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摘要：利用形态特征与RAPD分析技术，分析了国内不同地区的24份普通白菜（Brassica campestris L.ssp.chinensis （L.） Makino var.communis Tsee et Lee.）种质的遗传多样性.结果表明，13个形态学性状的变异系数为12.4%～69.9%，其中叶柄变异最大，子叶变异最小.24份普通白菜材料在形态学聚类的距离5处聚为4类.利用筛选出的15条RAPD引物从24份普通白菜材料中共扩增出113条带，其中多态性条带83条，多态率73.4%，平均每条引物条带7.53条、多态性条带5.53条.RAPD数据聚类在相似系数0.77处，分为8类，与形态聚类间有重叠和细分.以形态聚类4个类别计算的Nei′s基因多样性指标H和Shannon信息指数I，均为第Ⅳ大类>第Ⅰ大类>第Ⅲ大类>第Ⅱ大类，第Ⅳ类的H和I分别为0.2395和0.3523.而不同地区则以江淮地区的Nei′s基因多样性H和Shannon信息指数I最高，分别为0.2076和0.3098.这些结果与普通白菜种质资源多样性特征以及地区分布相吻合.
关键词：普通白菜； 形态特征； RAPD分析； 聚类分析
中图分类号： S 634.3 文献标志码： A 文章编号： 10005137（2015）06058508
普通白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis （L.） Makino var. communis Tsee et Lee.）为十字花科芸薹属芸薹种小白菜（不结球白菜）亚种的一个主要变种[1-2]，属异花授粉作物.授粉方式多样，变种内、种内和种间杂交广泛，因此，经长期选择，就产生了复杂变异，形成了丰富的品种资源，表现为形态、习性、生态适应性上的差异类型[3-4]；此外，不同生态环境下栽培，也可形成不同的群体[5].为此，不结球白菜分类一直存在着广泛的争议，也使得品种繁多的普通白菜种质资源的收集和整理存在一定难度，尤其是同种异名和同名异种的种质更加难以确定其类别和地位.因此，进行普通白菜种质资源的鉴定对种质的收集和保存意义重大.
种质鉴定方法有形态学方法和分子标记技术两种类型[6-9]，形态学方法易受栽培技术和季节变化等影响，准确性不高；分子标记技术直接以DNA形式表现，有稳定、快速、准确的特点[9-10]，已被广泛用于紫珠[11]、温郁金[12]、菠萝[13]、油茶[14]、芹菜[15]、不结球白菜[16]等不同植物的种质鉴定、遗传多样性分析和图谱构建.目前在不结球白菜上进行分子标记取得了一定进展[16-18]，侯喜林[19-21]等对我国南方广泛种植的普通白菜、塌菜等不少品种进行了亲缘关系分析.宋廷宇[22]等对濒于灭绝的薹菜进行了RAPD和SSR分析，以保护正在流失的种质资源.尽管前人已做了不少工作，但目前市场上品种混杂现象严重，尤其是同名异种或异种同名现象非常普遍，因此进行品种鉴定以理清品种间的亲缘关系显得十分必要.本研究结合形态学性状和RAPD分子标记，对产自我国不同地区的不同类型的24份普通白菜种质，进行变种内亲缘关系的分析，以期为普通白菜种质资源收集、保存、利用提供依据，也为已建成的普通白菜种质资源库[23]的修订以及正在创建的不结球白菜种质数据库提供正确信息.
1 材料与方法
1.1 植物材料
参试的普通白菜材料共计24份（表1），分别标记为1～24，全部为市场购买.品种选择考虑了产地、形态特征、播期等因素，尽量在适宜播期内，品种的分布范围尽可能代表普通白菜在国内的分布区域，形态上要将各种特征包含在内，如株型、叶色等.种子产地包括华东、华北、西北、华中、华南等地区的13个省份；株高有矮箕、中梗和高梗之分；叶色有墨绿、绿、浅绿类型；叶面有光滑、皱缩和带毛类型.试验分2012年和2013年2个年度进行，其中2012年为预备实验.播种时间分别为2012年10月8日、2013年10月11日，露地穴播，穴距20 cm×15 cm，二叶一心期定植.小区面积9 m2，重复2次.正常田间管理.
1.2 试验方法
1.2.1 形态特征调查
在正常收获期（2013年为1月10日，2014年为1月14日），调查24个品种的叶长、叶柄长、叶宽、叶柄宽、叶厚、叶柄厚、冠幅、株高、莲座叶数等数量性状和株型、叶形、叶缘、叶面、叶色、叶柄色等质量性状.每个小区取5株代表性的植株调查，重复2次.调查标准参照[3]进行.数量性状数据按2年平均，质量性状取2年相同的表现.
1.2.2 RAPD分子标记操作
1.2.2.1 DNA提取
采用CTAB法提取.所用嫩叶取自2013年的田间植株，完成品种田间形态调查后，每份材料选取1～2 g嫩叶，放入冰盒中，迅速带回实验室，置冰箱中保存，备用.
