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[摘要] 目的 探讨神经干细胞（NSCs）与嗅鞘细胞（OECs）联合移植对帕金森病（PD）大鼠运动行为及非运动行为的影响。
方法取孕11～12 d胎鼠中脑组织培养NSCs并鉴定，取出生1～3 d乳鼠嗅球培养OECs并鉴定。采用内侧前脑束与黑质注射6-羟多巴胺（6-OHDA）的方法制备PD大鼠模型。将大鼠随机分为Sham组（生理盐水代替6-OHDA）、PD对照组、NSCs移植组、OECs移植组、NSCs与OECs联合移植组。移植1周后各组进行阿扑吗啡诱导的旋转实验和旷场实验。
结果与PD对照组相比，联合移植组旋转实验中旋转圈速更低（F=23.48，q=3.90，P<0.05），旷场实验中运动距离更长（F=4.59，q=4.16，P<0.05），曠场中心区域活动时间和周围区域活动时间比值也更低（F=3.72，q=4.65，P<0.05）;NSCs和OECs单独移植组上述指标与PD对照组相比差异均无统计学意义（P>0.05）。
结论胚胎中脑组织来源的NSCs与OECs联合移植可以改善PD大鼠的运动及非运动能力。
[关键词] 帕金森病;神经干细胞;嗅鞘细胞;细胞移植;大鼠
[中图分类号] R338.2;R742.5
[文献标志码] A
[文章编号] 2096-5532（2019）01-0017-05
EFFECT OF COMBINED TRANSPLANTATION OF NEURAL STEM CELLS AND OLFACTORY ENSHEATHING CELLS ON MOTOR AND NON-MOTOR BEHAVIORS IN RATS WITH PARKINSON’S DISEASE
ZHOU Nannan， WANG Youcui， HUANG Yuju， XIE Junxia
（Department of Physiology， State Key Disciplines： Physiology， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）
[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of combined transplantation of neural stem cells （NSCs） and olfactory ensheathing cells （OECs） on motor and non-motor behaviors in rats with Parkinson’s disease （PD）.
MethodsNSCs were collec-ted from the mid-brain tissue of fetal rats aged 11-12 d and were then cultured and identified. OECs were collected from the olfactory bulbs of neonatal rats aged 1-3 d and were then cultured and identified. A rat model of PD was established by injection of 6-OHDA into the medial forebrain bundle and the substantia nigra. The rats were randomly divided into Sham group （6-OHDA was replaced by normal saline）， PD control group， NSCs transplantation group， OECs transplantation group， and NSCs-OECs combined with transplantation group. At one week after transplantation， the apomorphine-induced rotation test and the open field test were performed for each group.
ResultsCompared with the PD control group， the NSCs-OECs combined with transplantation group had a significantly lower rotational speed in the rotation test （F=23.48，q=3.90，P<0.05）， a significantly longer movement distance in the open field test （F=4.59，q=4.16，P<0.05）， and a significantly lower ratio of the activity time in the central area to the activity time in the surrounding area （F=3.72，q=4.65，P<0.05）. There were no significant differences in the above indices between the NSCs transplantation group/OECs transplantation group and the PD control group （P>0.05）. ConclusionCombined transplantation of NSCs derived from the embryonic mid-brain tissue and OECs can improve the motor and non-motor beha-viors of PD rats.
