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摘要：利用RT-PCR方法，检测不同直径绵羊卵泡卵丘细胞中FSHR、EGFR、GHR、bFGF、[WTBX][STBX]CYP19A[WTB][STB]、AMH基因的mRNA表达规律及卵母细胞孤雌激活后胚胎发育的影响，结果表明，大、中、小卵泡卵丘细胞中都有FSHR、EGFR、GHR、bFGF、CYP19A、AMH的mRNA表达，不同直径卵泡卵丘细胞呈现递增趋势，大卵泡卵丘细胞与中小卵泡的卵丘细胞相对表达量差异显著（P<005；AMH在直径>50 mm的卵泡卵丘细胞中有所下降。不同大小卵泡卵母细胞经体外培养，结果表明，各卵泡卵母细胞直径组间成熟率不显著，随卵泡直径的增大卵裂率增加，10～20 mm组与21～50 mm组卵裂率都显著低于>5 mm组 （P<005，相互间无差异（P>005；囊胚率也呈现逐渐增加的趋势，卵泡大于50 mm卵母细胞组极显著高于10～20 mm组（P<001，21～50 mm组（P<005。证实卵丘细胞在绵羊卵母细胞成熟和受精及随后的胚胎发育过程中起重要作用，卵泡直径对卵母细胞发育能力产生影响。
关键词：绵羊；卵丘细胞；卵母细胞；RT-PCR
中图分类号： S8263文献标志码： A
文章编号：1002-1302（201412-0236-04
准确判断卵母细胞的发育能力是提高各类辅助生殖成功的必要条件，从形态学上观察卵母细胞的厚度及卵丘细胞包裹的紧密程度是评估卵母细胞质量的常用手段[1-2]，这种标准并不能真正预测胚胎的健康，需要从分子角度鉴定预测卵母细胞的功能。卵丘细胞是指在卵母细胞外周并与之进行代谢联系的颗粒细胞群，对于卵母细胞成熟有极其重要的作用，主要表现在卵丘细胞参与维持卵母细胞减数分裂阻滞、诱导卵母细胞减数分裂恢复并支持卵母细胞细胞质的成熟。卵丘细胞形态和卵丘细胞扩展影响卵母细胞成熟的同时，卵母细胞对卵丘细胞的分化及发育也起着中心调节作用。Li等研究证明卵母细胞对卵丘细胞表型和生存有重要的调节作用，对卵丘细胞增殖、扩散、分化及细胞死亡、类固醇激素分泌有显著影响[4-5]。最近，Ledda等提出，卵泡液和卵丘细胞可贮存及释放某些生长因子和某些特定蛋白质，在卵母细胞成熟及胚胎发育过程中按一定顺序表达，或通过选择性地扩散来调节胚胎生长发育[6]。鉴于卵丘细胞与卵母细胞双边通信的作用，可以推断卵母细胞的发育能力变化很可能影响卵丘细胞的表型或者基因的表达，从而通过调节这些基因的表达来提高卵母细胞的发育能力。
本研究通过RT-PCR方法，检测绵羊不同直径卵泡卵丘细胞FSHR、EGFR、GHR、bFGF、[WTBX][STBX]CYP19A[WTB][STB]、AMH基因的mRNA表达差异，以推断这些基因对卵母细胞发育能力的影响，对预测卵母细胞体外发育能力有着重要的意义。RT-PCR方法克服了通过表观参数而选择卵母细胞的不可靠性，是一个非侵入性辨别卵母细胞质量的新方法。
1材料与方法
11材料
111药品及试剂RNeasy Micro RNA提取试剂盒、QIAEX II 琼脂糖凝胶回收试剂盒，均购于QIAGEN；反转录试剂盒RNA LA-PCR（AMV、荧光实时定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex Taq、Taq DNA聚合酶、pMD19-T载体，均购于大连宝生物公司；培养用胎牛血清 （FBS、非必需氨基酸（NEAA，均购自Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA，购自Bovogen公司。
112绵羊卵泡采集绵羊卵巢来源于新疆维吾尔自治区乌鲁木齐当地屠宰场。将采集的卵巢放入37 ℃、含有09%生理盐水的保温瓶中，2 h内运回实验室；用生理盐水将成年绵羊卵巢洗涤3～4次，置于烧杯内，用注射器抽吸直径为10～20 mm、21～50 mm和>50 mm的卵泡，收集于盛有抽卵液的90 mm培养皿中。
12方法
121卵母细胞的体外成熟培养将成年绵羊GV期卵丘卵母细胞复合体（COCs按不同直径移入预先平衡好的成熟液中，在386 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下进行成熟培养，以卵母细胞周围卵丘细胞扩展程度并排出第一极体作为卵母细胞成熟的标准。
122卵丘细胞的分离在体视镜下，选取形态完好的COCs放入01%透明质酸酶中，用玻璃管在成熟培养液中反复吹打机械分离卵丘细胞；将含有卵丘细胞的成熟培养液，收集在装有15 mL PBS的离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重复1次；将卵丘细胞转入裂解液中，储存在-80 ℃冰箱中，待RT-PCR检测分析。
123卵母细胞孤雌激活挑选有极体且细胞质均匀的卵母细胞，在含5 μmol/L离子霉素（ionomycin的激活液中激活4 min；经2 mmol/L 6-DMAP培养液洗2次，移入含 6-DMAP 的培养液内培养2 h；培养液洗涤3次，移入含有600～700 μL体外培养液的四孔培养板中，CO2箱培养48 h，统计卵裂率，统计6～8 d囊胚率。CO2箱培养条件为 386 ℃、5% CO2、5% O2、90%N2及饱和湿度。
