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【摘要】 目的：研究改良小口径人工血管的血液相容性。方法：将丝素蛋白膜涂覆于聚四氟乙烯小口径人工血管内侧壁，采用等离子体技术对涂覆后的小口径人工血管磺酸化，制成改良小口径人工血管；改良小口径人工血管的溶血相关安全性以体外溶血实验检测，同时行动态凝血、复钙实验评价复合血管血液相容性。结果：溶血试验提示复合血管的溶血率为4.5%，符合材料溶血要求；动态凝血中根据各时间点吸光度平均值可见复合血管组吸光度整体位于普通血管之上，且下降趋势较缓，经历时间较长，与普通血管相比，其抗凝血性能较好；复钙实验中复合血管组平均时间为（450.00±32.18）s，小于对照组平均时间（610.06±37.65）s，两样本t检验提示P=0.000，提示两者差异有统计学意义。结论：改良小口径人工血管具有良好的血液相容性。
【关键词】 人工血管； 血液相容性； 凝血实验； 复钙实验
The Study of the Modified Small-caliber Artificial Blood Vessel/LI Hui，CHEN Qun-qing，LI Shao-bin，et al.//Medical Innovation of China，2013，10（15）：010-012
【Abstract】 Objective：To research the hemocompatibility of the modified small-caliber artificial blood vessel （the combined blood vessel）.Method：To produce a combined blood vessel with a small-caliber expanded polytetrafluoroethylene vessel coated by silk fibroin film，which sulfonated by low temperature plasma treatment，to evaluated the hemocompatibility and safety of the combined blood vessel including dynamic cruor time test，recalcification time，and the hemolysis test.Result：Hemolytic test indicated that the vascular hemolysis was 4.5%，in line with the requirements of materials hemolytic.The average value of absorbance-clotting time of the combined blood vessel was higher than that of the control blood vessel，and declined more slowly.The recalcification time of the combined blood vessel was significantly longer than that of control blood vessel（610.06±37.65 vs 450.00±32.18 seconds，P<0.01）.Conclusion：Form this experiment，we demonstrate the combined blood vessel has a good hemocompatibility.
【Key words】 Artificial blood vessel； Hemocompatibility； Hemolytic test； Recalcification test
First-author’s address：Zhujiang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510282，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2013.15.004
随着人们生活水平的不断提高，冠心病及其他部位的血管阻塞性病变已成为威胁我国公众健康的重要疾病，冠脉搭桥手术、心外动静脉血管架桥手术数量每年不断增加，小口径桥血管材料需求量越来越大。自体血管因为种种限制不能广泛大范围使用，因此开发出适合血管旁路或置换手术用的小口径人工血管，以替代自体血管就具有十分重要的临床意义。为解决上述问题，采用低温等离子体技术成功制备出复合小口径人工血管，但复合血管的血液相容性有待验证。本实验旨在通过研究改良复合小口径人工血管的血液相容性特性。为满足临床在小口径（直径<6 mm）要求做出更进一步的努力。
1 材料与方法
1.1 材料、仪器与试剂 恒温水浴箱、CO2培养箱（Thermo Fisher Scientific）；酶标仪（Model6800，BIORAD）；离心机（centrifuge 5810R，Eppendorf）；微量加样器200 μl、1000 μl（Eppendorf）；枸橼酸钠及氯化钙（分析纯，广东光华化学厂有限公司）；蒸馏水、生理盐水、PBS缓冲液（南方医科大学珠江医院药剂科）。
1.2 复合血管的制备 采用文献[1]方法制备小口径人工血管，即将丝素蛋白膜涂覆于聚四氟乙烯小口径人工血管内侧壁，采用等离子体技术对涂覆后的小口径人工血管磺酸化，制成改良小口径人工血管。
1.3 小口径人工血管血液相容性研究 根据相关文献中的方法，设实验组和对照组分别进行溶血试验、动态凝血时间、复钙时间评价血液相容性[2-3]。