[KEY WORDS]Parkinson disease; neural stem cells; olfactory ensheathing cells; cell transplantation; rats
帕金森病（PD）现已成为仅次于阿尔兹海默病的第二大神经退行性疾病[1]。近年来，我国PD病人数量随着人口老龄化的加剧而急剧上升，但目前该病仍无有效治疗方法。近30年來，干细胞研究所取得的成就为PD治疗带来了新的希望[2]。PD主要的病理学特征是中脑黑质多巴胺能神经元（DNs）的渐进性丢失，导致纹状体内多巴胺（DA）消耗殆尽[3]。理论上，通过向受损区域补充DNs就有可能恢复或重建原有的功能。近年来，研究人员在使用神经干细胞（NSCs）移植治疗PD方面进行了大量
的研究[4]。最近的研究结果表明，人胚胎干细胞来源的NSCs移植到PD大鼠的纹状体后能够分化成具有功能的DNs[5]，而人孤雌干细胞来源的NSCs移植治疗PD病人也具有良好的组织相容性和低致瘤性[6]。但受损的黑质和纹状体系统缺乏DNs存活和发育所需的微环境，如神经营养因子（NTFs）匮乏[7]，DNs变性死亡导致小胶质细胞大量活化并产生大量炎症因子，导致NSCs存活率低，且不利于NSCs向DNs方向分化[8-9]。因此，优化NSCs移植条件，为NSCs提供良好的局部微环境，具有非常重要的意义。嗅鞘细胞（OECs）是一种介于施旺细胞与星形胶质细胞之间的特殊类型的胶质细胞[10]，可分泌多种促进神经元发育和存活的NTFs，还可分泌多种细胞外基质蛋白[11]。有研究证实，OECs与胚胎中脑组织联合移植8周后能明显改善6-羟多巴胺（6-OHDA）诱导的PD大鼠的运动功能[12]。然而，短时间内NSCs与OECs联合移植是否对PD大鼠的运动及非运动行为产生影响鲜有报道，本研究对此进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 实验动物
SPF级成年雄性Wistar大鼠70只，体质量为（250±10）g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。孕鼠和出生1～3 d乳鼠由青岛大任富城公司提供。将成年雄性大鼠随机分为Sham组（A组）、PD对照组（B组）、NSCs移植组（C组）、OECs移植组（D组）和NSCs与OECs联合移植组（简称联合移植组，E组）。
1.2 药物和试剂
盐酸阿扑吗啡（APO）、6-OHDA（Sigma公司），DMEM/F12培养液、DMEM高糖培养液（Hyclone公司），青链霉素混合液（Solarbio公司），表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）、胎牛血清和B-27supplement（Gibco公司），小鼠源Nestin单克隆抗体（Millipore公司），即用型山羊血清（武汉博士德生物工程有限公司），兔源P75NTR单克隆抗体（Abcam公司），兔抗鼠IgG荧光二抗（Invitrogen公司），驴抗兔IgG荧光二抗（Life technologies公司），4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）细胞核染色液（碧云天公司）。
1.3 NSCs的培养与鉴定
取孕11～12 d大鼠胚胎中脑组织，剔除表面的脑膜，吹打均匀，用200目筛网过滤离心后进行无菌培养，用含体积分数0.02 B-27supplement、10 g/L青链霉素混合液、20 μg/L EGF、10 μg/L bFGF的DMEM/F12培养液进行培养。NSCs培养5～7 d时进行传代，传至第3代时用于鉴定和移植。NSCs经40 g/L多聚甲醛固定10 min，即用型山羊血清封闭，加入小鼠源Nestin单克隆抗体（1∶200），4 ℃孵育过夜;洗脱后加兔抗小鼠IgG荧光二抗（1∶500）室温下孵育2 h，加入DAPI室温下染色细胞核5 min后洗脱并封片拍照。
1.4 OECs的培养与鉴定
取出生1～3 d乳鼠嗅球，剔除表面的脑膜，吹打均匀，加入2.5 g/L胰酶37 ℃消化10～15 min，用200目筛网过滤离心后进行无菌培养，再用含体积分数0.10胎牛血清、10 g/L 青链霉素混合液的DMEM高糖培养液进行培养。采用Nash差速贴壁法[13]纯化OECs。OECs培养4～5 d时进行换液。将OECs接种于多聚赖氨酸包被的玻片上，4～5 d进行全量换液。培养10 d左右的OECs用兔源P75NTR单克隆抗体（1∶50）行免疫鉴定（同NSCs）。
1.5 PD大鼠模型的制备
在右侧内侧前脑束和黑质两点注射6-OHDA制备PD大鼠模型。参照以往的文献[14]，采用大鼠脑立体定位图谱进行定位，并注射3.6 g/L的6-OHDA。注射药液体积和坐标如下：A点3 μL（前囟后-4.4 mm，旁开-1.2 mm，深度-7.8 mm）;B点2.5 μL（前囟后-4.0 mm，旁开-0.8 mm，深度-8.0 mm）[15]。Sham组则以等体积的生理盐水代替。在6-OHDA造模手术后28 d，对大鼠进行APO（0.1 mg/kg）颈部皮下注射，连续检测30 min大鼠由损毁侧向健康侧旋转总圈数[16]，并计算旋转速度，若旋转速度>7 r/min，则证明PD模型构建成功。
