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摘要：目的： 阐明茴香霉素对淋巴细胞反应性的影响以及在皮肤移植中抑制排斥反应的作用。方法： 用MTT法检测茴香霉素刺激下淋巴细胞在单向或双向混合淋巴细胞反应中的反应性。C57BL/6小鼠作为供体， BALB/c小鼠作为受体。手术前3 d分别给3组BALB/c小鼠皮下注射生理盐水、 环胞霉素A以及茴香霉素， 手术当天继续注射至术后第7天。环胞霉素A及茴香霉素的注射剂量分别为： 20 mg/kg、 12.5 mg/kg。结果： 在剂量10.0 μg/L时， 茴香霉素能抑制单向或双向混合淋巴细胞反应中淋巴细胞的反应性（P均
关键字：茴香霉素混合淋巴细胞反应皮肤移植
茴香霉素是由链霉菌分泌的一种活性成分， 能结合在核糖体60S亚基上阻止多肽链形成。作为临床药物， 茴香霉素已被用于治疗由真菌和阿米巴原虫引起的疾病[1]。最近有研究发现， 茴香霉素与学习、 记忆关系密切[2-4]。然而茴香霉素在免疫系统方面的相关研究很少， 我们在研究中意外发现茴香霉素能明显抑制淋巴细胞的增殖活化（另文发表）， 因此， 将其试用于动物体内研究。本研究以混合淋巴细胞反应为模型测试茴香霉素处理的淋巴细胞在体外对同种异基因抗原刺激的反应性， 以皮肤移植为模型观察其体内对免疫系统的抑制作用。结果显示， 茴香霉素对单向和双向混合淋巴细胞的反应性均有明显的抑制作用， 并能明显地抑制受体对供体皮肤的排斥反应， 延长移植物的存活时间。提示茴香霉素对免疫系统有着明显的抑制作用， 可能为开发免疫抑制药物提供新的途径。
1 材料和方法
1.1 材料 SPF级C57BL/6雄性小鼠（6～8周龄， 体质量18～22 g）； SPF级BALB/c雄性小鼠（6～8周龄， 体质量18～22 g）， 由南方医科大学实验动物中心提供。刀豆蛋白A（ConA）、 碘化丙锭（PI）、 L谷氨酰胺、 β巯基乙醇、 茴香霉素和MTT均购自美国Sigma公司。RPMI1640、 胎牛血清（FBS）为美国GibcoBRL公司产品。质量分数为111 g/L的水合氯醛由广州华侨医院提供， 环胞霉素A由华北制药厂生产， 庆大霉素由华北制药厂生产。6/0羊肠手术缝合线由上海浦东金环医疗用品有限公司提供， 显微外科器械生产于上海医疗器械有限公司手术器械厂， 显微外科手术镜为德国Laica公司产品。
1.2 方法
1.2.1 淋巴细胞悬液的制备 将BALB/c或C57小鼠断髓处死， 无菌分离双侧腋窝、 锁骨下、 腹股沟浅表淋巴结和肠系膜淋巴结， 去掉被膜， 机械研磨， 于200目不锈钢网筛过滤。收集细胞， 用冷PBS离心（300 g， 5 min）洗涤细胞2次后， 细胞重悬于RPMI1640完全培养液中， 调整细胞密度为2×109/L。
1.2.2 同种混合淋巴细胞反应（MLR） （1）双向MLR： 将BALB/c小鼠淋巴细胞悬液种于96孔细胞培养板上， 每孔100 μL， 作为刺激细胞。分别设茴香霉素组、 茴香霉素+ConA组、 ConA组、 地塞米松+ConA组、 地塞米松组、 刺激细胞+反应细胞组（对照组）、 刺激细胞组、 反应细胞组及RPMI1640完全培养液空白组。茴香霉素与地塞米松的终浓度分别为10.0 μg/L和1.0 g/L。在37℃、 50 mL/L CO2培养箱中孵育48 h后， 加入100 mL C57BL/6小鼠淋巴细胞悬液， 作为反应细胞（密度为2×109/L）， 继续培养72 h后， 加入MTT（终浓度为5.0 mg/L）， 4 h后离心弃上清（300 g， 5 min）， DMSO溶解沉淀后， 酶标仪检测A540值。（2）单向MLR： 细胞培养及分组同上， 在加入反应细胞前先用25 mg/L丝裂霉素作用30 min， PBS离心（300 g， 5 min）， 洗涤细胞3次。
