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摘要：褐化很大程度上限制了蓖麻花药增殖培养研究，本研究通过改变蓖麻花药愈伤组织的培养基成分、添加防褐剂来建立高效增殖体系，最终确定蓖麻花药愈伤增殖最佳培养基为1/2MS+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L+NAA 0.3 mg/L+ZT 5.0 mg/L+脯氨酸750 mg/L+酸性水解酪蛋白750 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+维生素C 400 mg/L+活性炭 0.6 mg/L，pH值=5.8。
关键词：蓖麻；花药；愈伤组织增殖；防褐化
中图分类号： S565.604.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0046-02
收稿日期：2013-08-02
基金项目：国家自然科学基金（编号：31060194）。
作者简介：陈永胜（1971—），男，内蒙古通辽人，博士，教授，主要从事作物生物技术研究。Tel：（0475）8314624；E-mail：[email protected]。蓖麻（Ricinus communis L.）为一年生或多年生双子叶植物，其副产品多用于航空航天、化工、医药、农业等，市场潜力较大[1]。我国是蓖麻种植第二大国，但蓖麻新品种的开发一直处于落后水平，近年来才将现代生物技术应用于蓖麻育种[2-3]。蓖麻花药立体培养所得的植株都是纯系，自交后代不发生性状分离，在育种上有很高的应用价值。国内蓖麻花药培养研究起步较晚，且褐化一直是花药培养过程中的难题，主要表现外植体增殖、诱导初分化或是再分化过程中，自身组织会向培养基释放褐色物质导致培养基逐渐变褐，外植体也随之死亡[4-5]。褐化很大程度上限制了蓖麻花药离体培养的效率，除了本身基因型的差异外，可添加防褐物、调整培养基成分、改变培养环境等来防止褐化[6-7]。本研究通过改变蓖麻花药愈伤增殖过程中培养基条件、添加褐化抑制剂，以期有效降低褐化率，建立高质量的蓖麻花药培养体系。
1材料与方法
1.1试验材料
通蓖5号蓖麻花药，采自内蒙古民族大学试验农场。在温度较低、日照较弱时，取健壮无病植株上尚未张开且呈淡黄色的蓖麻花蕾。
1.2试验方法
1.2.1蓖麻花药愈伤组织诱导蓖麻花药愈伤组织诱导参照黄凤兰等研究成果[8-10]。4 ℃预处理花蕾5 d，流水冲洗30 min，无菌条件下用75%乙醇消毒30 s，HgCl2消毒2 min，无菌水冲洗5次，最后转至铺有滤纸的培养皿中。愈伤诱导培养基为：MS+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L+脯氨酸750 mg/L+NAA 0.9 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+酸性水解酪蛋白 750 mg/L+抗坏血酸100 mg/L，pH值=5.8。将3/5个花蕾花药均匀分至培养基表面进行愈伤组织诱导，约230个/瓶。
1.2.2愈伤组织增殖防褐化筛选筛选“1.2.1”节结果中直径为3 mm左右、淡绿色致密型的花药愈伤组织，进行防褐化筛选。每瓶培养基接种愈伤23粒，2次重复，15 d后统计褐化率、增殖率。（1）无机盐浓度筛选：筛选培养基中的无机盐浓度（MS、1/2 MS、1/4 MS、1/8 MS、1/16MS），建立适宜的愈伤组织增殖无机盐环境。（2）PGR条件筛选：筛选培养基中最佳激素NAA（01、0.3、0.5 mg/L）、ZT（3.0、5.0、7.0 mg/L）、6-BA（0、10、2.0 mg/L）浓度，以提高愈伤增殖的效率。（3）维生素C浓度筛选：添加不同浓度的防褐添加剂维生素C（0、200、400、600、800 mg/L），筛选最适维生素C浓度。（4）活性炭浓度筛选：添加不同浓度的防褐添加剂活性炭（0、03、0.6、0.9、1.2 g/L），筛选最适活性炭浓度。
1.2.3统计方法
1.2.3.1愈伤组织增殖率
愈伤组织增殖率=（m3-m2） -（m1-m0）/（m1-m0）×100%。
式中：m0为继代前培养基与培养容器质量；m1为继代后培养基、培养容器与愈伤组织质量；m2为第2次继代前培养基与培养容器质量；m3为第2次继代后培养基、培养容器与愈伤组织质量。
