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摘要 为探明大鳞副泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）溃烂病的病原，并筛选有效的外用和内服药物，进行了细菌分离鉴定、毒力基因检测、人工感染、药物筛选和治疗试验。结果表明，分离菌N-1株为中间气单胞菌，N-2株和N-3株为凡隆气单胞菌，且攜带气溶素aerA、细胞毒性肠毒素Act、鞭毛Fla、酯酶Lip等毒力基因。N-1、N-2、N-3对应的半数致死浓度分别为105.21、105.88、105.53 CFU/尾，外用和内服药分别优先选择优力克和氟苯尼考。中间气单胞菌和凡隆气单胞菌可引起大鳞副泥鳅皮肤溃烂病，优力克外泼和氟苯尼考内服可治疗该病。
关键词 大鳞副泥鳅;皮肤溃烂;气单胞菌;氟苯尼考
中图分类号 S947文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）22-0088-03
Abstract To identify the pathogen of Paramisgurnus dabryanus canker and screen effective drugs for external and internal use，bacterial isolation and identification，virulence gene detection，artificial infection，drug screening and treatment experiment were carried out.The results showed that N1 isolate was Aeromonas media，N2 and N3 were Aeromonas veronii，which carried virulence genes such as aerosol aerA，cytotoxic enterotoxin Act，flagellum Fla and esterase Lip.Half lethal concentrations of N1，N2 and N3 were 105.21，105.88 and 105.53 CFU/tail，respectively.The external and internal medicines were preferred to YouLike and florfenicol，respectively.Aeromonas rmedia and Aeromonas veronii could cause skin ulceration of P.dabryanus，which could be treated by external spraying of YouLike and oral administration of florfenicol.
Key words Paramisgurnus dabryanus;Skin ulceration;Aeromonas spp.;Florfenicol
大鳞副泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）又称台湾泥鳅，隶属鲤形目鳅科。随着大鳞副泥鳅养殖密度的不断增加，水产病害问题日益严重，且以温和气单胞菌（Aeromonas sobria）[1]、创伤弧菌（vibrio vulnificus）[2]、泥鳅气单胞菌（Aeromonas misgurnus）[3]、凡隆气单胞菌（Aeromonas veronii）[4]等细菌感染最为严重。然而，迄今为止尚未见中间气单胞菌感染大鳞副泥鳅的报道。
气单胞菌属（Aeromonas）成员广泛分布于淡水、污水、淤泥、土壤等自然环境，也是重要的人类条件致病菌，能够引起肠道、血液、皮肤和软组织的感染[5]。2017年4月安徽省定远县的某工厂化养殖场的大鳞副泥鳅繁殖亲本发生大面积皮肤溃疡。笔者对该病例的病因分离和治疗进行了报道，以期为类似疾病防控提供参考。
1 材料与方法
1.1 临床诊断分析 对发病前后的水质、寄生虫和饲养管理进行分析。
1.2 细菌分离纯化及鉴定
无菌取患病大鳞副泥鳅（全长10～15 cm）肝胰脏、脾脏截面涂布于营养琼脂，28 ℃下培养16 h，观察菌落形态;参照杭州微生物试剂有限公司的操作手册进行革兰氏染色、氧化酶试验、细菌生理生化鉴定。参照朱若林等[6]的方法进行16S rRNA基因扩增、系统进化分析和毒力基因检测。
1.3 攻毒试验 健康大鳞副泥鳅，体长（8.5±1.1） cm，体重（5.1±0.2） g，饲养在曝气自来水中，水温28～31 ℃。每株菌的攻毒试验设6个剂量组：0（空白对照）、105、106、107、108和109 CFU/mL，每组20尾泥鳅。试验期间，按摄食状况少量投饵，不排污。观察14 d，取濒死或刚死泥鳅，重新进行细菌分离鉴定。