1.2.3 皮肤移植供体的准备 C57BL/6小鼠腹腔注射质量分数为111 g/L水合氯醛5 mL/kg麻醉， 俯卧固定， 消毒后约取1.5 cm×1.5 cm的背部皮肤， 刮去皮下的脂肪以及血管等组织， 放于无菌的生理盐水中备用。
1.2.4 皮肤移植受体的准备 BALB/c小鼠15只随机分为生理盐水、 环胞霉素A以及茴香霉素3组， 腹腔注射质量分数为111 g/L的水合氯醛0.3 mL/kg麻醉， 俯卧固定。背部消毒后， 取下比供体皮肤稍大一点的皮肤， 并除去覆盖于背上肌肉的皮下结缔组织。
1.2.5 皮片的缝合 供体皮肤平铺于植床上， 对齐后用带针羊肠缝合线缝合， 每只鼠8针。后以纱布以及带针缝线包扎。
1.2.6 给药 生理盐水、 环胞霉素A以及茴香霉素3组小鼠于术前3 d在移植皮瓣周围的受体皮下进行多点注射， 分别注射生理盐水0.1 mL/只， 20 mg/kg环胞霉素A， 10 mg/kg茴香霉素， 每天给药1次， 共10次。
1.2.7 移植效果评价 以移植物红润、 柔软、 鼠毛生长为移植物耐受标准， 以移植物干硬、 皱缩、 边缘翘起、 结痂脱落为排斥标准。记录开始发生排斥的时间。
1.2.8 统计学处理 数据以x±s表示， 用SPSS10.0进行处理， 组间比较采用OnewayANOVA， 两两比较用LSDt检验， P<0.05表明有统计学意义。
2 结果
2.1 茴香霉素对小鼠混合淋巴细胞反应的影响 在双向混合淋巴细胞中， 茴香霉素组A540值低于对照组（P<0.01）， 与地塞米松组比较无统计学意义； 茴香霉素+ConA组A540值低于ConA组（P<0.01）， 与地塞米松+ConA组比较亦无统计学意义（图1A）。在单向混合淋巴细胞中， 茴香霉素+ConA组A540值低于ConA组（P<0.01）， 茴香霉素组A540值明显低于对照组（P<0.05）， 与地塞米松组比较无统计学意义（图1B）。表明茴香霉素能明显抑制小鼠淋巴细胞的反应性。 图1 茴香霉素对单向（B）或双向（A）混合淋巴细胞反应的影响（略）
Fig 1 The effect of anisomycin on the unilateral（B） or bilateral（A） mixed lymphocyte reaction
Anisomycin： 10.0 μg/L； Dexamethasone： 1.0 mg/L.
2.2 茴香霉素对小鼠移植皮瓣的影响 术后第4天拆开包扎纱布， 发现伤口均已愈合， 移植皮肤均红润、 柔软， 皮毛生长正常。术后第8天发现生理盐水组有2只小鼠移植皮瓣开始干燥、 皱缩， 视为开始排斥。术后第10天发现环胞霉素A组有小鼠的移植物发生排斥的现象。术后第13天发现茴香霉素组的小鼠移植物发生排斥现象（表1）。从图2中可以看到， 生理盐水组其中一只小鼠的移植皮瓣在第9天开始边缘就出现干枯、 翘起。环胞霉素A组小鼠在第11天边缘出现干枯、 皱缩、 泛黄。而茴香霉素组的小鼠在第13天才开始出现边缘翘起、 坏死的排斥症状。且皮瓣掉落的时间顺序也为： 生理盐水组→环胞霉素A组→茴香霉素组（表2）。皮瓣存活时间和皮瓣脱落时间统计检验的结果为生理盐水和环胞霉素A组； 生理盐水组和茴香霉素组； 环胞霉素A和茴香霉素组之间均有统计学意义（P<0.05）。说明环胞霉素A实为移植耐受的有效药物， 而茴香霉素作为移植耐受药物， 效果比环胞霉素A更为明显。从观察小鼠注射药物后的状态， 可发现环胞霉素A组小鼠自第1次注射后起就显得暴躁不安， 且逐渐消瘦。停药后体质量恢复较慢。而茴香霉素组小鼠虽稍有消瘦及躁动， 但状态明显好于环胞霉素A组小鼠， 停药后体质量恢复也较快。
表1 茴香霉素对小鼠移植皮瓣开始排斥时间的影响（略）
Tab 1 The effect of anisomycin upon the initiation rejection time of skin
aP<0.05， bP<0.01 vs control； dP<0.01 vs CsA.
