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【摘要】 目的 研究全硫代反义寡核苷酸（PSASODN）对人膀胱癌细胞Ej端粒酶活性及细胞生长的影响，探讨PSASODN在膀胱癌治疗中的价值，为临床治疗膀胱癌提供理论依据。方法 将PSASODN 转染作用于人膀胱癌细胞Ej中，分别采用MTT法、流式细胞术、酶联免疫吸附( ELISA) 法检测不同浓度PSASODN对人膀胱癌细胞Ej的细胞增殖、细胞凋亡和端粒酶活性的作用。结果 PSASODN作用于人膀胱癌细胞Ej后能显著抑制人膀胱癌细胞Ej的端粒酶活性，抑制癌细胞生长增殖，促进细胞凋亡，而且呈现时间特异性和剂量依赖性，与SODN 转染组及空白对照组进行比较，差异显著(P＜0.05或0.01)。结论 PSASODN能抑制人膀胱癌细胞Ej的生长，降低其端粒酶活性并诱导细胞凋亡；抑制端粒酶活性可能成为膀胱癌基因治疗的新靶点。
【关键词】 全硫代反义寡核苷酸；膀胱癌；端粒酶
文章编号：1003-1383(2008)02-0130-03中图分类号：R 737.14文献标识码：A
Inhibitory effects of the proliferation of human bladder carcinomaEj cell by antisense phosphorothioate oligonucleotide [HJ1*2]
GUO Wei1，CHEN Meini2，FENG Jizhou1
(1. Department of urinary surgery, affiliated hospital of Yan'an University, Yan'an, 716000；2. Medical college of Yan'an University, Yan'an, 716000)
【Abstract】 Objective To study the effects of antisense phosphorothioate oligodeoxy nucleotides (PSASODN) on telomerase activity and proliferation of bladder carcinoma Ej cell, and explore the treatment value of PSASODN for bladder cancer.
Methods PSASODN was transfected into bladder cancer cell line Ej by liposomal transfection. Effects of different PSASODN density on proliferation activity of cell proliferation, cell withering, activity of telomerase of Ej were examined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT), flow cytometermethod and ELISA.Results Telomerase activity of Ej cells, transfected with PSASODN, was significantly inhibited, compared with that of control groups and nonsense oligonucleotide (SODN) transfected cells (P＜0.05 or 0.01)，and showed no difference between the latter two groups (P＞0.05). Inhibitory effect of PSASODN was showed in a dose and timedepended manner. The proliferation of Ej cells transfected with ASODN undergoing apoptosis was statistically lower than that of control groups (P＜0.05).
Conclusion PSASODN can inhibit the growth of Ej Cells and decrease telomerase activity, causing the revulsion of cell withering. The results suggested that inhibition of telomerase activity would be a new target to treatment for bladder cancer.
【Key words】 antisense phosphorothioate oligonucleotide；bladder cancer; telomerase
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。端粒酶抑制剂能够抑制端粒酶的活性,使肿瘤细胞完全失去增殖能力，趋于分化和凋亡，成为研究热点之一。本文拟通过观察针对端粒酶模板设计的全硫代反义寡核苷酸(PSASODN) 对人膀胱癌Ej细胞端粒酶活性的影响，为膀胱肿瘤基因治疗临床应用提供新的基因靶点。
材料与方法