1.2.3.2愈伤组织褐化程度统计依次用“+”“++”“+++”“++++”“+++++”表示褐化程度，其中“+++++”褐化最严重；依次用“*”“**”“***”“****”调节褐化程度。
2结果与分析
2.1花药愈伤组织诱导结果
花药愈伤组织诱导结果如图1所示，其中多为浅绿色的致密型愈伤，且褐化不明显。选取其中直径为3 mm左右的愈伤组织进行增殖培养。
2.2愈伤组织增殖防褐化筛选结果
2.2.1无机盐浓度筛选结果由表1可知，当无机盐浓度为1/2MS时，愈伤增殖率高达29.06%；在各个无机盐浓度下，愈伤组织的褐化率变化不大。
3结论与讨论
褐化是蓖麻花药培养的主要限制因素，最初愈伤为棕黄色，转为深褐色后停止生长，最后逐渐死亡。本研究通过改变愈伤组织的培养基成分、添加防褐剂来建立高效蓖麻花药愈伤增殖体系，当添加400 mg/L维生素C、0.6 g/L活性炭时对增殖培养过程中的愈伤组织起到了积极的防褐作用。最终确定最佳培养基组合为1/2MS+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L+脯氨酸750 mg/L+酸性水解酪蛋白750 mg/L+NAA 0.3 mg/L+ZT 5.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+维生素C 400 mg/L+活性炭 0.6 mg/L，pH值=5.8。
维生素C可作为抗氧化剂阻止褐变的发生[11]，但目前维生素C降低愈伤组织褐化率的机理尚不明确，有待进一步研究。近年来对活性炭促进花药离体培养的报道较多[12-13]，当花药离体培养时，由于新陈代谢紊乱，会产生多种不利于生长或是有毒的酚类等物质，活性炭具有较强的吸附特性且无选择性，从而有利于花药培养进程[14]。但笔者发现，活性炭仅在一定浓度范围内降低愈伤组织的褐化程度；当超过一定浓度后，反而不利于愈伤组织生长和防褐化，可能是由于吸附了培养基中的生长调节物质，其中铁盐、维生素等与花药培养与分化密切相关。由于活性炭吸附的双重性，所以其调控花药愈伤生长及防褐化的作用也是双面的， 更应深入研究其最合 适的作用浓度，以建立更加快捷的蓖麻花药愈伤增殖培养方法。
参考文献：
[1]郑鹭，祁建民，陈绍军，等. 蓖麻遗传育种进展及其在生物能源与医药综合利用潜势[J]. 中国农学通报，2006，22（9）：109-113.
[2]陈永胜，王永佳，王莹，等. 蓖麻毒蛋白A链基因RNAi转化研究[J]. 西北植物学报，2013，33（1）：39-42.
[3]王文跃，李国瑞，黄凤兰，等. 蓖麻茎秆 cDNA-AFLP 反应体系的建立[J]. 华北农学报，2013，28（2）：86-90.
[4]代建丽，宋婵婵，徐晨，等. 库拉索芦荟组织培养褐化现象的抑制研究[J]. 安徽农学通报，2013，19（6）：23-24.
[5]郑颖，秦红玫，黎云祥. 台湾桤木组织培养中污染和褐化的防止[J]. 江苏农业科学，2013，41（2）：64-65，117.
[6]徐耀华，杨春华，刘晓波，等. 扁穗牛鞭草组织培养中褐化控制技术初探[J]. 草业科学，2013，30（2）：212-217.
[7]杨亚萍，郑新强. 茶树组织培养中的褐化控制研究[J]. 茶叶，2013，39（1）：3-7.
[8]黄凤兰，萨日娜，孟凡娟，等. 蓖麻花药愈伤组织诱导的研究[J]. 作物杂志，2009（6）：59-63，后插1.
[9]邵志敏，陈永胜，黄凤兰，等. 低温预处理与光照条件对蓖麻花药愈伤组织诱导的影响[J]. 内蒙古民族大学学报：自然科学版，2012，27（2）：189-193.
[10]李国瑞，黄凤兰，王文跃，等. 蓖麻花药愈伤组织诱导条件优化[J]. 内蒙古民族大学学报：自然科学版，2012，27（6）：670-673.
[11]刘强，张春庆，巩东营. 玉米花药培养中影响褐变的几个因素的初步研究[J]. 玉米科学，2005，13（1）：39-40，43.
[12]钱春艳，曹有龙，段安安，等. 枸杞花药培养若干影响因子的研究[J]. 江苏农业科学，2010（6）：76-78.
[13]Gland A，Lichter R，Schweiger H G. Genetic and exogenous factors affecting embryogenesis in isolated microspore cultures of Brassica napus L.[J]. Journal of Plant Physiology，1988，132（5）：613-617.