1.3.1 溶血实验 分复合血管组，阳性、阴性对照组，均设6个试样。复合血管组，浸泡在10 ml生理盐水的试管中；阳性对照组：每个试管加入10 ml去离子水备用；阴性对照组：于每个试管中加入10 ml生理盐水备用。将所有将检测试管放在恒温水浴箱水浴30 min。取新鲜人血9 ml， 1 ml 3.8%枸橼酸钠抗凝，加入0.9% NaCl溶液12.5 ml，制备出新鲜抗凝血。每个试管加入0.2 ml稀释血液，检测试管放在恒温水浴箱水浴60 min后，置离心机中以2500 r/min离心6 min，留取上清液，用紫外可见光光度计测定其吸光度（A）值。取每组6支试管的均值作为该组的A值。阴性对照组不应大于0.03、阳性对照组A应为0.8±0.3，溶血率以百分比表示：D（%）=（试验样品的吸光度-阴性对照吸光度）/（阳性对照吸光度-阴性对照吸光度）×100%。溶血率评判的标准为溶血率小于5%[4]。
1.3.2 动态凝血时间实验 设实验组与对照组，将血管剪成0.5 cm×0.5 cm的小条，取6个小条置于6个小烧杯底部的中心，在37 ℃水浴恒温5 min后，向烧杯中注入0.25 ml新鲜抗凝人血，恒温5 min后，向血液中注入0.02 ml CaCl2溶液（0.2 mol/L），开始记时，同时摇晃小烧杯1 min，使CaCl2与血混合均匀，盖好烧杯分别恒温10、20、30、50、70、90 min。取出烧杯，向烧杯中加入50 ml蒸馏水，摇晃烧杯10 min，离心取上清液，测量其在540 nm处的吸光度。6组数据取平均值。
1.3.3 复钙实验 抽取新鲜人血与3.8%枸橼酸钠溶液，以质量比9：1配液和备用，全血3 ml，5000 r/min离心，15 min，取上清液血浆备用。设实验组及对照组，将实验组血管及对照组血管剪成0.5 cm×0.5 cm的小条各6个，放入0.9% NaCl溶液中浸泡24 h，在37 ℃恒温水浴中，将小条移至试管底部，加入0.2 ml上清液血浆，再加入0.2 ml 0.025 mol/L CaCl2溶液，开始计时，轻摇试管使CaCl2溶液与上清液混合均匀。当试管中出现白色纤状沉淀时，时间即为复钙时间。数据取平均值[5]。
1.4 统计学处理 使用SPSS 13.0统计软件分析，计量资料以（x±s）表示，行两样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 溶血试验 阴性对照组平均吸光度0.0297±0.0084，小于0.03，阳性平均吸光度0.5358±0.1229，实验组血管吸光度为（0.0527±0.0062），溶血率为4.5%，小于5%，符合溶血要求[4]。
2.2 动态凝血实验 小口径人工血管组与普通血管组每个时间点都测得吸光度6个，所得数据使用SPSS 13.0统计软件行不同组别及不同时间的析因分析的统计分析，得表1，不同组别之间有显著差异（F组别=249.567，P<0.01），即改良小口径人工血管组与普通血管组有显著差异，结合相关均数，改良小口径人工血管组平均吸光度要高于普通血管组；不同时间点有显著差异（F=86.940，P<0.01）。根据各时间点吸光度平均值可见改良小口径人工血管组吸光度整体位于普通血管之上，且下降趋势较缓，经历时间较长，与普通血管相比，其抗凝血性能较好。交互效应表示不同处理随时间不同，吸光度不同，差异显著（F=3.470，P=0.047）。
2.3 复钙实验 本实验中实验组及对照组时间取平均值，予以两样本t检验，结果提示改良小口径人工血管（实验组）复钙时间为（450.00±32.18）s，对照组为（610.06±37.65）s，方差齐性检验提示方差齐（F=0.212，P=0.634），两样本t检验提示两结果有显著的统计学差异（t=-6.239，P=0.000）。
3 讨论
血液相容性研究是检测人工血管应用安全性的最重要指标之一，对研制的人工血管进行血液相容性研究具有重要意义。按照试验的要求，本实验中阳性、阴性对照组平均吸光度符合阳、阴性对照吸光度的要求，所检测的实验血管的溶血率有实际意义。测得改良小口径人工血管的溶血率<5%，符合医用材料的溶血率试验要求。影响溶血试验结果的因素很多，其中已有报道认为实验品的材料特性、样品形状、表面处理程度都与溶血率相关[6]。本实验中改良小口径人工血管的溶血率为4.5%，虽然符合医用材料的溶血率要求，但仍然较高，分析原因，可能与SO2等离子体处理、丝素膜的均匀程度等有关，在以后的研究中，对复合血管将作进一步处理，降低溶血率。动态凝血实验是通过检测内源性凝血因子被激活程度的高低来检测人工血管抗凝血特性的优略，本实验中，根据各时间点吸光度的平均值变化可以看出，改良小口径人工血管的吸光度平均值整体位于普通血管之上，且下降趋势缓慢，经历时间较长，与普通血管相比，其内源性凝血因子被激活的程度低，材料的抗凝血性能优良。除去Ca2+的血浆将失去凝血功能，复钙时间测定的意义在于：在已除去Ca2+的血浆中重新加入Ca2+，重新启动凝血过程，测定凝血启动后血液出现凝固的时间，其可以检测血管的抗凝血特性[7]。本实验中，改良小口径人工血管的复钙时间远远低于对照组的复钙时间，提示改良小口径人工血管抗凝血性能远远好于对照血管。这与其他研究者得出的数据类似。因此，通过溶血试验、动态凝血实验以及复钙实验验证了本实验制备出的改良小口径人工血管具有良好的血液相容性。
参考文献
[1] Chung Y M，Jung M W，Han J G.Surface modification effects on film growth with atmospheric Ar/Ar+O2 plasma[J].Surface and coatings Technology，2003，175（1）：1038-1042.