取适量（比指甲盖稍大）叶片放入EP管，加适量石英砂，再加300 μL PVP+CTAB的混合液，研磨到看不见组织后，又加300 μL上述混合液研磨.在通风橱中加入6 μL 巯基乙醇后，65 ℃水浴1 h（每隔15～20 min摇1次）.水浴后，加600 μL 苯酚-氯仿（1∶1）混合液，4 ℃ 12000 r/min离心20 min，分层.取上清液于EP管，轻摇，相同条件下离心.上清液移入约1 mL无水乙醇的EP管中，混匀，-20 ℃冰箱处理30～60 min，取出，4 ℃离心.倒去上清液，加600 μL 75%乙醇，4 ℃ 12000 r/min离心10 min.去掉上清液，残液留到纸上，45～50 ℃烘干，10～15 min，无乙醇味道止.残渣加40 μL无菌水溶解，再加0.8 μL的RNAse，37 ℃水浴30 min，获得DNA提取液，-20 ℃冰箱保存.电泳和紫外分光光度计检测DNA的纯度和浓度. 1.2.2.2 PCR扩增
本试验所用120条引物和生化试剂全部购自上海生物工程有限公司，引物按[18]的方法筛选，PCR体系和程序采用史公军等[19]的方法.PCR反应体系25 μL，10×buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.9 μL，60 ng DNA模板1 μL，不足用ddH2O补足.PCR循环程序为：94 ℃变性2 min，37 ℃复性30 s，72 ℃延伸50 s，2个循环；94 ℃变性45 s，37 ℃复性30 s，72 ℃延伸50 s，18个循环；72 ℃延伸5 min，94 ℃变性45 s，37 ℃复性30 s，72 ℃延伸50 s，25个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存.扩增结束后，取产物10 μL，加溴酚蓝指示剂，混匀后上样电泳，1xTBE电泳缓冲液，1.6%琼脂糖凝胶，EB1 μg/mL，在凝胶60 ℃左右加入.电压100 V，时间2 h.电泳结束后，取出胶，在FR200紫外可见图像分析仪中观察、拍照和记录.
1.3 数据处理
1.3.1 形态数据
将田间采集的15项形态性状数据分成2种，其中数量性状计算实测值的平均值，质量性状按[6]进行赋值处理和数量化，并用SPSS 19.0软件对数量化的性状进行多样性分析和Q型聚类分析.
1.3.2 RAPD数据
统计分子量在200～3000 bp DNA的条带，电泳图谱上选择清晰、稳定、重复性好的条带记为1，相同位置缺失的记为“0”，将数据输入计算机，形成0/1矩阵.利用软件NTSYSpc2.1e版分析0/1矩阵，SIMQUAL程序计算相似系数，UPGMA法聚类分析，生成树状图[10].
2 结果分析
2.1 形态特征分析
24份普通白菜品种的13份数量性状多样性分析显示（表2），数量性状的变异系数为12.4%～69.9%，性状多样性表现较为丰富.变异由高到低的排列为叶柄长、单株重、叶长、子叶凹槽深、叶宽、叶柄宽、株幅、腰粗、菜头粗、莲座叶数、子叶宽、子叶长.其中叶柄长的变异系数最大，达69.9%，说明该性状变化较大，田间表现也支持了这一结果.性状变异最小的为子叶长和宽，说明各子叶期品种差异最小.
利用表2数据生成的Q型聚类分析树状图（图1）表明，在距离5处，24个品种分为4类，第一类10个品种，为5，17，9，18，6，24，1，2，21，15号，其中5，17，9，18号可归为一小类，6，24，1，2，21，15号归为另一小类.这类植株较矮，叶卵圆或近圆，株型开展或半直立.第二类仅7，22号2个品种.该类植株较高，叶窄细长，叶披针形，株型开展.第三类为8，23，3，4，11号5个品种，其中8，23号；3，4号；11号有属不同小类.这类株高冠幅适中，叶长叶宽适中，半直立或直立株型.第四类为10，20，16，19，13，14，12号7个品种，其中10，20号与后5个品种归为不同小类.这类冠幅大，叶阔长，株型开展或半塌地.从采集地区来看，不同的类别与地域关系不大.上述聚类结果与24个品种的田间长势较为吻合.
2.2 不同类型普通白菜的RAPD分析
2.2.1 不同类型普通白菜RAPD引物扩增多态性
筛选出的15个RAPD随机引物在24份普通白菜间共扩增出113条带，其中多态性带83条，多态性比率为73.4%，平均每条引物扩增出7.53条和5.53个多态性条带.产生条带最少的是引物S306和s1041，只有50%，最多的是引物S2001，比例为100% （表3，图2）.
2.2.2 不同类型普通白菜的遗传多样性
遗传多样性是衡量种群变异和分布范围的重要指标，通常用Nei′s基因多样性指标H和Shannon信息指数I来表示.按照普通白菜形态性状聚类分成的Ⅰ～Ⅳ个普通白菜类型来计算15个引物扩增后的Nei′s和Shannon指数，其结果表明，H和I两个指数均呈现相同特点，都是第Ⅳ大类>第Ⅰ大类>第Ⅲ大类>第Ⅱ大类（表4）.这就说明普通白菜形态性状的主要类型，即第Ⅳ大类和第Ⅰ大类包含的17个品种，其等位基因的离散程度大，某一扩增产物的存在频率大，遗传多样性复杂.同时，该结果也与市场上这两类普通白菜品种变异多，数量庞大高度吻合.
2.2.3 不同地区普通白菜的遗传多样性
普通白菜原产于中国，但在中国却存在着明显的地域性特点.以24份试验品种的产地来源进行的遗传多样性分析表明，15个引物扩增后计算的Nei′s和Shannon指数，江淮地区的普通白菜最大，其次为华中地区，最小为新疆（表5）.这一结果与普通白菜的区域分布一致.从收集到的分布于全国各区域的313份（数据未全给出，本研究的24份是其中一部分）普通白菜种质资源来看，江淮流域（主要统计江苏、浙江、上海和安徽四省市）占45%，华中三省占11.2%，东北0.6%，新疆占0.9%，西北也只占4.7%.因此，普通白菜的遗传多样性在江淮地区最高，西北东北地区最低.