1.6 细胞移植
在6-OHDA造模手术后28 d，选择PD模型大鼠进行细胞移植，移植坐标为前囟后+0.5 mm、旁开-2.0 mm、深度-5.0 mm。细胞移植各组在上述坐标注入新鲜制备的细胞密度为2.5×1011/L的细胞悬液2 μL。PD对照组用2 μL的DMEM高糖培养液替代细胞悬液。联合移植组NSCs与OECs的细胞数之比为1∶1。 1.7 旋转实验
细胞移植术后7 d，对大鼠进行APO（0.1 mg/kg）颈部皮下注射，连续检测30 min大鼠由损毁侧向健康侧旋转总圈数，并计算旋转速度。
1.8 旷场实验
细胞移植术后7 d，将待测大鼠轻轻放置在旷场中心区域，通过视频捕获分析系统自动记录大鼠自主活动10 min。采用Ethvision XT软件自动获取每只大鼠在旷场中的运动距离及在中心区域活动时间（Pt）和周围区域活动时间（Ct）[17]。以大鼠在旷场中的运动距离反映其运动行为能力;以Pt/Ct反映大鼠的焦虑程度，比值越高说明焦虑程度越高，反之则越低[18]。
1.9 统计学分析
应用SPSS和GraphPad Prism軟件进行统计学分析，计量资料结果以[AKx-D]±s形式表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA检验），以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 NSCs与OECs的鉴定
培养至第3代的NSCs的免疫荧光染色显示，细胞球内的NSCs呈Nestin阳性，说明培养后细胞球能保持NSCs的增殖特性。OECs的免疫荧光染色显示，生物标记物P75NTR呈阳性，说明贴壁的绝大多数细胞为OECs。
2.2 行为学实验
旋转实验结果显示，与Sham组相比，其余4组大鼠的旋转速度均明显增加（F=23.48，q=6.81～12.81，P<0.01）;与PD组相比，联合移植组的旋转速度明显降低（q=3.90，P<0.05）。见表1。
旷场实验结果显示，与Sham组相比，PD对照组和OECs移植组的旷场运动距离较短（F=4.59，q=5.03、4.20，P<0.05）;与PD对照组相比，NSCs移植组和OECs移植组的旷场运动距离虽有升高，但差异无统计学意义（P>0.05），而联合移植组的旷场运动距离明显增加（q=4.16，P<0.05）;联合移植组的旷场运动距离与两个单独移植组相比较差异无统计学意义（P>0.05）。PD对照组的Pt/Ct较Sham组明显增高（F=3.72，q=4.75，P<0.05），OECs移植组和联合移植组的Pt/Ct较PD对照组明显降低（q=4.73、4.65，P<0.05）。见表1。
3 讨 论
当改善病人的运动功能，这拉开了细胞替代治疗PD的序幕。但目前也有研究显示，NSCs移植治疗PD还存在很多问题，如细胞存活率低[20]，这与移植宿主的局部微环境息息相关[21]，而受损的黑质纹状体系统显然不利于NSCs的存活、增殖与分化[22]。研究表明，OECs能分泌大量的NTFs和细胞因子，可改善局部微环境，促进NSCs向DNs方向分化，并为残存的神经元提供营养支持[23]。这为NSCs分化为更多的DNs以替代退行性病变丢失的神经元和恢复神经功能奠定了基础。
JOHANSSON等[12]将胚胎VM与OECs联合移植入PD大鼠，2、3、7、8周后，与对照组相比，单独VM或OECs移植组与二者联合移植组的运动功能均有明显改善，但与单独OECs或VM移植组相比较，联合移植组的改善效果更好，差异有统计学意义，而两个单独移植组间比较差异无统计学意义。本研究结果显示，NSCs与OECs联合移植1周后，PD大鼠的运动功能明显改善，与PD对照组相比差异有统计学意义;联合移植组与单独移植组相比以及单独移植组与PD对照组相比较虽有改善，但差异却无统计学意义。推测联合移植组之所以能够改善PD大鼠的运动功能，可能是由于OECs分泌的NTFs和各种细胞因子改善了NSCs所处的局部微环境，提高了移植后NSCs存活率和分化成DNs的能力;而单独移植后的NSCs存活率较低，NSCs分化成DNs的数量较少，且OECs分泌各种营养因子来发挥神经保护作用与促进神经元的成熟均需要时间，致使NSCs与OECs单独移植1周不能显著改善PD大鼠的运动功能。另有研究表明，单独OECs移植24周后PD大鼠的运动功能没有改善，这也许是由于随着时间的延长，OECs的神经保护作用逐渐丧失;但OECs与NSCs联合移植确实比NSCs单独移植更能改善PD大鼠的运动功能，且差异有统计学意义[24]，这可能是由于OECs保护更多的NSCs存活下来，并促进其分化成具有功能的DNs，
故而产生更好且稳定地促进PD大鼠运动功能改善的作用。由此可见，OECs体内移植时，其神经保护功能在初期发挥巨大作用，但保持稳定而持久的改善作用还需NSCs分化的DNs替代退行性病变丢失的神经元，故OECs与NSCs联合移植治疗PD是一种具有很大开发潜力的方法。