表2 茴香霉素对小鼠移植皮瓣脱落时间的影响（略）
Tab 2 The effect of anisomycin upon the exfoliation time of skin
aP<0.05 vs CsA； bP<0.01 vs control.
图2 茴香霉素对小鼠移植皮瓣的影响（略）
Fig 2 The effect of anisomycin upon the allogeneic skin
A， B， C： The state of allogeneic skin of physiological saline group， cyclosporin A group and anisomycin group separately of day 9； D， E， F： The state of allogeneic skin of physiological saline group， cyclosporin A group and anisomycin group separately of day 11； G， H， I： The state of allogeneic skin of physiological saline group， cyclosporin A group and anisomycin group separately of day 13.
3 讨论
茴香霉素是p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活剂[5]， 而各种炎症效应细胞中p38MAPK的激活能刺激细胞产生炎症介质， 参与炎症反应。然而， 目前未见茴香霉素对免疫系统影响的相关报道。我们在研究p38MAPK通路时， 发现茴香霉素作为p38MAPK通路的激活剂能够明显抑制单向或双向混合淋巴细胞反应中T细胞的增殖活性， 抑制T细胞表面早期及中期活化标志分子CD69和CD25的表达， 且能抑制T细胞对大鼠肝癌细胞的杀伤活性， 其作用不亚于经典的抑制剂地塞米松。在体外试验中， 我们发现大于1.0 ng/mL茴香霉素就足以产生明显的抑制作用， 在10 ng/mL～100 ng/mL的剂量范围内， 茴香霉素能发挥更好的作用， 其毒副作用较小（另文发表）。因此， 我们将其试用于皮肤移植动物。从实验结果看来， 茴香霉素在小剂量范围内的作用甚至优于临床常用的免疫抑制剂环胞霉素A。小鼠在注射环胞霉素A后出现明显的躁狂、 消瘦等毒副作用。最近研究发现， 环胞霉素A会引起多种并发症， 最常见的是肾毒性， 肝毒性， 糖尿病， 高动脉压和神经毒性等[6]。而茴香霉素剂量在小于环胞霉素A的情况下就能取得较好的效果， 可以减少药物的毒副作用， 并且移植物的存活状态也比环胞霉素A组小鼠要好。因此， 茴香霉素很可能具有作为免疫抑制剂开发应用的潜在前景。但是， 茴香霉素会引起短时记忆的丢失， 且它在其他方面的毒副作用仍然未知， 因此还需通过大量的研究来探明其临床应用价值。
【参考文献】
[1] Hazzalin CA， Le Panse R， Cano E， et al. Anisomycin selectively desensitizes signalling components involved in stress kinase activation and fos and jun induction[J]. Mol Cell Biol， 1998， 18（4）： 1844-1854.
[2] Cohen H， Kaplan Z， Matar MA， et al. Anisomycin， a protein synthesis inhibitor， disrupts traumatic memory consolidation and attenuates posttraumatic stress response in rats[J]. Biol Psychiatry， 2006， 60（7）： 767-776.
[3] Lattal KM， Abel T. Behavioral impairments caused by injections of the protein synthesis inhibitor anisomycin after contextual retrieval reverse with time[J]. Proc Natl Acad Sci， 2004， 101（13）： 4667-4672.
[4] Baumbauer KM， Young EE， Hoy KC Jr， et al. Intrathecal infusions of anisomycin impact the learning deficit but not the learning effect observed in spinal rats that have received instrumental training[J]. Behav Brain Res， 2006， 173（2）： 299-309.
