得到由赤红球菌、鞘氨醇杆菌、无色杆菌高效石油降解菌群，通过一系列试验测得菌群的降解最优条件为：pH=7.0，培养温度为35 ℃，石油浓度为5 g/L。细菌最佳配比为，赤红球菌∶鞘氨醇杆菌∶无色杆菌=2∶1∶2。通过条件优化使得该菌降解率高达77.12%，有较高的研究价值和应用前景。
本实验目前只对菌株XS-2I的发酵条件进行了初步研究，对石油的降解机理以及具体效果还需要在后期的实际应用过程中进一步验证。
致谢：感谢华南理工大学生态修复实验室提供菌种。
参考文献：
[1]李贵珍， 赖其良， 闫培生，等. 海洋石油污染及其微生物修复研究进展[J]. 生物技术进展， 2015（3）：164-169
[2] Fathepure B Z. Recent studies in microbial degradation of petroleum hydrocarbons in hypersaline environments[J]. Frontiers in Microbiology， 2014， 5（2）：176-185
[3] Ayotamuno M J， Kogbara R B， Ogaji S O T， et al. Bioremediation of a crude-oil polluted agricultural-soil at Port Harcourt， Nigeria[J]. Applied Energy， 2006， 83（11）：1249–1257
[4] 陈维. 探究pH值对3种生物材料中过氧化氢酶活性的影响[J].生物学通报， 2014，49（6）：53-56
[5] 申圆圆. 土壤中石油污染物行为特征及植物根际修复研究[D].长安大学，2012
（收稿日期：2016-01-12；修回日期：2016-01-21）
关键词：石油；石油降解的复合菌群；降解率
石油泄漏造成环境污染，石油组分非常复杂，主要成分是烷烃、苯、甲苯和二甲苯等复杂芳香烃[1]。单一菌株很难将油污降解完全，因此，筛选石油降解复合菌群是非常必要的。
1 材料与方法
实验所用菌种苍白杆菌（Ochrobactrum sp.）、赤红球菌（Rhodococcus ruber）、不动杆菌（Acinetobacter sp.）以及铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）为实验室筛选。
菌种假单胞菌（Pseudomonas sp.）、鞘氨醇杆菌（Sphingomonas sp.）以及无色杆菌（Achromobacter sp.）来源于华南理工大学生态修复实验室。
供试石油取自唐海冀东油田。
1.1 高效石油降解菌的筛选
在已知可降解石油的细菌中通过测定石油降解菌周降解率，筛选出降解率较高的细菌作为石油降解菌群构建的菌种资源。
1.2 石油降解复合菌群的构建
将筛选出的石油降解菌用排列组合的方法进行组合，加入石油降解培养基中测定复合菌剂的周降解率。
1.3 高效石油降解复合菌群降油条件优化
利用正交试验分析方法对石油降解复合菌群中各个菌株的配比进行优化，并对其降解条件优化，条件包括培养温度、培养基初始pH值以及原油浓度。
2 结果与分析
2.1 筛选高效石油降解菌
将活化后的细菌6（苍白杆菌）、7（赤红球菌）、10（不动杆菌）、11（铜绿假单胞菌）、12（假单胞菌）、13（GY2B：鞘氨醇杆菌）以及14（GD1A：无色杆菌）加入到石油培养基中，用紫外分光光度法测量其周降解率，结果如图1所示。
赤红球菌对石油有很好的降解作用而且最早起作用。苍白杆菌、假单胞菌、GP3A、GY2B、GD1A等菌株对石油有很高的降解性能，但是11菌株-铜绿假单胞菌为致病菌株不予以使用，确定最终苍白杆菌、赤红球菌、GP3A、GY2B以及GD1A。
2.2 石油降解复合菌群的构建
将筛选得到的细菌通过排列组合的方法进行组合编号如表1，加入石油降解培养基后测量周降解率。
如图2结果表明，组合19石油降解率最高，达到70.32%，组合菌株包括：赤红球菌、GY2B和GD1A。
2.3 石油降解复合菌群降油条件优化
