【摘 要】
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目的 克隆屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)第十类变应原Der p 10基因,表达并纯化Derp 10重组蛋白,分析其免疫原性和生物学信息.方法 挑取经纯培养的屋尘螨,提取总RNA
【机 构】
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深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所,深圳518060;深圳大学第三附属医院变态反应科,深圳518001
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目的 克隆屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)第十类变应原Der p 10基因,表达并纯化Derp 10重组蛋白,分析其免疫原性和生物学信息.方法 挑取经纯培养的屋尘螨,提取总RNA,逆转录生成cDNA,RT-PCR扩增Derp 10基因.将pET-24a载体与Der p 10基因连接并转化入Top10克隆菌体中,经BamH I和Xho I双酶切鉴定和测序后转入大肠埃希菌BL21(DE3)中,1 mmol/L IPTG诱导后,采用12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白表达情况.经Ni+离子亲和层析纯化后,以尘螨过敏患者血清为一抗,蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫原性.使用ProtParam Tools、HNN、SWISS MODEL、DNAStar预测Der p 10的理化性质、原肌球蛋白的二级和三级结构、B细胞抗原表位,Blastp和MEGA工具构建Derp 10系统进化树.结果 RT-PCR获得目的基因Derp 10,其开放阅读框为855 bp,可编码284个氨基酸.双酶切结果显示Der p 10已连接至载体上.SDS-PAGE分析结果显示,Der p 10重组蛋白相对分子质量(Mr)为38 000,为可溶性蛋白.Western blotting分析结果显示,Der p 10重组蛋白与尘螨过敏患者血清反应呈阳性结果.信息学分析结果显示,Derp 10蛋白不稳定,二级结构和三级结构均以α-螺旋为主.DNAStar预测到Derp 10存在1个B细胞抗原表位肽序列.Blastp和MEGA分析结果显示,与粉尘螨Der f 10亲缘关系较近,序列相似性达94.4％.结论 成功构建Derp 10表达菌并纯化出与尘螨过敏患者血清中的IgE抗体结合较高及纯度较好的Derp 10重组蛋白并证实其反应原性.
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