[5] Eguchi R， Suzuki A， Miyakaze S， et al. Hypoxia induces apoptosis of HUVECs in an in vitro capillary model by activating proapoptotic signal p38 through suppression of ERK1/2[J]. Cell Signal， 2007， 19（6）： 1121-1131.
[6] Kozlowska I， Rozaniski J， Ciechanowski K. Neurotoxicity of cyclosporine[J]. Wiad Lek， 2006， 59（7-8）： 516-520
关键字：茴香霉素混合淋巴细胞反应皮肤移植
茴香霉素是由链霉菌分泌的一种活性成分， 能结合在核糖体60S亚基上阻止多肽链形成。作为临床药物， 茴香霉素已被用于治疗由真菌和阿米巴原虫引起的疾病[1]。最近有研究发现， 茴香霉素与学习、 记忆关系密切[2-4]。然而茴香霉素在免疫系统方面的相关研究很少， 我们在研究中意外发现茴香霉素能明显抑制淋巴细胞的增殖活化（另文发表）， 因此， 将其试用于动物体内研究。本研究以混合淋巴细胞反应为模型测试茴香霉素处理的淋巴细胞在体外对同种异基因抗原刺激的反应性， 以皮肤移植为模型观察其体内对免疫系统的抑制作用。结果显示， 茴香霉素对单向和双向混合淋巴细胞的反应性均有明显的抑制作用， 并能明显地抑制受体对供体皮肤的排斥反应， 延长移植物的存活时间。提示茴香霉素对免疫系统有着明显的抑制作用， 可能为开发免疫抑制药物提供新的途径。
1 材料和方法
1.1 材料 SPF级C57BL/6雄性小鼠（6～8周龄， 体质量18～22 g）； SPF级BALB/c雄性小鼠（6～8周龄， 体质量18～22 g）， 由南方医科大学实验动物中心提供。刀豆蛋白A（ConA）、 碘化丙锭（PI）、 L谷氨酰胺、 β巯基乙醇、 茴香霉素和MTT均购自美国Sigma公司。RPMI1640、 胎牛血清（FBS）为美国GibcoBRL公司产品。质量分数为111 g/L的水合氯醛由广州华侨医院提供， 环胞霉素A由华北制药厂生产， 庆大霉素由华北制药厂生产。6/0羊肠手术缝合线由上海浦东金环医疗用品有限公司提供， 显微外科器械生产于上海医疗器械有限公司手术器械厂， 显微外科手术镜为德国Laica公司产品。
1.2 方法
1.2.1 淋巴细胞悬液的制备 将BALB/c或C57小鼠断髓处死， 无菌分离双侧腋窝、 锁骨下、 腹股沟浅表淋巴结和肠系膜淋巴结， 去掉被膜， 机械研磨， 于200目不锈钢网筛过滤。收集细胞， 用冷PBS离心（300 g， 5 min）洗涤细胞2次后， 细胞重悬于RPMI1640完全培养液中， 调整细胞密度为2×109/L。
1.2.2 同种混合淋巴细胞反应（MLR） （1）双向MLR： 将BALB/c小鼠淋巴细胞悬液种于96孔细胞培养板上， 每孔100 μL， 作为刺激细胞。分别设茴香霉素组、 茴香霉素+ConA组、 ConA组、 地塞米松+ConA组、 地塞米松组、 刺激细胞+反应细胞组（对照组）、 刺激细胞组、 反应细胞组及RPMI1640完全培养液空白组。茴香霉素与地塞米松的终浓度分别为10.0 μg/L和1.0 g/L。在37℃、 50 mL/L CO2培养箱中孵育48 h后， 加入100 mL C57BL/6小鼠淋巴细胞悬液， 作为反应细胞（密度为2×109/L）， 继续培养72 h后， 加入MTT（终浓度为5.0 mg/L）， 4 h后离心弃上清（300 g， 5 min）， DMSO溶解沉淀后， 酶标仪检测A540值。（2）单向MLR： 细胞培养及分组同上， 在加入反应细胞前先用25 mg/L丝裂霉素作用30 min， PBS离心（300 g， 5 min）， 洗涤细胞3次。