[14]Johansson L B，Calleberg E，Gedin A. Correlations between activated charcoal，Fe-EDTA and other organic media ingredients in cultured anthers of Anemone canadensis[J]. Physiologia Plantarum，1990，80（2）：243-247.
关键词：蓖麻；花药；愈伤组织增殖；防褐化
中图分类号： S565.604.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0046-02
收稿日期：2013-08-02
基金项目：国家自然科学基金（编号：31060194）。
作者简介：陈永胜（1971—），男，内蒙古通辽人，博士，教授，主要从事作物生物技术研究。Tel：（0475）8314624；E-mail：[email protected]。蓖麻（Ricinus communis L.）为一年生或多年生双子叶植物，其副产品多用于航空航天、化工、医药、农业等，市场潜力较大[1]。我国是蓖麻种植第二大国，但蓖麻新品种的开发一直处于落后水平，近年来才将现代生物技术应用于蓖麻育种[2-3]。蓖麻花药立体培养所得的植株都是纯系，自交后代不发生性状分离，在育种上有很高的应用价值。国内蓖麻花药培养研究起步较晚，且褐化一直是花药培养过程中的难题，主要表现外植体增殖、诱导初分化或是再分化过程中，自身组织会向培养基释放褐色物质导致培养基逐渐变褐，外植体也随之死亡[4-5]。褐化很大程度上限制了蓖麻花药离体培养的效率，除了本身基因型的差异外，可添加防褐物、调整培养基成分、改变培养环境等来防止褐化[6-7]。本研究通过改变蓖麻花药愈伤增殖过程中培养基条件、添加褐化抑制剂，以期有效降低褐化率，建立高质量的蓖麻花药培养体系。
1材料与方法
1.1试验材料
通蓖5号蓖麻花药，采自内蒙古民族大学试验农场。在温度较低、日照较弱时，取健壮无病植株上尚未张开且呈淡黄色的蓖麻花蕾。
1.2试验方法
1.2.1蓖麻花药愈伤组织诱导蓖麻花药愈伤组织诱导参照黄凤兰等研究成果[8-10]。4 ℃预处理花蕾5 d，流水冲洗30 min，无菌条件下用75%乙醇消毒30 s，HgCl2消毒2 min，无菌水冲洗5次，最后转至铺有滤纸的培养皿中。愈伤诱导培养基为：MS+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L+脯氨酸750 mg/L+NAA 0.9 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+酸性水解酪蛋白 750 mg/L+抗坏血酸100 mg/L，pH值=5.8。将3/5个花蕾花药均匀分至培养基表面进行愈伤组织诱导，约230个/瓶。
1.2.2愈伤组织增殖防褐化筛选筛选“1.2.1”节结果中直径为3 mm左右、淡绿色致密型的花药愈伤组织，进行防褐化筛选。每瓶培养基接种愈伤23粒，2次重复，15 d后统计褐化率、增殖率。（1）无机盐浓度筛选：筛选培养基中的无机盐浓度（MS、1/2 MS、1/4 MS、1/8 MS、1/16MS），建立适宜的愈伤组织增殖无机盐环境。（2）PGR条件筛选：筛选培养基中最佳激素NAA（01、0.3、0.5 mg/L）、ZT（3.0、5.0、7.0 mg/L）、6-BA（0、10、2.0 mg/L）浓度，以提高愈伤增殖的效率。（3）维生素C浓度筛选：添加不同浓度的防褐添加剂维生素C（0、200、400、600、800 mg/L），筛选最适维生素C浓度。（4）活性炭浓度筛选：添加不同浓度的防褐添加剂活性炭（0、03、0.6、0.9、1.2 g/L），筛选最适活性炭浓度。
1.2.3统计方法
1.2.3.1愈伤组织增殖率
愈伤组织增殖率=（m3-m2） -（m1-m0）/（m1-m0）×100%。
式中：m0为继代前培养基与培养容器质量；m1为继代后培养基、培养容器与愈伤组织质量；m2为第2次继代前培养基与培养容器质量；m3为第2次继代后培养基、培养容器与愈伤组织质量。
1.2.3.2愈伤组织褐化程度统计依次用“+”“++”“+++”“++++”“+++++”表示褐化程度，其中“+++++”褐化最严重；依次用“*”“**”“***”“****”调节褐化程度。
2结果与分析
2.1花药愈伤组织诱导结果
花药愈伤组织诱导结果如图1所示，其中多为浅绿色的致密型愈伤，且褐化不明显。选取其中直径为3 mm左右的愈伤组织进行增殖培养。
2.2愈伤组织增殖防褐化筛选结果