2.2.4 不同类型普通白菜的聚类分析
由RAPD数据矩阵，经软件分析获得的UPMGA聚类树状图（图3），图3中可以看出，供试的24个普通白菜品种的遗传相似性系数在0.69～0.89间，表明普通白菜的遗传相似性较高.在相似系数为0.77处，24份普通白菜材料分为8个大类.第一类包括19号，第二类16号，第三类10号，第四类为13号、14号，第五类12号，第六类3号，第七类包括10个品种，分别为4、5、24、7、21、22、9、18、15、17号，而该大类在相似系数0.785处，又分成2个亚类，第一亚类为4、5和24号，第二亚类为7、21、22、9、18、15和17号.第八类1、2、11、20、6、8和23号，该大类在相似系数0.815处，分为8、23号和1、2、11、20号2个亚类，且1和2的相似性很大.显然，与24个品种的形态性状聚类分析结果相比，RAPD数据的聚类结果更详细，其中一致性比较好的是形态聚类的第Ⅰ类和RAPD的第七类，2个类中有7个品种是相同的，分别是5，17、9、18、24、24、15，而形态聚类的第Ⅱ类的7、22，在RAPD聚类中聚到了第七类中.第Ⅲ类与第八类有3个是相同的，分别是8、11和23.可见形态聚类与遗传分析聚类间有较大的一致性，但后者更为详细和准确. 3 讨 论
利用各种分子标记，并结合形态学特征分析来鉴定种间或变种间的亲缘关系和遗传多样性，已在不少植物种质上得到了广泛应用[24-26]，尤其是变种繁多的不结球白菜上[3，5-6，10].虽然在同种或变种的不同品种间的分子鉴定不多，但也取得了一定成功，陈素娟等利用SRAP、RAPD和SSP鉴定了12个普通白菜的亲缘关系，得到了遗传距离很近的结论[27]；杜黎明等利用ISSR技术鉴定了65个白菜品种的遗传多样性，相似系数为0.40～0.65[28].此外，在其他作物如小麦[29]、石榴[30]、菠萝[13]、荸荠[31]也得到了应用.这些成果较好地支持了本研究的结论.普通白菜是不结球白菜5个变种的最大变种，品种繁多，自然变异造成的种质关系非常复杂；此外，制种单位又多，信息沟通不够畅通，同名异种、异名同种的现象普遍存在.这些情况不仅使种子真实性受到质疑，也给种质收集和保存、种质利用和创新，以及种质资源数据库的建设带来困难.
本研究对24份不同地区的普通白菜种质，在形态鉴定基础上，利用RAPD分子标记技术，研究了种质间的亲缘关系，虽然样本群体有限，但其结果显示了形态与分子鉴定在大多数情况下，鉴定结果一致，可相互印证提高真实性；但也存在不一致性，表现为有些种质在表型性上相似，形态学方法聚为一类，但RAPD分子标记发现关系较远，如20号与10、16和19号在形态聚类中距离较近，而在RAPD聚类中相似系数则较小，显示出分子水平上的较大遗传差异.而有些种质在形态学上距离较远，分属两个大类，但RAPD分子标记发现遗传背景相近，属一类，如21、7、22号种质.可见，由于RAPD标记的是稳定的DNA，较之形态鉴定的结果更为可靠.前人研究成果也较好地支持了亲缘关系鉴定可采用形态与分子鉴定相结合的手段，而分子鉴定更为准确的结论[5-6，24-26].
参考文献：
[1]TAN J J.A study on the origin and classification of Brassica vegetables[J].Journal of Agricultural University of Hebei，1980，4（1）：104-114.
[2]LIN W S.A study on the classification of Chinese cabbages[J].Acta Horticulturae Sinica，1980，7（2）：21-28.
[3]HAN J M.Genetic diversity and model analysis of germplasm and cloning of bcDREB2 gene fragement in nonhending Chinese cabbage[D].Nanjing：Nanjing Agricultural University，2007.
[4]HOU X L，SONG X M.Research and utilization of Brassica campestris ssp.chinensis Makino （nonheading Chinese cabbage）[J].Journal of Nanjing Agricultural University，2012，35（5）：35-42.
[5]YU S H，LI L F，YU X Y，et al.Cluster analysis of local varieties of Chinese cabbage in coastal area of Zhenjiang province based on morphological and agronomical traits[J].Acta agriculturae Zhengjiangensis，2013，25（2）：241-247.
[6]HAN J M，HOU X L，XU H M，et al.Morphological diversity of nonheading cabbage （Brassica campestris ssp.chinensis Makino）[J].Journal of Biomathematics，2010，（1）：137-146.
[7]XU Y D，PEI D，MA D G，et al.The application of genetic markers in the study of malnut genetic diversity[J].Chinese Agricultural Science Bulletin，2014，30（13）：1-5.
[8]GAO W J，XIAO L H，LU L T，et al.Analysis of sexrelated isozyme marker in dioecious spinacia oleracea[J].Journal of Henan normal University （Natural Science），2006，34（4）：147-150.
[9]WILLIAMS J G K，KUBELIK A R.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].Nucleic Acids Res，1990，18：6531-6535.