1.材料 人膀胱癌细胞株Ej(上海细胞库)；RPMI-1640培养基、胎牛血清(SIGMA公司)； PSASODN序列为5’CTCAGTTAGGGTTAGACA-3’，PSSODN序列为5’CATTTCTTGCTCTCCACG3’，均为全硫代修饰型(上海生工生物工程公司)；脂质体(Beyotime Biotechnology公司)；半定量端粒酶检测试剂盒(大连泛邦生物公司)；离心机(上海安亭仪器厂)；流式细胞仪(美国Coulter公司)； Biocellhtl型全自动酶标仪(南京华东公司)。
2.方法(1)细胞培养 膀胱癌细胞Ej以5×104/ml密度接种在含10%新鲜胎牛血清、100 U/ml庆大霉素的RPMI-1640 培养液中，置37℃、5% CO2孵箱中培养，隔天换液一次，取对数生长期细胞用于实验。
(2)细胞转染 脂质体介导的全硫代反义寡核苷酸转染按说明书操作。实验分5组，每组设6个复孔。5组分别为
终浓度为5 μmol/L，3 μmol/L 及1 μmol/L 的ASODN组，终浓度为 5 μmol/L的SODN组以及正常对照组(仅加培养液)。用药后将小牛血清的浓度调至5%，以减少寡聚脱氧核苷酸的降解。24 h后弃去转染液，换新鲜培养液，并继续培养，收集细胞备用。
(3)MTT法检测细胞生长抑制率 细胞以5×104 /ml密度接种在96孔培养板上，每孔100 μl，待细胞生长活跃时加处理因素，分组同细胞转染。分别培养24 h、48 h、72 h 后检测。检测方法：每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，继续培养4 h，翻板倒掉液体，每孔加入二甲基亚砜(DMSO) 150 μl，轻轻振荡10 min，用自动酶标仪检测540 nm处的吸光度(OD) 值。计算细胞生长抑制率。抑制率（％）＝(空白对照组平均OD值-PSASODN组平均OD值)/空白对照组平均OD值。
(4)端粒酶活性检测 取处理因素作用24 h、48 h、72 h后的细胞104个，PBS洗涤后离心去上清，加裂解液10 μl，冰浴放置30 min，4℃、15000 rpm 离心10 min，取上清液保存于-80℃，以备端粒酶活性检测。按试剂盒说明书操作，检测每组在450 nm处的OD值，并计算相应的端粒酶活性。Index=样品的OD值/ 标准液的OD值。结果判断:Index≥1为+；Index在0.91～0.99为+/-；Index≤0.90为-。
(5)流式细胞仪检测 取处理因素作用24 h、48 h、72 h后的细胞106个，70%酒精固定24 h，冷PBS洗涤3次，15000 rpm离心10 min，弃上清，碘化丙啶避光染色30 min，上机测试细胞凋亡。
3.统计学处理 计量资料以-±s表示，用SPSS 11.5软件包处理，组间比较采用单因素方差分析及q检验。
结果
1.MTT检测结果 5 μmol/L，3 μmol/L及1 μmol/L的PSASODN 转染Ej细胞后24 h，对细胞增殖无明显抑制，与对照组比较(P＞0.05)；48 h能够抑制细胞增殖，与对照组比较(P＜0.05)，并呈剂量依赖关系；72 h与对照组比较能够显著抑制细胞的增殖 (P＜0.01)，并呈剂量依赖关系。表明对Ej细胞活性的影响在48 h左右开始起作用，呈剂量和时间依赖性(表1)。
2.PSASODN对膀胱癌细胞Ej端粒酶活性的影响 作用24 h、48 h的各组细胞端粒酶活性均为阳性。72 h检测结果表明：5 μmol/L的SODN转染的Ej细胞端粒酶仍表现为阳性；ASODN转染Ej细胞后，端粒酶活性显著降低，呈剂量依赖性(表2)。
讨论
端粒酶是控制肿瘤细胞增生及凋亡的重要调控物质之一［1］，高活性的端粒酶是肿瘤细胞无限增殖的必需条件之一，而在多数正常的体细胞中却缺乏活性，因此抗端粒酶疗法具有特异性高，选择性强等特点，逐渐成为治疗肿瘤的热点［2，3］。全硫代修饰的反义核酸溶解性好，不易被核酸降解，半衰期长，作用持久的特点，更适于临床应用［4］。脂质体为非毒性载体，无插入突变危险，将核酸导入细胞后即被降解，无毒物免疫原性，效率高，特异性强，具有良好的应用前景［5］。
研究表明，用反义hTR转染HeLa细胞，端粒酶活性明显降低，端粒缩短［6］。国内学者的研究也证实端粒酶反义核酸能抑制多种癌细胞的端粒酶活性［7～9］。该点在本研究中同样得到证实，人膀胱癌细胞Ej细胞经端粒酶PSASODN作用后，端粒酶活性受到抑制，而PSSODN对人膀胱癌细胞Ej细胞的端粒酶无抑制作用，提示PSASODN对细胞端粒酶活性的抑制作用是序列特异性的，这种作用表现为剂量依赖性和时间依赖性。端粒酶活性与细胞增殖有关［10］，而且这种端粒酶活性抑制所诱导的凋亡是p53非依赖的，可能是端粒酶活性抑制后影响到染色体的稳定性，由此激发某种非p53依赖的信号系统从而诱导了凋亡［11，12］。caspase家族也可能参与了端粒酶RNA组分的反义寡核苷酸所诱导的凋亡［13］。本实验结果也显示PSASODN转染人膀胱癌细胞Ej细胞后，不仅端粒酶活性下降，细胞生长抑制，凋亡明显，而且呈现出剂量依赖性和时间依赖性。
本实验为临床应用PSASODN治疗膀胱癌提供了理论依据。但是端粒酶抑制剂对生殖细胞、造血干细胞等端粒酶表达阳性的正常细胞也可能产生毒副作用。因此，此疗法应用于膀胱癌的临床治疗尚需进一步的研究和探索。
参考文献
［1］Fu W, Begley J, Killers MW, et al. Anti-apoptotic role of telomerase in pheochromocytoma cells［J］.J Biol Chem,1999, 274(11):7264-7271.