既往研究多关注NSCs移植促进PD模型动物运动功能的改善，而鲜少关注对非运动症状的影响。本研究结果表明，OECs与NSCs联合移植1周后，PD大鼠的非运动症状明显改善，即二者联合移植可以缓解PD大鼠的焦虑症状;单独移植OECs也可显著降低PD大鼠的焦虑程度。推测OECs移植组或联合移植组之所以能够在短时间内改善PD大鼠的焦虑程度，可能均得益于OECs的神经保护作用，故单独移植NSCs组没有明显的改善效果。
冯蕾等[25]的研究结果表明，将OECs条件培养基用于培养6-OHDA损伤的PC12细胞，可显著提高PC12细胞BCL2/Bax的表达比率，从而降低6-OHDA对PC12的损伤。体内研究显示，OECs与NSCs联合移植治疗创伤性脑外伤模型大鼠时可抑制炎症因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达，从而促进TBI大鼠神经功能的恢复[26]。然而目前OECs与NSCs联合移植促进PD动物模型运动功能改善的作用机制还不清楚，需进一步探究。 綜上所述，NSCs和OECs两种细胞联合移植能够在短期内改善PD大鼠的运动功能与焦虑症状，为细胞治疗PD提供了新的实验支持，但相关机制还不清楚，仍需进一步研究。
[参考文献]
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结果与PD对照组相比，联合移植组旋转实验中旋转圈速更低（F=23.48，q=3.90，P<0.05），旷场实验中运动距离更长（F=4.59，q=4.16，P<0.05），曠场中心区域活动时间和周围区域活动时间比值也更低（F=3.72，q=4.65，P<0.05）;NSCs和OECs单独移植组上述指标与PD对照组相比差异均无统计学意义（P>0.05）。
结论胚胎中脑组织来源的NSCs与OECs联合移植可以改善PD大鼠的运动及非运动能力。
[关键词] 帕金森病;神经干细胞;嗅鞘细胞;细胞移植;大鼠
[中图分类号] R338.2;R742.5
[文献标志码] A
[文章编号] 2096-5532（2019）01-0017-05
EFFECT OF COMBINED TRANSPLANTATION OF NEURAL STEM CELLS AND OLFACTORY ENSHEATHING CELLS ON MOTOR AND NON-MOTOR BEHAVIORS IN RATS WITH PARKINSON’S DISEASE
ZHOU Nannan， WANG Youcui， HUANG Yuju， XIE Junxia
（Department of Physiology， State Key Disciplines： Physiology， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）
[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of combined transplantation of neural stem cells （NSCs） and olfactory ensheathing cells （OECs） on motor and non-motor behaviors in rats with Parkinson’s disease （PD）.
MethodsNSCs were collec-ted from the mid-brain tissue of fetal rats aged 11-12 d and were then cultured and identified. OECs were collected from the olfactory bulbs of neonatal rats aged 1-3 d and were then cultured and identified. A rat model of PD was established by injection of 6-OHDA into the medial forebrain bundle and the substantia nigra. The rats were randomly divided into Sham group （6-OHDA was replaced by normal saline）， PD control group， NSCs transplantation group， OECs transplantation group， and NSCs-OECs combined with transplantation group. At one week after transplantation， the apomorphine-induced rotation test and the open field test were performed for each group.