[10]LIN J L，ZHU Z G，WANG J C，et al.Relatives analysis of cabbage germplasm resources by RAPD[J].Acta agriculture BoreauSinica，2008，23（Suppl.）：183-189. [11]YANG X G，GU Z X，LU J，et al.Polymorphisim of four kinds of medicinal plants callicarpa Linn by RAPD[J].AsiaPacific Traditional Medicine，2015，11（7）：28-31.
[12]TAO Y L，WANG Z Y，DING W Y，et al.The genetic diversity of the populations of Culcuma wenyujin by RAPD analysis[J].Journal of Shaoxing University，2013，33（9）：53-57，94.
[13]WANG J S，HE J H，CHEN H R，et al.Genetic diversity analysis of forty seven pineapple [Ananas comosus （L.） Merr]germplasm with RAPD marker[J].Chinese Journal of Tropical Crops，2015，36（8）：1392-1397.
[14]KAO A D，WANG S G，WANG Y Q，et al.Analyses of genetic diversity among 65 wild Camellia oleifera based on ISSR and RAPD[J].Guihaia，2014，34（3）：419-425.
[15]WU Q S，MA J H，WU J X，et al.Genetic diversity analysis of celery by RAPD marker[J].Journal of Shanxi agricultural Sciences，2013，41（8）：774-777.
[16]CHENG Y，GENG J F，ZHANG J Y，et al.The construction of a genetic linkage map of nonheading Chinese cabbage （Brassica campestris ssp.chinensis Makino）[J].J Genet Genomics，2009，36：501-508.
[17]GENG J F，ZHU C S，ZHANG X W，et al.A genetic linkage map of nonheading Chinese cabbage[J].J Am Soc Hort Sci，132：816-823.
[18]HAN J M，HOU X L，XU H M，et al.RAPD analysis of genetic diversity of nonheading cabbage （Brassica campestris ssp.chinensis Makino） germplasm[J].Journal of Nanjing Agricultural University，2008，31（3）：31-36.
[19]DENG X H，ZHANG S N，HOU X L.et al.Analysis and identification of RAPD molecular markers linked to Pol CMS line and its maintainer line of nonheading Chinese cabbage[J].Journal of Nanjing Agricultural University，2007，30（1）：19-22.
[20]SHAN X Z，LI Y，GAO S Y，et al.Molecular genetic map of Brassica campestris ssp.chinensis[J].Acta Bot Boreal.occident sin.，2009，29（6）：1116-112.
[21]ZHENG Z C，HOU X L.Indentication of AFLP fingerprint of dwarf resistant No.6 of nonheading Chinese cabbage[J].Jiangsu Agricultural Science，2004（1）：63-64.
[22]SONG T Y，WU C Y，HOU X L，et al.Studies on germplasm resources of Taitsai using RAPD and ISSR markers[J].Journal of Northwest A & F University （Nat.Sci.ED），2012，40（6）：161-174.
[23]SONG Y Q，WU J H，PAN J X.Application of packchoi variety resource database system[J].China Vegetables，2013（22）：81-87.
[24]WU Y.The study of agronomic traits and genome RAPD on Medicago Falcata L.germplasm[D].Beijing：Chinese Acaademy of Agricultural Science，2005.
[25]ZHU Y F，ZHU S J，LI Y P，et al.Application of ISSR molecular marker in plant germplasm[J].Seed，2010，29（2）：55-59. [26]SAI L.The application of DNA molecular marker technique of Lycoris ornamental plants[J].Seed，2012，31（3）：55-59.
[27]CHEN S J，SONG C H，ZHI X，et al.Molecular fingerprint of major Brassica campestris ssp.chinensis cultivars[J].Guizhou Agriculture Science，2014，12（11）：5-9.
[28]DU L M，HU T H，BAO C L，et al.Genetic diversity and relatives analysis of pakchoi germplasm based on intersimple sequence[J].Chinese Agricultural Science Bulletin，2009，25（11）：20-24.
[29]LIU Y H，ZHAO X Y，YAN W X，et al.Agronomic traits and wheat leaf rust resistance of ten Turkey wheat accessions[J].Acta Agriculturae Borealisinic，2012，27（1）：193-200.
[30]MA L，MA Y H，HAO Z X，et al.Genetic relationship analysis of 38 punica garanatu L.cultivars based on RAPD markers[J].Northern Horticulture，2014（09）：101-105.
[31]JIANG W，CAI B H，CHEN L J，et al.Genetic diversity analysis of 24 water chestnut （Eleocharis tuberrosa schulut） cultivars using RAPD markers[J].J of Sourthern Agriculture，2012，43（7）：859-900.
Abstract：The genetic diversity of 24 accessions of pakchoi（Brassica campestris L. ssp. chinensis （L.） Makino var. communis Tsee et Lee.） from different districts of China was identified by morphological characters and RAPD analysis.The results showed that the coefficient of variation of 13 morphological characters of materials was from 12.4% to 69.9%，the most was petiole length，and the least cotyledon.24 accessions were clustered into 4 groups at the distance of 5 in morphological cluster.113 bands were detecteded by15 RAPD primers，and 83 were polymorphic.The percentage of polymorphic bands was 73.4%，and the number of average and polymorphic bands each primer were 7.53 and 5.53 respectively.In RAPD analysis，8 groups at the genetic distance of 0.77 were obtained based on RAPD data.There were the overlaps and segmentation between the results of RAPD and morphological cluster.Nei′s diversity （H）and Shannon information index （I） based on 4 types of morphological analysis were both the order of Ⅳ>Ⅰ>Ⅲ>Ⅱ，and H and I of Ⅳ were 0.2395 and 0.3523 respectively.H and I of Jianghui area were the highest in China，being 0.2076 and 0.3098 respectively.These data were in accordance with the diversity characteristics and rejoin distribution of pakchoi germplasms.