2.2.1无机盐浓度筛选结果由表1可知，当无机盐浓度为1/2MS时，愈伤增殖率高达29.06%；在各个无机盐浓度下，愈伤组织的褐化率变化不大。
3结论与讨论
褐化是蓖麻花药培养的主要限制因素，最初愈伤为棕黄色，转为深褐色后停止生长，最后逐渐死亡。本研究通过改变愈伤组织的培养基成分、添加防褐剂来建立高效蓖麻花药愈伤增殖体系，当添加400 mg/L维生素C、0.6 g/L活性炭时对增殖培养过程中的愈伤组织起到了积极的防褐作用。最终确定最佳培养基组合为1/2MS+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L+脯氨酸750 mg/L+酸性水解酪蛋白750 mg/L+NAA 0.3 mg/L+ZT 5.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+维生素C 400 mg/L+活性炭 0.6 mg/L，pH值=5.8。
维生素C可作为抗氧化剂阻止褐变的发生[11]，但目前维生素C降低愈伤组织褐化率的机理尚不明确，有待进一步研究。近年来对活性炭促进花药离体培养的报道较多[12-13]，当花药离体培养时，由于新陈代谢紊乱，会产生多种不利于生长或是有毒的酚类等物质，活性炭具有较强的吸附特性且无选择性，从而有利于花药培养进程[14]。但笔者发现，活性炭仅在一定浓度范围内降低愈伤组织的褐化程度；当超过一定浓度后，反而不利于愈伤组织生长和防褐化，可能是由于吸附了培养基中的生长调节物质，其中铁盐、维生素等与花药培养与分化密切相关。由于活性炭吸附的双重性，所以其调控花药愈伤生长及防褐化的作用也是双面的， 更应深入研究其最合 适的作用浓度，以建立更加快捷的蓖麻花药愈伤增殖培养方法。
参考文献：
[1]郑鹭，祁建民，陈绍军，等. 蓖麻遗传育种进展及其在生物能源与医药综合利用潜势[J]. 中国农学通报，2006，22（9）：109-113.
[2]陈永胜，王永佳，王莹，等. 蓖麻毒蛋白A链基因RNAi转化研究[J]. 西北植物学报，2013，33（1）：39-42.
[3]王文跃，李国瑞，黄凤兰，等. 蓖麻茎秆 cDNA-AFLP 反应体系的建立[J]. 华北农学报，2013，28（2）：86-90.
[4]代建丽，宋婵婵，徐晨，等. 库拉索芦荟组织培养褐化现象的抑制研究[J]. 安徽农学通报，2013，19（6）：23-24.
[5]郑颖，秦红玫，黎云祥. 台湾桤木组织培养中污染和褐化的防止[J]. 江苏农业科学，2013，41（2）：64-65，117.
[6]徐耀华，杨春华，刘晓波，等. 扁穗牛鞭草组织培养中褐化控制技术初探[J]. 草业科学，2013，30（2）：212-217.
[7]杨亚萍，郑新强. 茶树组织培养中的褐化控制研究[J]. 茶叶，2013，39（1）：3-7.
[8]黄凤兰，萨日娜，孟凡娟，等. 蓖麻花药愈伤组织诱导的研究[J]. 作物杂志，2009（6）：59-63，后插1.
[9]邵志敏，陈永胜，黄凤兰，等. 低温预处理与光照条件对蓖麻花药愈伤组织诱导的影响[J]. 内蒙古民族大学学报：自然科学版，2012，27（2）：189-193.
[10]李国瑞，黄凤兰，王文跃，等. 蓖麻花药愈伤组织诱导条件优化[J]. 内蒙古民族大学学报：自然科学版，2012，27（6）：670-673.
[11]刘强，张春庆，巩东营. 玉米花药培养中影响褐变的几个因素的初步研究[J]. 玉米科学，2005，13（1）：39-40，43.
[12]钱春艳，曹有龙，段安安，等. 枸杞花药培养若干影响因子的研究[J]. 江苏农业科学，2010（6）：76-78.
[13]Gland A，Lichter R，Schweiger H G. Genetic and exogenous factors affecting embryogenesis in isolated microspore cultures of Brassica napus L.[J]. Journal of Plant Physiology，1988，132（5）：613-617.
[14]Johansson L B，Calleberg E，Gedin A. Correlations between activated charcoal，Fe-EDTA and other organic media ingredients in cultured anthers of Anemone canadensis[J]. Physiologia Plantarum，1990，80（2）：243-247.