ResultsCompared with the PD control group， the NSCs-OECs combined with transplantation group had a significantly lower rotational speed in the rotation test （F=23.48，q=3.90，P<0.05）， a significantly longer movement distance in the open field test （F=4.59，q=4.16，P<0.05）， and a significantly lower ratio of the activity time in the central area to the activity time in the surrounding area （F=3.72，q=4.65，P<0.05）. There were no significant differences in the above indices between the NSCs transplantation group/OECs transplantation group and the PD control group （P>0.05）. ConclusionCombined transplantation of NSCs derived from the embryonic mid-brain tissue and OECs can improve the motor and non-motor beha-viors of PD rats.
[KEY WORDS]Parkinson disease; neural stem cells; olfactory ensheathing cells; cell transplantation; rats
帕金森病（PD）现已成为仅次于阿尔兹海默病的第二大神经退行性疾病[1]。近年来，我国PD病人数量随着人口老龄化的加剧而急剧上升，但目前该病仍无有效治疗方法。近30年來，干细胞研究所取得的成就为PD治疗带来了新的希望[2]。PD主要的病理学特征是中脑黑质多巴胺能神经元（DNs）的渐进性丢失，导致纹状体内多巴胺（DA）消耗殆尽[3]。理论上，通过向受损区域补充DNs就有可能恢复或重建原有的功能。近年来，研究人员在使用神经干细胞（NSCs）移植治疗PD方面进行了大量
的研究[4]。最近的研究结果表明，人胚胎干细胞来源的NSCs移植到PD大鼠的纹状体后能够分化成具有功能的DNs[5]，而人孤雌干细胞来源的NSCs移植治疗PD病人也具有良好的组织相容性和低致瘤性[6]。但受损的黑质和纹状体系统缺乏DNs存活和发育所需的微环境，如神经营养因子（NTFs）匮乏[7]，DNs变性死亡导致小胶质细胞大量活化并产生大量炎症因子，导致NSCs存活率低，且不利于NSCs向DNs方向分化[8-9]。因此，优化NSCs移植条件，为NSCs提供良好的局部微环境，具有非常重要的意义。嗅鞘细胞（OECs）是一种介于施旺细胞与星形胶质细胞之间的特殊类型的胶质细胞[10]，可分泌多种促进神经元发育和存活的NTFs，还可分泌多种细胞外基质蛋白[11]。有研究证实，OECs与胚胎中脑组织联合移植8周后能明显改善6-羟多巴胺（6-OHDA）诱导的PD大鼠的运动功能[12]。然而，短时间内NSCs与OECs联合移植是否对PD大鼠的运动及非运动行为产生影响鲜有报道，本研究对此进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 实验动物
SPF级成年雄性Wistar大鼠70只，体质量为（250±10）g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。孕鼠和出生1～3 d乳鼠由青岛大任富城公司提供。将成年雄性大鼠随机分为Sham组（A组）、PD对照组（B组）、NSCs移植组（C组）、OECs移植组（D组）和NSCs与OECs联合移植组（简称联合移植组，E组）。
1.2 药物和试剂