2.3.1 正交实验法选择复合菌群的最佳配比 如表2，正交设计实验中降解效果最好的菌种配比为赤红球菌∶GY2B∶CD1A=2∶1∶22.3.2 培养基温度对复合菌群降解石油的影响 对培养基温度的研究结果见图3，20～25 ℃培养石油降解率在35%～55%；在25～35 ℃培养时石油降解效率升高，到35 ℃达到峰值7132%；40 ℃降解效果明显下降。
培养温度对微生物降解原油的影响主要是表现在三个方面：影响石油烃的物理状态、化学组成和微生物本身的代谢活性[2]。25～30 ℃石油降解率较低，因为温度较低时，细菌活性受到限制，细菌本身及其代谢产物活性不大，对石油降解性能不高。30～35 ℃红球菌对石油降解效果显著升高，最大达到70%以上，说明在此温度范围内，细菌活性增加，石油状态也变得有利于细菌的分解。40 ℃时降解率下降可能因为温度超过了细菌的耐受范围，导致降解率下降。
2.3.3 培养基初始pH对复合菌群降解石油的影响 初始pH对于微生物生长代谢有着极其重要的作用，影响微生物细胞内的酶活性以及培养基营养状况[3]。如图4，对培养基的初始pH研究表明：pH值在5.0～7.0之间菌群的降解效率呈现上升趋势。在pH为7.0时降解效果最高达到77.12%；pH值大于7.0以后降解效果明显下降。初始pH对于微生物生长代谢有着极其重要的作用，影响微生物细胞内的酶活性以及培养基营养状况[4]。因此微生物只有在最佳pH值下才能进行良好的生长和代谢。该株赤红球菌降解石油的最佳pH值为7.0 。
2.3.4 石油浓度对复合菌群降解石油的影响 如图5，石油浓度对菌株的降解效果影响不如前两个指标剧烈，但可以看出在随着石油浓度增大，细菌的石油降解率呈先上升后下降的趋势，在石油浓度为5 g/L时降解效果最好，达到70%以上。
石油浓度是微生物代谢过程的一个重要因素，对微生物降解性能有一定影响[5]。石油浓度较低时，碳源不足，细菌生长缓慢，对石油降解效果不佳。随着石油浓度增加，碳源可以满足细菌生长，细菌的降解效果也随着增大，当石油浓度继续增大，开始抑制石油降解菌的活性，使得细菌对石油降解效果下降。
3 讨论与结论
生物降解法由于见效快、无残毒、低成本，逐渐成为目前国际上关于石油污染研究的重点。微生物降解石油烃的速率主要与微生物种类、数量及其介质的温度，石油组分的性质等有关，因此高效石油烃降解菌的分离、筛选，以及石油降解菌群的构建是生物法处理石油污染的关键。
此次试验，在7株石油降解菌中筛选出5株高效石油降解菌，通过组合菌株，得到由赤红球菌、鞘氨醇杆菌、无色杆菌高效石油降解菌群，通过一系列试验测得菌群的降解最优条件为：pH=7.0，培养温度为35 ℃，石油浓度为5 g/L。细菌最佳配比为，赤红球菌∶鞘氨醇杆菌∶无色杆菌=2∶1∶2。通过条件优化使得该菌降解率高达77.12%，有较高的研究价值和应用前景。
本实验目前只对菌株XS-2I的发酵条件进行了初步研究，对石油的降解机理以及具体效果还需要在后期的实际应用过程中进一步验证。
致谢：感谢华南理工大学生态修复实验室提供菌种。
参考文献：
[1]李贵珍， 赖其良， 闫培生，等. 海洋石油污染及其微生物修复研究进展[J]. 生物技术进展， 2015（3）：164-169
[2] Fathepure B Z. Recent studies in microbial degradation of petroleum hydrocarbons in hypersaline environments[J]. Frontiers in Microbiology， 2014， 5（2）：176-185
[3] Ayotamuno M J， Kogbara R B， Ogaji S O T， et al. Bioremediation of a crude-oil polluted agricultural-soil at Port Harcourt， Nigeria[J]. Applied Energy， 2006， 83（11）：1249–1257
[4] 陈维. 探究pH值对3种生物材料中过氧化氢酶活性的影响[J].生物学通报， 2014，49（6）：53-56
[5] 申圆圆. 土壤中石油污染物行为特征及植物根际修复研究[D].长安大学，2012
（收稿日期：2016-01-12；修回日期：2016-01-21）