1.2.3 皮肤移植供体的准备 C57BL/6小鼠腹腔注射质量分数为111 g/L水合氯醛5 mL/kg麻醉， 俯卧固定， 消毒后约取1.5 cm×1.5 cm的背部皮肤， 刮去皮下的脂肪以及血管等组织， 放于无菌的生理盐水中备用。
1.2.4 皮肤移植受体的准备 BALB/c小鼠15只随机分为生理盐水、 环胞霉素A以及茴香霉素3组， 腹腔注射质量分数为111 g/L的水合氯醛0.3 mL/kg麻醉， 俯卧固定。背部消毒后， 取下比供体皮肤稍大一点的皮肤， 并除去覆盖于背上肌肉的皮下结缔组织。
1.2.5 皮片的缝合 供体皮肤平铺于植床上， 对齐后用带针羊肠缝合线缝合， 每只鼠8针。后以纱布以及带针缝线包扎。
1.2.6 给药 生理盐水、 环胞霉素A以及茴香霉素3组小鼠于术前3 d在移植皮瓣周围的受体皮下进行多点注射， 分别注射生理盐水0.1 mL/只， 20 mg/kg环胞霉素A， 10 mg/kg茴香霉素， 每天给药1次， 共10次。
1.2.7 移植效果评价 以移植物红润、 柔软、 鼠毛生长为移植物耐受标准， 以移植物干硬、 皱缩、 边缘翘起、 结痂脱落为排斥标准。记录开始发生排斥的时间。
1.2.8 统计学处理 数据以x±s表示， 用SPSS10.0进行处理， 组间比较采用OnewayANOVA， 两两比较用LSDt检验， P<0.05表明有统计学意义。
2 结果
2.1 茴香霉素对小鼠混合淋巴细胞反应的影响 在双向混合淋巴细胞中， 茴香霉素组A540值低于对照组（P<0.01）， 与地塞米松组比较无统计学意义； 茴香霉素+ConA组A540值低于ConA组（P<0.01）， 与地塞米松+ConA组比较亦无统计学意义（图1A）。在单向混合淋巴细胞中， 茴香霉素+ConA组A540值低于ConA组（P<0.01）， 茴香霉素组A540值明显低于对照组（P<0.05）， 与地塞米松组比较无统计学意义（图1B）。表明茴香霉素能明显抑制小鼠淋巴细胞的反应性。 图1 茴香霉素对单向（B）或双向（A）混合淋巴细胞反应的影响（略）
Fig 1 The effect of anisomycin on the unilateral（B） or bilateral（A） mixed lymphocyte reaction
Anisomycin： 10.0 μg/L； Dexamethasone： 1.0 mg/L.
2.2 茴香霉素对小鼠移植皮瓣的影响 术后第4天拆开包扎纱布， 发现伤口均已愈合， 移植皮肤均红润、 柔软， 皮毛生长正常。术后第8天发现生理盐水组有2只小鼠移植皮瓣开始干燥、 皱缩， 视为开始排斥。术后第10天发现环胞霉素A组有小鼠的移植物发生排斥的现象。术后第13天发现茴香霉素组的小鼠移植物发生排斥现象（表1）。从图2中可以看到， 生理盐水组其中一只小鼠的移植皮瓣在第9天开始边缘就出现干枯、 翘起。环胞霉素A组小鼠在第11天边缘出现干枯、 皱缩、 泛黄。而茴香霉素组的小鼠在第13天才开始出现边缘翘起、 坏死的排斥症状。且皮瓣掉落的时间顺序也为： 生理盐水组→环胞霉素A组→茴香霉素组（表2）。皮瓣存活时间和皮瓣脱落时间统计检验的结果为生理盐水和环胞霉素A组； 生理盐水组和茴香霉素组； 环胞霉素A和茴香霉素组之间均有统计学意义（P<0.05）。说明环胞霉素A实为移植耐受的有效药物， 而茴香霉素作为移植耐受药物， 效果比环胞霉素A更为明显。从观察小鼠注射药物后的状态， 可发现环胞霉素A组小鼠自第1次注射后起就显得暴躁不安， 且逐渐消瘦。停药后体质量恢复较慢。而茴香霉素组小鼠虽稍有消瘦及躁动， 但状态明显好于环胞霉素A组小鼠， 停药后体质量恢复也较快。
表1 茴香霉素对小鼠移植皮瓣开始排斥时间的影响（略）
Tab 1 The effect of anisomycin upon the initiation rejection time of skin
aP<0.05， bP<0.01 vs control； dP<0.01 vs CsA.