根据上面测定的半数致死浓度，进行混合攻毒试验，每组20尾大鳞副泥鳅，攻毒菌液浓度107 CFU/mL，单株菌注射时，剂量为0.1 mL/（尾·株）;2株菌混合感染时，每株菌注射0.05 mL/（尾·株）;3株菌混合时，每株注射0.033 mL/（尾·株）。
1.4 外用和内服药物筛选
参考商业检验标准（SN/T 3229—2012）[7]，采用稀释-中和法筛选外用消毒剂。参考欧盟标准[8]，采用纸片法和微量肉汤稀释法进行内服抗菌药物（购自中国兽药监察所）的药敏试验。
2 结果与分析
2.1 临床诊断分析
发病池水温在25～28 ℃，水质指标良好。患病大鳞副泥鳅体表黏液增多，体表的中部、尾部出现圆形溃烂。解剖发现脾脏暗红，肝胰脏发黄，苍白。水浸片镜检未见寄生虫。 2.2 细菌形态学生理生化鉴定
从3尾患鳅肝胰脏分别分离纯化得到3株优势菌，命名为N-1株、N-2株、N-3株。营养琼脂平板上28 ℃培养16 h后，菌落呈乳白色，表面光滑，圆形凸起，边缘整齐;3株菌均为革兰氏阴性菌，且6% NaCl胨水和1 %NaCl枸橼酸盐试验均显示阴性，而氧化酶、精氨酸、葡萄糖产气、蔗糖、甘露醇试验均显示阳性。此外，N-1株赖氨酸试验呈阴性，而N-2株、N-3株赖氨酸试验呈阳性。经生化编码鉴定，可判定3株细菌均为气单胞菌属成员。
N-1株、N-2株和N-3株的16S rRNA基因测序BLAST比对显示，其分别与中间气单胞菌、凡隆气单胞菌的相似性最高，均为99 %，系统发育树如图1所示。，综上可确定N-1株为中间气单胞菌，N-2株和N-3株为凡隆气单胞菌。
使用 Mega 4软件进行多序列匹配分析后，采用邻位相连法（Neighborjoining method）构建系统发育树，所构建发育树各分支的置信度由 Bootstrap 进行 1 000 次循环检验。
从中间气单胞菌N-1株中检出的毒力基因有气溶素aerA、细胞毒性肠毒素Act、热不稳定性肠毒素Alt、鞭毛Fla、弹性蛋白酶ahyB、酯酶Lip（图2）等6种毒力基因;从凡隆气单胞菌N-2、N-3株中检测出的毒力基因有气溶素aerA、细胞毒性肠毒素Act、鞭毛Fla、酯酶Lip（图2）等4种毒力基因。
2.3 攻毒试验
大鳞副泥鳅在攻毒后3～7 d相继发病，采用简化寇氏法计算LD50发现，中间气单胞菌N-1株、凡隆气单胞菌N-2株、凡隆气单胞菌N-3株对应的半数致死量（LD50）分别为105.21、105.88、105.53 CFU/尾。死亡的大鳞副泥鳅主要表现为皮肤点状出血和鳍条出血，未见皮肤溃疡。人工感染后发病泥鳅肝胰脏分离菌为攻毒所用菌株。混合感染死亡率见表1。
2.4 有效药物筛选和治疗结果
对市场上效果比较认可的3种含碘制剂（优力克、迪碘和蛋氨酸碘）进行了非清洁条件和清洁条件下的最小抑菌浓度试验。3种碘制剂在清洁条件下的MIC大于500 μL/mL，但综合比较3种碘制剂的效价比，以优力克（嘉兴绿望生物科技有限公司）最高，且考虑优力克能促进创伤愈合，后续治疗中选择优力克的池效果也最好。综合纸片法测定敏感性定性结果（表2）和肉汤法测定的MIC定量结果（表3）可知，可使用的国标渔药中最优选择为氟苯尼考。
由于笔者介入此案例治疗时，死亡已经发生7 d，且部分（40%～70%）泥鳅的溃疡面积已经超过了体表面积的10%以上，且已经烂到肌肉。外用优力克（0.5 g/m3）3次，每隔1 d 1次;内服氟苯尼考（25 mg/kg体重）和多维适量，连续7 d。7 d后死亡终止，创伤面积小于10%且仅真皮层没有完全烂透的泥鳅也逐步恢复。但是，该病例介入治疗已经比较晚，导致部分池的死亡率高达90%。
3 讨论
在泥鳅养殖过程中，皮肤相关疾病多发，一般最开始表现为多发性点状出血病、如不及时治疗会进一步发展为赤皮、腐皮、溃烂、烂鳍等。引起这些症状的细菌以气单胞菌科成员最为常见[3，9-10]。当环境不良、体表损伤、应激等均可诱发气单胞菌感染[11]，该案例中的大鳞副泥鳅有不同程度的体表擦伤，是中间气单胞菌和凡隆气单胞菌继发感染的诱因。患病大鳞副泥鳅是由中间气单胞菌（N-1）和凡隆气单胞菌（N-2、N-3）混合感染引起，其引起的死亡率要比单一菌株感染高。目前，有关大鳞副泥鳅凡隆气单胞菌感染的报道已有2例，分别发生在抚州市[12]、辽宁省[13]，报道中患病大鳞副泥鳅症状以出血溃疡为主，与该研究中情况相似。有关大鳞副泥鳅中间气单胞菌感染的报道尚未发现，但关于中间气单胞菌感染水产动物的研究报道已有2例，分别发生在成都[14]和湖南常德[15]，报道中患病鱼症状均以出血为主。
气单胞菌属细菌可单独或与其他病原菌混合感染[3]。其致病性与多种胞外水解酶（如脂肪酶和蛋白酶）和非酶类毒力因子（细胞毒性腸毒素、气溶素等）有关，这毒力因子有助于细菌入侵和感染的建立[16-17]。
气单胞菌的耐药性日益严重，因此处理临床病例时，需进行药敏试验，才能科学用药[18]。该案例的中间气单胞菌和凡隆气单胞菌对药物的敏感性结果与上述报道菌株的药敏结果差异明显。综合评价内服以国标渔药氟苯尼考最优，外用以新型创伤愈合促进消毒剂优力克最好。
参考文献
[1] 肖克宇，蒋武成，李年文，等.泥鳅腐皮病的病原与防治的研究[J].湖南农学院学报，1992，18（S3）：706-712.