Key words：Brassica campestris L. ssp. chinensis （L.） Makino var. communis Tsee et Lee.； Morphological characters； RAPD analysis； Clustering analysis
（责任编辑：顾浩然，包震宇）
关键词：普通白菜； 形态特征； RAPD分析； 聚类分析
中图分类号： S 634.3 文献标志码： A 文章编号： 10005137（2015）06058508
普通白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis （L.） Makino var. communis Tsee et Lee.）为十字花科芸薹属芸薹种小白菜（不结球白菜）亚种的一个主要变种[1-2]，属异花授粉作物.授粉方式多样，变种内、种内和种间杂交广泛，因此，经长期选择，就产生了复杂变异，形成了丰富的品种资源，表现为形态、习性、生态适应性上的差异类型[3-4]；此外，不同生态环境下栽培，也可形成不同的群体[5].为此，不结球白菜分类一直存在着广泛的争议，也使得品种繁多的普通白菜种质资源的收集和整理存在一定难度，尤其是同种异名和同名异种的种质更加难以确定其类别和地位.因此，进行普通白菜种质资源的鉴定对种质的收集和保存意义重大.
种质鉴定方法有形态学方法和分子标记技术两种类型[6-9]，形态学方法易受栽培技术和季节变化等影响，准确性不高；分子标记技术直接以DNA形式表现，有稳定、快速、准确的特点[9-10]，已被广泛用于紫珠[11]、温郁金[12]、菠萝[13]、油茶[14]、芹菜[15]、不结球白菜[16]等不同植物的种质鉴定、遗传多样性分析和图谱构建.目前在不结球白菜上进行分子标记取得了一定进展[16-18]，侯喜林[19-21]等对我国南方广泛种植的普通白菜、塌菜等不少品种进行了亲缘关系分析.宋廷宇[22]等对濒于灭绝的薹菜进行了RAPD和SSR分析，以保护正在流失的种质资源.尽管前人已做了不少工作，但目前市场上品种混杂现象严重，尤其是同名异种或异种同名现象非常普遍，因此进行品种鉴定以理清品种间的亲缘关系显得十分必要.本研究结合形态学性状和RAPD分子标记，对产自我国不同地区的不同类型的24份普通白菜种质，进行变种内亲缘关系的分析，以期为普通白菜种质资源收集、保存、利用提供依据，也为已建成的普通白菜种质资源库[23]的修订以及正在创建的不结球白菜种质数据库提供正确信息.
1 材料与方法
1.1 植物材料
参试的普通白菜材料共计24份（表1），分别标记为1～24，全部为市场购买.品种选择考虑了产地、形态特征、播期等因素，尽量在适宜播期内，品种的分布范围尽可能代表普通白菜在国内的分布区域，形态上要将各种特征包含在内，如株型、叶色等.种子产地包括华东、华北、西北、华中、华南等地区的13个省份；株高有矮箕、中梗和高梗之分；叶色有墨绿、绿、浅绿类型；叶面有光滑、皱缩和带毛类型.试验分2012年和2013年2个年度进行，其中2012年为预备实验.播种时间分别为2012年10月8日、2013年10月11日，露地穴播，穴距20 cm×15 cm，二叶一心期定植.小区面积9 m2，重复2次.正常田间管理.
1.2 试验方法
1.2.1 形态特征调查
在正常收获期（2013年为1月10日，2014年为1月14日），调查24个品种的叶长、叶柄长、叶宽、叶柄宽、叶厚、叶柄厚、冠幅、株高、莲座叶数等数量性状和株型、叶形、叶缘、叶面、叶色、叶柄色等质量性状.每个小区取5株代表性的植株调查，重复2次.调查标准参照[3]进行.数量性状数据按2年平均，质量性状取2年相同的表现.
1.2.2 RAPD分子标记操作
1.2.2.1 DNA提取
采用CTAB法提取.所用嫩叶取自2013年的田间植株，完成品种田间形态调查后，每份材料选取1～2 g嫩叶，放入冰盒中，迅速带回实验室，置冰箱中保存，备用.
取适量（比指甲盖稍大）叶片放入EP管，加适量石英砂，再加300 μL PVP+CTAB的混合液，研磨到看不见组织后，又加300 μL上述混合液研磨.在通风橱中加入6 μL 巯基乙醇后，65 ℃水浴1 h（每隔15～20 min摇1次）.水浴后，加600 μL 苯酚-氯仿（1∶1）混合液，4 ℃ 12000 r/min离心20 min，分层.取上清液于EP管，轻摇，相同条件下离心.上清液移入约1 mL无水乙醇的EP管中，混匀，-20 ℃冰箱处理30～60 min，取出，4 ℃离心.倒去上清液，加600 μL 75%乙醇，4 ℃ 12000 r/min离心10 min.去掉上清液，残液留到纸上，45～50 ℃烘干，10～15 min，无乙醇味道止.残渣加40 μL无菌水溶解，再加0.8 μL的RNAse，37 ℃水浴30 min，获得DNA提取液，-20 ℃冰箱保存.电泳和紫外分光光度计检测DNA的纯度和浓度. 1.2.2.2 PCR扩增
本试验所用120条引物和生化试剂全部购自上海生物工程有限公司，引物按[18]的方法筛选，PCR体系和程序采用史公军等[19]的方法.PCR反应体系25 μL，10×buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.9 μL，60 ng DNA模板1 μL，不足用ddH2O补足.PCR循环程序为：94 ℃变性2 min，37 ℃复性30 s，72 ℃延伸50 s，2个循环；94 ℃变性45 s，37 ℃复性30 s，72 ℃延伸50 s，18个循环；72 ℃延伸5 min，94 ℃变性45 s，37 ℃复性30 s，72 ℃延伸50 s，25个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存.扩增结束后，取产物10 μL，加溴酚蓝指示剂，混匀后上样电泳，1xTBE电泳缓冲液，1.6%琼脂糖凝胶，EB1 μg/mL，在凝胶60 ℃左右加入.电压100 V，时间2 h.电泳结束后，取出胶，在FR200紫外可见图像分析仪中观察、拍照和记录.