表2 茴香霉素对小鼠移植皮瓣脱落时间的影响（略）
Tab 2 The effect of anisomycin upon the exfoliation time of skin
aP<0.05 vs CsA； bP<0.01 vs control.
图2 茴香霉素对小鼠移植皮瓣的影响（略）
Fig 2 The effect of anisomycin upon the allogeneic skin
A， B， C： The state of allogeneic skin of physiological saline group， cyclosporin A group and anisomycin group separately of day 9； D， E， F： The state of allogeneic skin of physiological saline group， cyclosporin A group and anisomycin group separately of day 11； G， H， I： The state of allogeneic skin of physiological saline group， cyclosporin A group and anisomycin group separately of day 13.
3 讨论
茴香霉素是p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活剂[5]， 而各种炎症效应细胞中p38MAPK的激活能刺激细胞产生炎症介质， 参与炎症反应。然而， 目前未见茴香霉素对免疫系统影响的相关报道。我们在研究p38MAPK通路时， 发现茴香霉素作为p38MAPK通路的激活剂能够明显抑制单向或双向混合淋巴细胞反应中T细胞的增殖活性， 抑制T细胞表面早期及中期活化标志分子CD69和CD25的表达， 且能抑制T细胞对大鼠肝癌细胞的杀伤活性， 其作用不亚于经典的抑制剂地塞米松。在体外试验中， 我们发现大于1.0 ng/mL茴香霉素就足以产生明显的抑制作用， 在10 ng/mL～100 ng/mL的剂量范围内， 茴香霉素能发挥更好的作用， 其毒副作用较小（另文发表）。因此， 我们将其试用于皮肤移植动物。从实验结果看来， 茴香霉素在小剂量范围内的作用甚至优于临床常用的免疫抑制剂环胞霉素A。小鼠在注射环胞霉素A后出现明显的躁狂、 消瘦等毒副作用。最近研究发现， 环胞霉素A会引起多种并发症， 最常见的是肾毒性， 肝毒性， 糖尿病， 高动脉压和神经毒性等[6]。而茴香霉素剂量在小于环胞霉素A的情况下就能取得较好的效果， 可以减少药物的毒副作用， 并且移植物的存活状态也比环胞霉素A组小鼠要好。因此， 茴香霉素很可能具有作为免疫抑制剂开发应用的潜在前景。但是， 茴香霉素会引起短时记忆的丢失， 且它在其他方面的毒副作用仍然未知， 因此还需通过大量的研究来探明其临床应用价值。
【参考文献】
[1] Hazzalin CA， Le Panse R， Cano E， et al. Anisomycin selectively desensitizes signalling components involved in stress kinase activation and fos and jun induction[J]. Mol Cell Biol， 1998， 18（4）： 1844-1854.
[2] Cohen H， Kaplan Z， Matar MA， et al. Anisomycin， a protein synthesis inhibitor， disrupts traumatic memory consolidation and attenuates posttraumatic stress response in rats[J]. Biol Psychiatry， 2006， 60（7）： 767-776.
[3] Lattal KM， Abel T. Behavioral impairments caused by injections of the protein synthesis inhibitor anisomycin after contextual retrieval reverse with time[J]. Proc Natl Acad Sci， 2004， 101（13）： 4667-4672.
[4] Baumbauer KM， Young EE， Hoy KC Jr， et al. Intrathecal infusions of anisomycin impact the learning deficit but not the learning effect observed in spinal rats that have received instrumental training[J]. Behav Brain Res， 2006， 173（2）： 299-309.
[5] Eguchi R， Suzuki A， Miyakaze S， et al. Hypoxia induces apoptosis of HUVECs in an in vitro capillary model by activating proapoptotic signal p38 through suppression of ERK1/2[J]. Cell Signal， 2007， 19（6）： 1121-1131.
[6] Kozlowska I， Rozaniski J， Ciechanowski K. Neurotoxicity of cyclosporine[J]. Wiad Lek， 2006， 59（7-8）： 516-520