[2] 杨鸢劼，陈辉，金日奉.泥鳅溃疡病的病原菌分离和组织病理学观察[J].集美大学学报（自然科学版），2004，9（1）：22-25.
[3] 房海，陈翠珍，张晓君.泥鳅气单胞菌感染的检验与分析[J].中国人兽共患病杂志，2006，22（11）：1065-1069.
[4] 秦蕾，徐静，张晓君，等.泥鳅的凡隆气单胞菌感染[J].中国人兽共患病杂志，2008，24（12）：1100-1102.
[5] JANDA J M，ABBOTT S L.The genus Aeromonas：Taxonomy，pathogenicity，and infection[J].Clinical microbiology reviews，2010，23（1）：35-73.
[6] 朱若林，马腾，陈露，等.鳙鱼维氏气单胞菌的分离鉴定及其毒力基因检测[J].安徽农业大学学报，2017，44（2）：229-233.
[7] 姜英辉，房保海，祝素珍，等.食品消毒剂和防腐剂杀菌效果评价方法：SNT 3229—2012[S].北京：中国标准出版社，2013：2-17. [8] 劉玉庆，李璐璐，骆延波，等.EUCAST欧盟药敏试验标准[M].北京：中国质检出版社，2016：3-20.
[9] 袁雪梅，姚嘉赟，蔺凌云，等.泥鳅致病性维氏气单胞菌的分离与鉴定[J].浙江农业学报，2018，30（5）：730-737.
[10] 张志强，李永慧，吴同垒，等.致泥鳅点状出血征温和气单胞菌的分类鉴定[J].中国兽医学报，2017，37（6）：1070-1076.
[11] 彭开松.罗非鱼凡隆气单胞菌病的病理学特性及环境对发病的影响[D].北京：中国农业大学，2006.
[12] 徐先栋，李燕华，王海华，等.台湾泥鳅幼鱼红点病病原的分离鉴定及药敏分析[J].水产科学，2018，37（4）：522-526.
[13] 杨移斌，胥宁，董靖，等.台湾泥鳅源维氏气单胞菌Zy01株的分离鉴定及药敏特性研究[J].微生物学通报，2017，44（4）：852-858.
[14] 黄文明，王利，冀国桢，等.胭脂鱼维氏气单胞菌和中间气单胞菌的鉴定及药物敏感性[J].水产科学，2013，32（4）：210-214.
[15] 杨移斌，杨秋红，胥宁，等.斑点叉尾（Ictalunes punctatus）源中间气单胞菌（Aeromonas media）分离鉴定及药敏特性[J].海洋与湖沼，2013，47（6）：1199-1204.
[16] GALINDO C L，SHA J，FADL A A，et al.Host immune responses to Aeromonas virulence factors[J].Curr Immunol Rev，2006，2（1）：13-26.
[17] SCARANO C，PIRAS F，VIRDIS S，et al.Antibiotic resistance of Aeromonas ssp.strains isolated from Sparus aurata reared in Italian mariculture farms[J].International journal of food microbiology，2018，284（2）：91-97.
[18] PIOTROWSKA M，POPOWSKA M.The prevalence of antibiotic resistance genes among Aeromonas species in aquatic environments[J].Annals of microbiology，2014，64（3）：921-934.