1.3 数据处理
1.3.1 形态数据
将田间采集的15项形态性状数据分成2种，其中数量性状计算实测值的平均值，质量性状按[6]进行赋值处理和数量化，并用SPSS 19.0软件对数量化的性状进行多样性分析和Q型聚类分析.
1.3.2 RAPD数据
统计分子量在200～3000 bp DNA的条带，电泳图谱上选择清晰、稳定、重复性好的条带记为1，相同位置缺失的记为“0”，将数据输入计算机，形成0/1矩阵.利用软件NTSYSpc2.1e版分析0/1矩阵，SIMQUAL程序计算相似系数，UPGMA法聚类分析，生成树状图[10].
2 结果分析
2.1 形态特征分析
24份普通白菜品种的13份数量性状多样性分析显示（表2），数量性状的变异系数为12.4%～69.9%，性状多样性表现较为丰富.变异由高到低的排列为叶柄长、单株重、叶长、子叶凹槽深、叶宽、叶柄宽、株幅、腰粗、菜头粗、莲座叶数、子叶宽、子叶长.其中叶柄长的变异系数最大，达69.9%，说明该性状变化较大，田间表现也支持了这一结果.性状变异最小的为子叶长和宽，说明各子叶期品种差异最小.
利用表2数据生成的Q型聚类分析树状图（图1）表明，在距离5处，24个品种分为4类，第一类10个品种，为5，17，9，18，6，24，1，2，21，15号，其中5，17，9，18号可归为一小类，6，24，1，2，21，15号归为另一小类.这类植株较矮，叶卵圆或近圆，株型开展或半直立.第二类仅7，22号2个品种.该类植株较高，叶窄细长，叶披针形，株型开展.第三类为8，23，3，4，11号5个品种，其中8，23号；3，4号；11号有属不同小类.这类株高冠幅适中，叶长叶宽适中，半直立或直立株型.第四类为10，20，16，19，13，14，12号7个品种，其中10，20号与后5个品种归为不同小类.这类冠幅大，叶阔长，株型开展或半塌地.从采集地区来看，不同的类别与地域关系不大.上述聚类结果与24个品种的田间长势较为吻合.
2.2 不同类型普通白菜的RAPD分析
2.2.1 不同类型普通白菜RAPD引物扩增多态性
筛选出的15个RAPD随机引物在24份普通白菜间共扩增出113条带，其中多态性带83条，多态性比率为73.4%，平均每条引物扩增出7.53条和5.53个多态性条带.产生条带最少的是引物S306和s1041，只有50%，最多的是引物S2001，比例为100% （表3，图2）.
2.2.2 不同类型普通白菜的遗传多样性
遗传多样性是衡量种群变异和分布范围的重要指标，通常用Nei′s基因多样性指标H和Shannon信息指数I来表示.按照普通白菜形态性状聚类分成的Ⅰ～Ⅳ个普通白菜类型来计算15个引物扩增后的Nei′s和Shannon指数，其结果表明，H和I两个指数均呈现相同特点，都是第Ⅳ大类>第Ⅰ大类>第Ⅲ大类>第Ⅱ大类（表4）.这就说明普通白菜形态性状的主要类型，即第Ⅳ大类和第Ⅰ大类包含的17个品种，其等位基因的离散程度大，某一扩增产物的存在频率大，遗传多样性复杂.同时，该结果也与市场上这两类普通白菜品种变异多，数量庞大高度吻合.
2.2.3 不同地区普通白菜的遗传多样性
普通白菜原产于中国，但在中国却存在着明显的地域性特点.以24份试验品种的产地来源进行的遗传多样性分析表明，15个引物扩增后计算的Nei′s和Shannon指数，江淮地区的普通白菜最大，其次为华中地区，最小为新疆（表5）.这一结果与普通白菜的区域分布一致.从收集到的分布于全国各区域的313份（数据未全给出，本研究的24份是其中一部分）普通白菜种质资源来看，江淮流域（主要统计江苏、浙江、上海和安徽四省市）占45%，华中三省占11.2%，东北0.6%，新疆占0.9%，西北也只占4.7%.因此，普通白菜的遗传多样性在江淮地区最高，西北东北地区最低.