盐酸阿扑吗啡（APO）、6-OHDA（Sigma公司），DMEM/F12培养液、DMEM高糖培养液（Hyclone公司），青链霉素混合液（Solarbio公司），表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）、胎牛血清和B-27supplement（Gibco公司），小鼠源Nestin单克隆抗体（Millipore公司），即用型山羊血清（武汉博士德生物工程有限公司），兔源P75NTR单克隆抗体（Abcam公司），兔抗鼠IgG荧光二抗（Invitrogen公司），驴抗兔IgG荧光二抗（Life technologies公司），4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）细胞核染色液（碧云天公司）。
1.3 NSCs的培养与鉴定
取孕11～12 d大鼠胚胎中脑组织，剔除表面的脑膜，吹打均匀，用200目筛网过滤离心后进行无菌培养，用含体积分数0.02 B-27supplement、10 g/L青链霉素混合液、20 μg/L EGF、10 μg/L bFGF的DMEM/F12培养液进行培养。NSCs培养5～7 d时进行传代，传至第3代时用于鉴定和移植。NSCs经40 g/L多聚甲醛固定10 min，即用型山羊血清封闭，加入小鼠源Nestin单克隆抗体（1∶200），4 ℃孵育过夜;洗脱后加兔抗小鼠IgG荧光二抗（1∶500）室温下孵育2 h，加入DAPI室温下染色细胞核5 min后洗脱并封片拍照。
1.4 OECs的培养与鉴定
取出生1～3 d乳鼠嗅球，剔除表面的脑膜，吹打均匀，加入2.5 g/L胰酶37 ℃消化10～15 min，用200目筛网过滤离心后进行无菌培养，再用含体积分数0.10胎牛血清、10 g/L 青链霉素混合液的DMEM高糖培养液进行培养。采用Nash差速贴壁法[13]纯化OECs。OECs培养4～5 d时进行换液。将OECs接种于多聚赖氨酸包被的玻片上，4～5 d进行全量换液。培养10 d左右的OECs用兔源P75NTR单克隆抗体（1∶50）行免疫鉴定（同NSCs）。
1.5 PD大鼠模型的制备
在右侧内侧前脑束和黑质两点注射6-OHDA制备PD大鼠模型。参照以往的文献[14]，采用大鼠脑立体定位图谱进行定位，并注射3.6 g/L的6-OHDA。注射药液体积和坐标如下：A点3 μL（前囟后-4.4 mm，旁开-1.2 mm，深度-7.8 mm）;B点2.5 μL（前囟后-4.0 mm，旁开-0.8 mm，深度-8.0 mm）[15]。Sham组则以等体积的生理盐水代替。在6-OHDA造模手术后28 d，对大鼠进行APO（0.1 mg/kg）颈部皮下注射，连续检测30 min大鼠由损毁侧向健康侧旋转总圈数[16]，并计算旋转速度，若旋转速度>7 r/min，则证明PD模型构建成功。
1.6 细胞移植
在6-OHDA造模手术后28 d，选择PD模型大鼠进行细胞移植，移植坐标为前囟后+0.5 mm、旁开-2.0 mm、深度-5.0 mm。细胞移植各组在上述坐标注入新鲜制备的细胞密度为2.5×1011/L的细胞悬液2 μL。PD对照组用2 μL的DMEM高糖培养液替代细胞悬液。联合移植组NSCs与OECs的细胞数之比为1∶1。 1.7 旋转实验
细胞移植术后7 d，对大鼠进行APO（0.1 mg/kg）颈部皮下注射，连续检测30 min大鼠由损毁侧向健康侧旋转总圈数，并计算旋转速度。
1.8 旷场实验
细胞移植术后7 d，将待测大鼠轻轻放置在旷场中心区域，通过视频捕获分析系统自动记录大鼠自主活动10 min。采用Ethvision XT软件自动获取每只大鼠在旷场中的运动距离及在中心区域活动时间（Pt）和周围区域活动时间（Ct）[17]。以大鼠在旷场中的运动距离反映其运动行为能力;以Pt/Ct反映大鼠的焦虑程度，比值越高说明焦虑程度越高，反之则越低[18]。
1.9 统计学分析
应用SPSS和GraphPad Prism軟件进行统计学分析，计量资料结果以[AKx-D]±s形式表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA检验），以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 NSCs与OECs的鉴定
培养至第3代的NSCs的免疫荧光染色显示，细胞球内的NSCs呈Nestin阳性，说明培养后细胞球能保持NSCs的增殖特性。OECs的免疫荧光染色显示，生物标记物P75NTR呈阳性，说明贴壁的绝大多数细胞为OECs。
2.2 行为学实验