［2］Greider CW.Telomerase activity, cell proliferation and cancer［J］.Proc NatlAcad Sci USA,1998,95:90.
［3］TaoM, Mivano Kurosaki N, Takai K.Specific inhibition of human telomerase activity by transfection reagent, Fu GENT6 -antisense phosphorothioate oligonucleotide comp lex in Hela cells［J］.FEBS Lett,1999,454 (3):312.
［4］Kimura S, Maekawa T, Hirakawa K, et al. Alterations of c-myc expression by antisense oligoxynucleotides enhance the induction of apoptosis in HL-60 cells［J］.Cancer Res,1995,55(6):1379-1384..
［5］LondonoVallejo JA,DerSarkissian H,Cazes L,et al.Differences in telomere length between homologous chromosomes in humans［J］.Nucleic Acids Res,2001,29 (15):3164-3171.
［6］feng J, Funk W D, Wang S S，et al. The RNA component of human telomerase［J］.Science,1995,269:1236.
［7］梅 玫，余 虹，张维铭，等.硫代修饰的反义寡核苷酸抑制肺癌细胞系端粒酶活性及增殖的研究［J］.中华病理学杂志，2000,29(3):204.
［8］侯丽宏，孙秉中.端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对HL-60细胞生长的作用［J］.第四军医大学学报，1999,20(8):653.
［9］许兰涛，苏金龙.端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人肺癌细胞的作用［J］.肿瘤杂志，2002，22（1）：42-44.
［10］Greider CW, Blackburn EH. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts［J］.Cell, 1985, 43:405-413.
［11］Zhang X,Mar V,Zhou W,et al.Telomere shortening and apoptosis in telomerase ihhibited human tumor cells［J］.Genes Dev，1999,13:2388-2399.
［12］Hahn W C,Stewart S A,Brooks M W,et al.Inhibition for telomerase limits the growth of human cancel cells［J］.Nat Med,1999,5:1164-1170.
［13］Koga S,Kondo Y,Komata T，et al.Treatment of bladder cancer cells in vitro and in vivo with 2-5A antisense telomerase RNA［J］.Gene Ther,2001,8:654.
(收稿日期：2008-02-13 修回日期：2008-04-12)
(编辑：梁明佩 英文审校：唐雄林)
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。
【关键词】 全硫代反义寡核苷酸；膀胱癌；端粒酶
文章编号：1003-1383(2008)02-0130-03中图分类号：R 737.14文献标识码：A
Inhibitory effects of the proliferation of human bladder carcinomaEj cell by antisense phosphorothioate oligonucleotide [HJ1*2]
GUO Wei1，CHEN Meini2，FENG Jizhou1
(1. Department of urinary surgery, affiliated hospital of Yan'an University, Yan'an, 716000；2. Medical college of Yan'an University, Yan'an, 716000)
【Abstract】 Objective To study the effects of antisense phosphorothioate oligodeoxy nucleotides (PSASODN) on telomerase activity and proliferation of bladder carcinoma Ej cell, and explore the treatment value of PSASODN for bladder cancer.
Methods PSASODN was transfected into bladder cancer cell line Ej by liposomal transfection. Effects of different PSASODN density on proliferation activity of cell proliferation, cell withering, activity of telomerase of Ej were examined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT), flow cytometermethod and ELISA.Results Telomerase activity of Ej cells, transfected with PSASODN, was significantly inhibited, compared with that of control groups and nonsense oligonucleotide (SODN) transfected cells (P＜0.05 or 0.01)，and showed no difference between the latter two groups (P＞0.05). Inhibitory effect of PSASODN was showed in a dose and timedepended manner. The proliferation of Ej cells transfected with ASODN undergoing apoptosis was statistically lower than that of control groups (P＜0.05).