关键词 大鳞副泥鳅;皮肤溃烂;气单胞菌;氟苯尼考
中图分类号 S947文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）22-0088-03
Abstract To identify the pathogen of Paramisgurnus dabryanus canker and screen effective drugs for external and internal use，bacterial isolation and identification，virulence gene detection，artificial infection，drug screening and treatment experiment were carried out.The results showed that N1 isolate was Aeromonas media，N2 and N3 were Aeromonas veronii，which carried virulence genes such as aerosol aerA，cytotoxic enterotoxin Act，flagellum Fla and esterase Lip.Half lethal concentrations of N1，N2 and N3 were 105.21，105.88 and 105.53 CFU/tail，respectively.The external and internal medicines were preferred to YouLike and florfenicol，respectively.Aeromonas rmedia and Aeromonas veronii could cause skin ulceration of P.dabryanus，which could be treated by external spraying of YouLike and oral administration of florfenicol.
Key words Paramisgurnus dabryanus;Skin ulceration;Aeromonas spp.;Florfenicol
大鳞副泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）又称台湾泥鳅，隶属鲤形目鳅科。随着大鳞副泥鳅养殖密度的不断增加，水产病害问题日益严重，且以温和气单胞菌（Aeromonas sobria）[1]、创伤弧菌（vibrio vulnificus）[2]、泥鳅气单胞菌（Aeromonas misgurnus）[3]、凡隆气单胞菌（Aeromonas veronii）[4]等细菌感染最为严重。然而，迄今为止尚未见中间气单胞菌感染大鳞副泥鳅的报道。
气单胞菌属（Aeromonas）成员广泛分布于淡水、污水、淤泥、土壤等自然环境，也是重要的人类条件致病菌，能够引起肠道、血液、皮肤和软组织的感染[5]。2017年4月安徽省定远县的某工厂化养殖场的大鳞副泥鳅繁殖亲本发生大面积皮肤溃疡。笔者对该病例的病因分离和治疗进行了报道，以期为类似疾病防控提供参考。
1 材料与方法
1.1 临床诊断分析 对发病前后的水质、寄生虫和饲养管理进行分析。
1.2 细菌分离纯化及鉴定
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1.3 攻毒试验 健康大鳞副泥鳅，体长（8.5±1.1） cm，体重（5.1±0.2） g，饲养在曝气自来水中，水温28～31 ℃。每株菌的攻毒试验设6个剂量组：0（空白对照）、105、106、107、108和109 CFU/mL，每组20尾泥鳅。试验期间，按摄食状况少量投饵，不排污。观察14 d，取濒死或刚死泥鳅，重新进行细菌分离鉴定。
根据上面测定的半数致死浓度，进行混合攻毒试验，每组20尾大鳞副泥鳅，攻毒菌液浓度107 CFU/mL，单株菌注射时，剂量为0.1 mL/（尾·株）;2株菌混合感染时，每株菌注射0.05 mL/（尾·株）;3株菌混合时，每株注射0.033 mL/（尾·株）。
1.4 外用和内服药物筛选
参考商业检验标准（SN/T 3229—2012）[7]，采用稀释-中和法筛选外用消毒剂。参考欧盟标准[8]，采用纸片法和微量肉汤稀释法进行内服抗菌药物（购自中国兽药监察所）的药敏试验。
2 结果与分析
2.1 临床诊断分析
发病池水温在25～28 ℃，水质指标良好。患病大鳞副泥鳅体表黏液增多，体表的中部、尾部出现圆形溃烂。解剖发现脾脏暗红，肝胰脏发黄，苍白。水浸片镜检未见寄生虫。 2.2 细菌形态学生理生化鉴定