旋转实验结果显示，与Sham组相比，其余4组大鼠的旋转速度均明显增加（F=23.48，q=6.81～12.81，P<0.01）;与PD组相比，联合移植组的旋转速度明显降低（q=3.90，P<0.05）。见表1。
旷场实验结果显示，与Sham组相比，PD对照组和OECs移植组的旷场运动距离较短（F=4.59，q=5.03、4.20，P<0.05）;与PD对照组相比，NSCs移植组和OECs移植组的旷场运动距离虽有升高，但差异无统计学意义（P>0.05），而联合移植组的旷场运动距离明显增加（q=4.16，P<0.05）;联合移植组的旷场运动距离与两个单独移植组相比较差异无统计学意义（P>0.05）。PD对照组的Pt/Ct较Sham组明显增高（F=3.72，q=4.75，P<0.05），OECs移植组和联合移植组的Pt/Ct较PD对照组明显降低（q=4.73、4.65，P<0.05）。见表1。
3 讨 论
当改善病人的运动功能，这拉开了细胞替代治疗PD的序幕。但目前也有研究显示，NSCs移植治疗PD还存在很多问题，如细胞存活率低[20]，这与移植宿主的局部微环境息息相关[21]，而受损的黑质纹状体系统显然不利于NSCs的存活、增殖与分化[22]。研究表明，OECs能分泌大量的NTFs和细胞因子，可改善局部微环境，促进NSCs向DNs方向分化，并为残存的神经元提供营养支持[23]。这为NSCs分化为更多的DNs以替代退行性病变丢失的神经元和恢复神经功能奠定了基础。
JOHANSSON等[12]将胚胎VM与OECs联合移植入PD大鼠，2、3、7、8周后，与对照组相比，单独VM或OECs移植组与二者联合移植组的运动功能均有明显改善，但与单独OECs或VM移植组相比较，联合移植组的改善效果更好，差异有统计学意义，而两个单独移植组间比较差异无统计学意义。本研究结果显示，NSCs与OECs联合移植1周后，PD大鼠的运动功能明显改善，与PD对照组相比差异有统计学意义;联合移植组与单独移植组相比以及单独移植组与PD对照组相比较虽有改善，但差异却无统计学意义。推测联合移植组之所以能够改善PD大鼠的运动功能，可能是由于OECs分泌的NTFs和各种细胞因子改善了NSCs所处的局部微环境，提高了移植后NSCs存活率和分化成DNs的能力;而单独移植后的NSCs存活率较低，NSCs分化成DNs的数量较少，且OECs分泌各种营养因子来发挥神经保护作用与促进神经元的成熟均需要时间，致使NSCs与OECs单独移植1周不能显著改善PD大鼠的运动功能。另有研究表明，单独OECs移植24周后PD大鼠的运动功能没有改善，这也许是由于随着时间的延长，OECs的神经保护作用逐渐丧失;但OECs与NSCs联合移植确实比NSCs单独移植更能改善PD大鼠的运动功能，且差异有统计学意义[24]，这可能是由于OECs保护更多的NSCs存活下来，并促进其分化成具有功能的DNs，
故而产生更好且稳定地促进PD大鼠运动功能改善的作用。由此可见，OECs体内移植时，其神经保护功能在初期发挥巨大作用，但保持稳定而持久的改善作用还需NSCs分化的DNs替代退行性病变丢失的神经元，故OECs与NSCs联合移植治疗PD是一种具有很大开发潜力的方法。
既往研究多关注NSCs移植促进PD模型动物运动功能的改善，而鲜少关注对非运动症状的影响。本研究结果表明，OECs与NSCs联合移植1周后，PD大鼠的非运动症状明显改善，即二者联合移植可以缓解PD大鼠的焦虑症状;单独移植OECs也可显著降低PD大鼠的焦虑程度。推测OECs移植组或联合移植组之所以能够在短时间内改善PD大鼠的焦虑程度，可能均得益于OECs的神经保护作用，故单独移植NSCs组没有明显的改善效果。
冯蕾等[25]的研究结果表明，将OECs条件培养基用于培养6-OHDA损伤的PC12细胞，可显著提高PC12细胞BCL2/Bax的表达比率，从而降低6-OHDA对PC12的损伤。体内研究显示，OECs与NSCs联合移植治疗创伤性脑外伤模型大鼠时可抑制炎症因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达，从而促进TBI大鼠神经功能的恢复[26]。然而目前OECs与NSCs联合移植促进PD动物模型运动功能改善的作用机制还不清楚，需进一步探究。 綜上所述，NSCs和OECs两种细胞联合移植能够在短期内改善PD大鼠的运动功能与焦虑症状，为细胞治疗PD提供了新的实验支持，但相关机制还不清楚，仍需进一步研究。
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