Conclusion PSASODN can inhibit the growth of Ej Cells and decrease telomerase activity, causing the revulsion of cell withering. The results suggested that inhibition of telomerase activity would be a new target to treatment for bladder cancer.
【Key words】 antisense phosphorothioate oligonucleotide；bladder cancer; telomerase
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。端粒酶抑制剂能够抑制端粒酶的活性,使肿瘤细胞完全失去增殖能力，趋于分化和凋亡，成为研究热点之一。本文拟通过观察针对端粒酶模板设计的全硫代反义寡核苷酸(PSASODN) 对人膀胱癌Ej细胞端粒酶活性的影响，为膀胱肿瘤基因治疗临床应用提供新的基因靶点。
材料与方法
1.材料 人膀胱癌细胞株Ej(上海细胞库)；RPMI-1640培养基、胎牛血清(SIGMA公司)； PSASODN序列为5’CTCAGTTAGGGTTAGACA-3’，PSSODN序列为5’CATTTCTTGCTCTCCACG3’，均为全硫代修饰型(上海生工生物工程公司)；脂质体(Beyotime Biotechnology公司)；半定量端粒酶检测试剂盒(大连泛邦生物公司)；离心机(上海安亭仪器厂)；流式细胞仪(美国Coulter公司)； Biocellhtl型全自动酶标仪(南京华东公司)。
2.方法(1)细胞培养 膀胱癌细胞Ej以5×104/ml密度接种在含10%新鲜胎牛血清、100 U/ml庆大霉素的RPMI-1640 培养液中，置37℃、5% CO2孵箱中培养，隔天换液一次，取对数生长期细胞用于实验。
(2)细胞转染 脂质体介导的全硫代反义寡核苷酸转染按说明书操作。实验分5组，每组设6个复孔。5组分别为
终浓度为5 μmol/L，3 μmol/L 及1 μmol/L 的ASODN组，终浓度为 5 μmol/L的SODN组以及正常对照组(仅加培养液)。用药后将小牛血清的浓度调至5%，以减少寡聚脱氧核苷酸的降解。24 h后弃去转染液，换新鲜培养液，并继续培养，收集细胞备用。
(3)MTT法检测细胞生长抑制率 细胞以5×104 /ml密度接种在96孔培养板上，每孔100 μl，待细胞生长活跃时加处理因素，分组同细胞转染。分别培养24 h、48 h、72 h 后检测。检测方法：每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，继续培养4 h，翻板倒掉液体，每孔加入二甲基亚砜(DMSO) 150 μl，轻轻振荡10 min，用自动酶标仪检测540 nm处的吸光度(OD) 值。计算细胞生长抑制率。抑制率（％）＝(空白对照组平均OD值-PSASODN组平均OD值)/空白对照组平均OD值。
(4)端粒酶活性检测 取处理因素作用24 h、48 h、72 h后的细胞104个，PBS洗涤后离心去上清，加裂解液10 μl，冰浴放置30 min，4℃、15000 rpm 离心10 min，取上清液保存于-80℃，以备端粒酶活性检测。按试剂盒说明书操作，检测每组在450 nm处的OD值，并计算相应的端粒酶活性。Index=样品的OD值/ 标准液的OD值。结果判断:Index≥1为+；Index在0.91～0.99为+/-；Index≤0.90为-。
(5)流式细胞仪检测 取处理因素作用24 h、48 h、72 h后的细胞106个，70%酒精固定24 h，冷PBS洗涤3次，15000 rpm离心10 min，弃上清，碘化丙啶避光染色30 min，上机测试细胞凋亡。
3.统计学处理 计量资料以-±s表示，用SPSS 11.5软件包处理，组间比较采用单因素方差分析及q检验。
结果
1.MTT检测结果 5 μmol/L，3 μmol/L及1 μmol/L的PSASODN 转染Ej细胞后24 h，对细胞增殖无明显抑制，与对照组比较(P＞0.05)；48 h能够抑制细胞增殖，与对照组比较(P＜0.05)，并呈剂量依赖关系；72 h与对照组比较能够显著抑制细胞的增殖 (P＜0.01)，并呈剂量依赖关系。表明对Ej细胞活性的影响在48 h左右开始起作用，呈剂量和时间依赖性(表1)。
2.PSASODN对膀胱癌细胞Ej端粒酶活性的影响 作用24 h、48 h的各组细胞端粒酶活性均为阳性。72 h检测结果表明：5 μmol/L的SODN转染的Ej细胞端粒酶仍表现为阳性；ASODN转染Ej细胞后，端粒酶活性显著降低，呈剂量依赖性(表2)。
讨论
端粒酶是控制肿瘤细胞增生及凋亡的重要调控物质之一［1］，高活性的端粒酶是肿瘤细胞无限增殖的必需条件之一，而在多数正常的体细胞中却缺乏活性，因此抗端粒酶疗法具有特异性高，选择性强等特点，逐渐成为治疗肿瘤的热点［2，3］。全硫代修饰的反义核酸溶解性好，不易被核酸降解，半衰期长，作用持久的特点，更适于临床应用［4］。脂质体为非毒性载体，无插入突变危险，将核酸导入细胞后即被降解，无毒物免疫原性，效率高，特异性强，具有良好的应用前景［5］。