2.2.4 不同类型普通白菜的聚类分析
由RAPD数据矩阵，经软件分析获得的UPMGA聚类树状图（图3），图3中可以看出，供试的24个普通白菜品种的遗传相似性系数在0.69～0.89间，表明普通白菜的遗传相似性较高.在相似系数为0.77处，24份普通白菜材料分为8个大类.第一类包括19号，第二类16号，第三类10号，第四类为13号、14号，第五类12号，第六类3号，第七类包括10个品种，分别为4、5、24、7、21、22、9、18、15、17号，而该大类在相似系数0.785处，又分成2个亚类，第一亚类为4、5和24号，第二亚类为7、21、22、9、18、15和17号.第八类1、2、11、20、6、8和23号，该大类在相似系数0.815处，分为8、23号和1、2、11、20号2个亚类，且1和2的相似性很大.显然，与24个品种的形态性状聚类分析结果相比，RAPD数据的聚类结果更详细，其中一致性比较好的是形态聚类的第Ⅰ类和RAPD的第七类，2个类中有7个品种是相同的，分别是5，17、9、18、24、24、15，而形态聚类的第Ⅱ类的7、22，在RAPD聚类中聚到了第七类中.第Ⅲ类与第八类有3个是相同的，分别是8、11和23.可见形态聚类与遗传分析聚类间有较大的一致性，但后者更为详细和准确. 3 讨 论
利用各种分子标记，并结合形态学特征分析来鉴定种间或变种间的亲缘关系和遗传多样性，已在不少植物种质上得到了广泛应用[24-26]，尤其是变种繁多的不结球白菜上[3，5-6，10].虽然在同种或变种的不同品种间的分子鉴定不多，但也取得了一定成功，陈素娟等利用SRAP、RAPD和SSP鉴定了12个普通白菜的亲缘关系，得到了遗传距离很近的结论[27]；杜黎明等利用ISSR技术鉴定了65个白菜品种的遗传多样性，相似系数为0.40～0.65[28].此外，在其他作物如小麦[29]、石榴[30]、菠萝[13]、荸荠[31]也得到了应用.这些成果较好地支持了本研究的结论.普通白菜是不结球白菜5个变种的最大变种，品种繁多，自然变异造成的种质关系非常复杂；此外，制种单位又多，信息沟通不够畅通，同名异种、异名同种的现象普遍存在.这些情况不仅使种子真实性受到质疑，也给种质收集和保存、种质利用和创新，以及种质资源数据库的建设带来困难.
本研究对24份不同地区的普通白菜种质，在形态鉴定基础上，利用RAPD分子标记技术，研究了种质间的亲缘关系，虽然样本群体有限，但其结果显示了形态与分子鉴定在大多数情况下，鉴定结果一致，可相互印证提高真实性；但也存在不一致性，表现为有些种质在表型性上相似，形态学方法聚为一类，但RAPD分子标记发现关系较远，如20号与10、16和19号在形态聚类中距离较近，而在RAPD聚类中相似系数则较小，显示出分子水平上的较大遗传差异.而有些种质在形态学上距离较远，分属两个大类，但RAPD分子标记发现遗传背景相近，属一类，如21、7、22号种质.可见，由于RAPD标记的是稳定的DNA，较之形态鉴定的结果更为可靠.前人研究成果也较好地支持了亲缘关系鉴定可采用形态与分子鉴定相结合的手段，而分子鉴定更为准确的结论[5-6，24-26].
参考文献：
[1]TAN J J.A study on the origin and classification of Brassica vegetables[J].Journal of Agricultural University of Hebei，1980，4（1）：104-114.
[2]LIN W S.A study on the classification of Chinese cabbages[J].Acta Horticulturae Sinica，1980，7（2）：21-28.
[3]HAN J M.Genetic diversity and model analysis of germplasm and cloning of bcDREB2 gene fragement in nonhending Chinese cabbage[D].Nanjing：Nanjing Agricultural University，2007.
[4]HOU X L，SONG X M.Research and utilization of Brassica campestris ssp.chinensis Makino （nonheading Chinese cabbage）[J].Journal of Nanjing Agricultural University，2012，35（5）：35-42.
[5]YU S H，LI L F，YU X Y，et al.Cluster analysis of local varieties of Chinese cabbage in coastal area of Zhenjiang province based on morphological and agronomical traits[J].Acta agriculturae Zhengjiangensis，2013，25（2）：241-247.
[6]HAN J M，HOU X L，XU H M，et al.Morphological diversity of nonheading cabbage （Brassica campestris ssp.chinensis Makino）[J].Journal of Biomathematics，2010，（1）：137-146.
[7]XU Y D，PEI D，MA D G，et al.The application of genetic markers in the study of malnut genetic diversity[J].Chinese Agricultural Science Bulletin，2014，30（13）：1-5.
[8]GAO W J，XIAO L H，LU L T，et al.Analysis of sexrelated isozyme marker in dioecious spinacia oleracea[J].Journal of Henan normal University （Natural Science），2006，34（4）：147-150.
[9]WILLIAMS J G K，KUBELIK A R.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].Nucleic Acids Res，1990，18：6531-6535.
[10]LIN J L，ZHU Z G，WANG J C，et al.Relatives analysis of cabbage germplasm resources by RAPD[J].Acta agriculture BoreauSinica，2008，23（Suppl.）：183-189. [11]YANG X G，GU Z X，LU J，et al.Polymorphisim of four kinds of medicinal plants callicarpa Linn by RAPD[J].AsiaPacific Traditional Medicine，2015，11（7）：28-31.
[12]TAO Y L，WANG Z Y，DING W Y，et al.The genetic diversity of the populations of Culcuma wenyujin by RAPD analysis[J].Journal of Shaoxing University，2013，33（9）：53-57，94.