124RNA提取与cDNA逆转录合成根据QIAGEN RNeasy Micro it操作步骤提取总RNA，溶解于14 μL RNase-free水，按照大连宝生生物公司（TaaRa反转录试剂盒进行反转录：RNA 1 μL，随机引物（表11 μL，加RNAse-free水至 15 μL；置于PCR仪中75 ℃ 10 min，4 ℃ 暂停取出；立即冰浴2 min，加入Inhibitor 05 μL、5×M-MLV buffer 2 μL、dNTP mixture（each 25 mmol/L 75 μL、M-MLV酶 1 μL，42 ℃ 1 h、70 ℃ 10 min，-20 ℃保存备用。
关键词：绵羊；卵丘细胞；卵母细胞；RT-PCR
中图分类号： S8263文献标志码： A
文章编号：1002-1302（201412-0236-04
准确判断卵母细胞的发育能力是提高各类辅助生殖成功的必要条件，从形态学上观察卵母细胞的厚度及卵丘细胞包裹的紧密程度是评估卵母细胞质量的常用手段[1-2]，这种标准并不能真正预测胚胎的健康，需要从分子角度鉴定预测卵母细胞的功能。卵丘细胞是指在卵母细胞外周并与之进行代谢联系的颗粒细胞群，对于卵母细胞成熟有极其重要的作用，主要表现在卵丘细胞参与维持卵母细胞减数分裂阻滞、诱导卵母细胞减数分裂恢复并支持卵母细胞细胞质的成熟。卵丘细胞形态和卵丘细胞扩展影响卵母细胞成熟的同时，卵母细胞对卵丘细胞的分化及发育也起着中心调节作用。Li等研究证明卵母细胞对卵丘细胞表型和生存有重要的调节作用，对卵丘细胞增殖、扩散、分化及细胞死亡、类固醇激素分泌有显著影响[4-5]。最近，Ledda等提出，卵泡液和卵丘细胞可贮存及释放某些生长因子和某些特定蛋白质，在卵母细胞成熟及胚胎发育过程中按一定顺序表达，或通过选择性地扩散来调节胚胎生长发育[6]。鉴于卵丘细胞与卵母细胞双边通信的作用，可以推断卵母细胞的发育能力变化很可能影响卵丘细胞的表型或者基因的表达，从而通过调节这些基因的表达来提高卵母细胞的发育能力。
本研究通过RT-PCR方法，检测绵羊不同直径卵泡卵丘细胞FSHR、EGFR、GHR、bFGF、[WTBX][STBX]CYP19A[WTB][STB]、AMH基因的mRNA表达差异，以推断这些基因对卵母细胞发育能力的影响，对预测卵母细胞体外发育能力有着重要的意义。RT-PCR方法克服了通过表观参数而选择卵母细胞的不可靠性，是一个非侵入性辨别卵母细胞质量的新方法。
1材料与方法
11材料
111药品及试剂RNeasy Micro RNA提取试剂盒、QIAEX II 琼脂糖凝胶回收试剂盒，均购于QIAGEN；反转录试剂盒RNA LA-PCR（AMV、荧光实时定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex Taq、Taq DNA聚合酶、pMD19-T载体，均购于大连宝生物公司；培养用胎牛血清 （FBS、非必需氨基酸（NEAA，均购自Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA，购自Bovogen公司。
112绵羊卵泡采集绵羊卵巢来源于新疆维吾尔自治区乌鲁木齐当地屠宰场。将采集的卵巢放入37 ℃、含有09%生理盐水的保温瓶中，2 h内运回实验室；用生理盐水将成年绵羊卵巢洗涤3～4次，置于烧杯内，用注射器抽吸直径为10～20 mm、21～50 mm和>50 mm的卵泡，收集于盛有抽卵液的90 mm培养皿中。
12方法
121卵母细胞的体外成熟培养将成年绵羊GV期卵丘卵母细胞复合体（COCs按不同直径移入预先平衡好的成熟液中，在386 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下进行成熟培养，以卵母细胞周围卵丘细胞扩展程度并排出第一极体作为卵母细胞成熟的标准。
122卵丘细胞的分离在体视镜下，选取形态完好的COCs放入01%透明质酸酶中，用玻璃管在成熟培养液中反复吹打机械分离卵丘细胞；将含有卵丘细胞的成熟培养液，收集在装有15 mL PBS的离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重复1次；将卵丘细胞转入裂解液中，储存在-80 ℃冰箱中，待RT-PCR检测分析。
123卵母细胞孤雌激活挑选有极体且细胞质均匀的卵母细胞，在含5 μmol/L离子霉素（ionomycin的激活液中激活4 min；经2 mmol/L 6-DMAP培养液洗2次，移入含 6-DMAP 的培养液内培养2 h；培养液洗涤3次，移入含有600～700 μL体外培养液的四孔培养板中，CO2箱培养48 h，统计卵裂率，统计6～8 d囊胚率。CO2箱培养条件为 386 ℃、5% CO2、5% O2、90%N2及饱和湿度。
124RNA提取与cDNA逆转录合成根据QIAGEN RNeasy Micro it操作步骤提取总RNA，溶解于14 μL RNase-free水，按照大连宝生生物公司（TaaRa反转录试剂盒进行反转录：RNA 1 μL，随机引物（表11 μL，加RNAse-free水至 15 μL；置于PCR仪中75 ℃ 10 min，4 ℃ 暂停取出；立即冰浴2 min，加入Inhibitor 05 μL、5×M-MLV buffer 2 μL、dNTP mixture（each 25 mmol/L 75 μL、M-MLV酶 1 μL，42 ℃ 1 h、70 ℃ 10 min，-20 ℃保存备用。