从3尾患鳅肝胰脏分别分离纯化得到3株优势菌，命名为N-1株、N-2株、N-3株。营养琼脂平板上28 ℃培养16 h后，菌落呈乳白色，表面光滑，圆形凸起，边缘整齐;3株菌均为革兰氏阴性菌，且6% NaCl胨水和1 %NaCl枸橼酸盐试验均显示阴性，而氧化酶、精氨酸、葡萄糖产气、蔗糖、甘露醇试验均显示阳性。此外，N-1株赖氨酸试验呈阴性，而N-2株、N-3株赖氨酸试验呈阳性。经生化编码鉴定，可判定3株细菌均为气单胞菌属成员。
N-1株、N-2株和N-3株的16S rRNA基因测序BLAST比对显示，其分别与中间气单胞菌、凡隆气单胞菌的相似性最高，均为99 %，系统发育树如图1所示。，综上可确定N-1株为中间气单胞菌，N-2株和N-3株为凡隆气单胞菌。
使用 Mega 4软件进行多序列匹配分析后，采用邻位相连法（Neighborjoining method）构建系统发育树，所构建发育树各分支的置信度由 Bootstrap 进行 1 000 次循环检验。
从中间气单胞菌N-1株中检出的毒力基因有气溶素aerA、细胞毒性肠毒素Act、热不稳定性肠毒素Alt、鞭毛Fla、弹性蛋白酶ahyB、酯酶Lip（图2）等6种毒力基因;从凡隆气单胞菌N-2、N-3株中检测出的毒力基因有气溶素aerA、细胞毒性肠毒素Act、鞭毛Fla、酯酶Lip（图2）等4种毒力基因。
2.3 攻毒试验
大鳞副泥鳅在攻毒后3～7 d相继发病，采用简化寇氏法计算LD50发现，中间气单胞菌N-1株、凡隆气单胞菌N-2株、凡隆气单胞菌N-3株对应的半数致死量（LD50）分别为105.21、105.88、105.53 CFU/尾。死亡的大鳞副泥鳅主要表现为皮肤点状出血和鳍条出血，未见皮肤溃疡。人工感染后发病泥鳅肝胰脏分离菌为攻毒所用菌株。混合感染死亡率见表1。
2.4 有效药物筛选和治疗结果
对市场上效果比较认可的3种含碘制剂（优力克、迪碘和蛋氨酸碘）进行了非清洁条件和清洁条件下的最小抑菌浓度试验。3种碘制剂在清洁条件下的MIC大于500 μL/mL，但综合比较3种碘制剂的效价比，以优力克（嘉兴绿望生物科技有限公司）最高，且考虑优力克能促进创伤愈合，后续治疗中选择优力克的池效果也最好。综合纸片法测定敏感性定性结果（表2）和肉汤法测定的MIC定量结果（表3）可知，可使用的国标渔药中最优选择为氟苯尼考。
由于笔者介入此案例治疗时，死亡已经发生7 d，且部分（40%～70%）泥鳅的溃疡面积已经超过了体表面积的10%以上，且已经烂到肌肉。外用优力克（0.5 g/m3）3次，每隔1 d 1次;内服氟苯尼考（25 mg/kg体重）和多维适量，连续7 d。7 d后死亡终止，创伤面积小于10%且仅真皮层没有完全烂透的泥鳅也逐步恢复。但是，该病例介入治疗已经比较晚，导致部分池的死亡率高达90%。
3 讨论
在泥鳅养殖过程中，皮肤相关疾病多发，一般最开始表现为多发性点状出血病、如不及时治疗会进一步发展为赤皮、腐皮、溃烂、烂鳍等。引起这些症状的细菌以气单胞菌科成员最为常见[3，9-10]。当环境不良、体表损伤、应激等均可诱发气单胞菌感染[11]，该案例中的大鳞副泥鳅有不同程度的体表擦伤，是中间气单胞菌和凡隆气单胞菌继发感染的诱因。患病大鳞副泥鳅是由中间气单胞菌（N-1）和凡隆气单胞菌（N-2、N-3）混合感染引起，其引起的死亡率要比单一菌株感染高。目前，有关大鳞副泥鳅凡隆气单胞菌感染的报道已有2例，分别发生在抚州市[12]、辽宁省[13]，报道中患病大鳞副泥鳅症状以出血溃疡为主，与该研究中情况相似。有关大鳞副泥鳅中间气单胞菌感染的报道尚未发现，但关于中间气单胞菌感染水产动物的研究报道已有2例，分别发生在成都[14]和湖南常德[15]，报道中患病鱼症状均以出血为主。
气单胞菌属细菌可单独或与其他病原菌混合感染[3]。其致病性与多种胞外水解酶（如脂肪酶和蛋白酶）和非酶类毒力因子（细胞毒性腸毒素、气溶素等）有关，这毒力因子有助于细菌入侵和感染的建立[16-17]。
气单胞菌的耐药性日益严重，因此处理临床病例时，需进行药敏试验，才能科学用药[18]。该案例的中间气单胞菌和凡隆气单胞菌对药物的敏感性结果与上述报道菌株的药敏结果差异明显。综合评价内服以国标渔药氟苯尼考最优，外用以新型创伤愈合促进消毒剂优力克最好。
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[10] 张志强，李永慧，吴同垒，等.致泥鳅点状出血征温和气单胞菌的分类鉴定[J].中国兽医学报，2017，37（6）：1070-1076.
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