[13]WANG J S，HE J H，CHEN H R，et al.Genetic diversity analysis of forty seven pineapple [Ananas comosus （L.） Merr]germplasm with RAPD marker[J].Chinese Journal of Tropical Crops，2015，36（8）：1392-1397.
[14]KAO A D，WANG S G，WANG Y Q，et al.Analyses of genetic diversity among 65 wild Camellia oleifera based on ISSR and RAPD[J].Guihaia，2014，34（3）：419-425.
[15]WU Q S，MA J H，WU J X，et al.Genetic diversity analysis of celery by RAPD marker[J].Journal of Shanxi agricultural Sciences，2013，41（8）：774-777.
[16]CHENG Y，GENG J F，ZHANG J Y，et al.The construction of a genetic linkage map of nonheading Chinese cabbage （Brassica campestris ssp.chinensis Makino）[J].J Genet Genomics，2009，36：501-508.
[17]GENG J F，ZHU C S，ZHANG X W，et al.A genetic linkage map of nonheading Chinese cabbage[J].J Am Soc Hort Sci，132：816-823.
[18]HAN J M，HOU X L，XU H M，et al.RAPD analysis of genetic diversity of nonheading cabbage （Brassica campestris ssp.chinensis Makino） germplasm[J].Journal of Nanjing Agricultural University，2008，31（3）：31-36.
[19]DENG X H，ZHANG S N，HOU X L.et al.Analysis and identification of RAPD molecular markers linked to Pol CMS line and its maintainer line of nonheading Chinese cabbage[J].Journal of Nanjing Agricultural University，2007，30（1）：19-22.
[20]SHAN X Z，LI Y，GAO S Y，et al.Molecular genetic map of Brassica campestris ssp.chinensis[J].Acta Bot Boreal.occident sin.，2009，29（6）：1116-112.
[21]ZHENG Z C，HOU X L.Indentication of AFLP fingerprint of dwarf resistant No.6 of nonheading Chinese cabbage[J].Jiangsu Agricultural Science，2004（1）：63-64.
[22]SONG T Y，WU C Y，HOU X L，et al.Studies on germplasm resources of Taitsai using RAPD and ISSR markers[J].Journal of Northwest A & F University （Nat.Sci.ED），2012，40（6）：161-174.
[23]SONG Y Q，WU J H，PAN J X.Application of packchoi variety resource database system[J].China Vegetables，2013（22）：81-87.
[24]WU Y.The study of agronomic traits and genome RAPD on Medicago Falcata L.germplasm[D].Beijing：Chinese Acaademy of Agricultural Science，2005.
[25]ZHU Y F，ZHU S J，LI Y P，et al.Application of ISSR molecular marker in plant germplasm[J].Seed，2010，29（2）：55-59. [26]SAI L.The application of DNA molecular marker technique of Lycoris ornamental plants[J].Seed，2012，31（3）：55-59.
[27]CHEN S J，SONG C H，ZHI X，et al.Molecular fingerprint of major Brassica campestris ssp.chinensis cultivars[J].Guizhou Agriculture Science，2014，12（11）：5-9.
[28]DU L M，HU T H，BAO C L，et al.Genetic diversity and relatives analysis of pakchoi germplasm based on intersimple sequence[J].Chinese Agricultural Science Bulletin，2009，25（11）：20-24.
[29]LIU Y H，ZHAO X Y，YAN W X，et al.Agronomic traits and wheat leaf rust resistance of ten Turkey wheat accessions[J].Acta Agriculturae Borealisinic，2012，27（1）：193-200.
[30]MA L，MA Y H，HAO Z X，et al.Genetic relationship analysis of 38 punica garanatu L.cultivars based on RAPD markers[J].Northern Horticulture，2014（09）：101-105.
[31]JIANG W，CAI B H，CHEN L J，et al.Genetic diversity analysis of 24 water chestnut （Eleocharis tuberrosa schulut） cultivars using RAPD markers[J].J of Sourthern Agriculture，2012，43（7）：859-900.
Abstract：The genetic diversity of 24 accessions of pakchoi（Brassica campestris L. ssp. chinensis （L.） Makino var. communis Tsee et Lee.） from different districts of China was identified by morphological characters and RAPD analysis.The results showed that the coefficient of variation of 13 morphological characters of materials was from 12.4% to 69.9%，the most was petiole length，and the least cotyledon.24 accessions were clustered into 4 groups at the distance of 5 in morphological cluster.113 bands were detecteded by15 RAPD primers，and 83 were polymorphic.The percentage of polymorphic bands was 73.4%，and the number of average and polymorphic bands each primer were 7.53 and 5.53 respectively.In RAPD analysis，8 groups at the genetic distance of 0.77 were obtained based on RAPD data.There were the overlaps and segmentation between the results of RAPD and morphological cluster.Nei′s diversity （H）and Shannon information index （I） based on 4 types of morphological analysis were both the order of Ⅳ>Ⅰ>Ⅲ>Ⅱ，and H and I of Ⅳ were 0.2395 and 0.3523 respectively.H and I of Jianghui area were the highest in China，being 0.2076 and 0.3098 respectively.These data were in accordance with the diversity characteristics and rejoin distribution of pakchoi germplasms.
Key words：Brassica campestris L. ssp. chinensis （L.） Makino var. communis Tsee et Lee.； Morphological characters； RAPD analysis； Clustering analysis
（责任编辑：顾浩然，包震宇）