研究表明，用反义hTR转染HeLa细胞，端粒酶活性明显降低，端粒缩短［6］。国内学者的研究也证实端粒酶反义核酸能抑制多种癌细胞的端粒酶活性［7～9］。该点在本研究中同样得到证实，人膀胱癌细胞Ej细胞经端粒酶PSASODN作用后，端粒酶活性受到抑制，而PSSODN对人膀胱癌细胞Ej细胞的端粒酶无抑制作用，提示PSASODN对细胞端粒酶活性的抑制作用是序列特异性的，这种作用表现为剂量依赖性和时间依赖性。端粒酶活性与细胞增殖有关［10］，而且这种端粒酶活性抑制所诱导的凋亡是p53非依赖的，可能是端粒酶活性抑制后影响到染色体的稳定性，由此激发某种非p53依赖的信号系统从而诱导了凋亡［11，12］。caspase家族也可能参与了端粒酶RNA组分的反义寡核苷酸所诱导的凋亡［13］。本实验结果也显示PSASODN转染人膀胱癌细胞Ej细胞后，不仅端粒酶活性下降，细胞生长抑制，凋亡明显，而且呈现出剂量依赖性和时间依赖性。
本实验为临床应用PSASODN治疗膀胱癌提供了理论依据。但是端粒酶抑制剂对生殖细胞、造血干细胞等端粒酶表达阳性的正常细胞也可能产生毒副作用。因此，此疗法应用于膀胱癌的临床治疗尚需进一步的研究和探索。
参考文献
［1］Fu W, Begley J, Killers MW, et al. Anti-apoptotic role of telomerase in pheochromocytoma cells［J］.J Biol Chem,1999, 274(11):7264-7271.
［2］Greider CW.Telomerase activity, cell proliferation and cancer［J］.Proc NatlAcad Sci USA,1998,95:90.
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［4］Kimura S, Maekawa T, Hirakawa K, et al. Alterations of c-myc expression by antisense oligoxynucleotides enhance the induction of apoptosis in HL-60 cells［J］.Cancer Res,1995,55(6):1379-1384..
［5］LondonoVallejo JA,DerSarkissian H,Cazes L,et al.Differences in telomere length between homologous chromosomes in humans［J］.Nucleic Acids Res,2001,29 (15):3164-3171.
［6］feng J, Funk W D, Wang S S，et al. The RNA component of human telomerase［J］.Science,1995,269:1236.
［7］梅 玫，余 虹，张维铭，等.硫代修饰的反义寡核苷酸抑制肺癌细胞系端粒酶活性及增殖的研究［J］.中华病理学杂志，2000,29(3):204.
［8］侯丽宏，孙秉中.端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对HL-60细胞生长的作用［J］.第四军医大学学报，1999,20(8):653.
［9］许兰涛，苏金龙.端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人肺癌细胞的作用［J］.肿瘤杂志，2002，22（1）：42-44.
［10］Greider CW, Blackburn EH. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts［J］.Cell, 1985, 43:405-413.
［11］Zhang X,Mar V,Zhou W,et al.Telomere shortening and apoptosis in telomerase ihhibited human tumor cells［J］.Genes Dev，1999,13:2388-2399.
［12］Hahn W C,Stewart S A,Brooks M W,et al.Inhibition for telomerase limits the growth of human cancel cells［J］.Nat Med,1999,5:1164-1170.
［13］Koga S,Kondo Y,Komata T，et al.Treatment of bladder cancer cells in vitro and in vivo with 2-5A antisense telomerase RNA［J］.Gene Ther,2001,8:654.
(收稿日期：2008-02-13 修回日期：2008-04-12)
(编辑：梁明佩 英文审校：唐雄林)
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。