[2] Altman G H，Diaz F，Jakuba C，et al.Silk-based biomaterials[J].Biomaterials，2003，24（3）：401-416.
[3] Meinel L，Hofmann S，Karageorgiou V，et al.The inflammatory responses to silk films in vitro and in vivo[J].Biomaterials，2005，26（2）：147-155. [4] Borsani E，Salgarello S，Mensi M，et al.Histochemical and immunohistochemical evaluation of gingival collagen and metal1oproteinases in peri-implantitis[J].Acta Histochem，2OO5，1O7（3）：231-240.
[5] 霍丹群，詹东妮，侯长军，等.生物材料的生物相容性综合评价研究[J].生物医学工程学杂志，2006，23（6）：1350-1354.
[6] 中华人民共和国国家标准-医疗器械生物学评价（GB/T 16886.4-2003）[S].北京：中国标准出版社，2003.
[7] Andreas F，Von Recum.Handbook of Biomaterials Evaluation[M].New York：Macmillan Publishing Company，1986：98-103.
[8] Zhou C，Yi Z.Blood-compatibility of polyurethane/liquid crystal of composite membranes[J].Biomaterials，1999，20（22）：2093-2099.
[9] 周索琼，李国明.聚氨酯/硫酸酯化壳聚糖复合膜的制备及其血液相容性的研究[J].化工时刊，2007，21（5）：257-260.
[10] Hunt J A.Techniques to investigate cellular and molecular interactions in the host response to implanted biomaterials[J].Biomaterials，1997，18（22）：1449-1459.
[11] Pan C J，Tang J J，Weng Y J，et al.Preparation and characterization of Rapamycin-1oaded PLGA coating stent[J].Mater Sci Mater Med，2007，18（11）：2193-2198.
（收稿日期：2013-02-27） （本文编辑：李静）
【关键词】 人工血管； 血液相容性； 凝血实验； 复钙实验
The Study of the Modified Small-caliber Artificial Blood Vessel/LI Hui，CHEN Qun-qing，LI Shao-bin，et al.//Medical Innovation of China，2013，10（15）：010-012
【Abstract】 Objective：To research the hemocompatibility of the modified small-caliber artificial blood vessel （the combined blood vessel）.Method：To produce a combined blood vessel with a small-caliber expanded polytetrafluoroethylene vessel coated by silk fibroin film，which sulfonated by low temperature plasma treatment，to evaluated the hemocompatibility and safety of the combined blood vessel including dynamic cruor time test，recalcification time，and the hemolysis test.Result：Hemolytic test indicated that the vascular hemolysis was 4.5%，in line with the requirements of materials hemolytic.The average value of absorbance-clotting time of the combined blood vessel was higher than that of the control blood vessel，and declined more slowly.The recalcification time of the combined blood vessel was significantly longer than that of control blood vessel（610.06±37.65 vs 450.00±32.18 seconds，P<0.01）.Conclusion：Form this experiment，we demonstrate the combined blood vessel has a good hemocompatibility.
【Key words】 Artificial blood vessel； Hemocompatibility； Hemolytic test； Recalcification test
First-author’s address：Zhujiang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510282，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2013.15.004
随着人们生活水平的不断提高，冠心病及其他部位的血管阻塞性病变已成为威胁我国公众健康的重要疾病，冠脉搭桥手术、心外动静脉血管架桥手术数量每年不断增加，小口径桥血管材料需求量越来越大。自体血管因为种种限制不能广泛大范围使用，因此开发出适合血管旁路或置换手术用的小口径人工血管，以替代自体血管就具有十分重要的临床意义。为解决上述问题，采用低温等离子体技术成功制备出复合小口径人工血管，但复合血管的血液相容性有待验证。本实验旨在通过研究改良复合小口径人工血管的血液相容性特性。为满足临床在小口径（直径<6 mm）要求做出更进一步的努力。
1 材料与方法
1.1 材料、仪器与试剂 恒温水浴箱、CO2培养箱（Thermo Fisher Scientific）；酶标仪（Model6800，BIORAD）；离心机（centrifuge 5810R，Eppendorf）；微量加样器200 μl、1000 μl（Eppendorf）；枸橼酸钠及氯化钙（分析纯，广东光华化学厂有限公司）；蒸馏水、生理盐水、PBS缓冲液（南方医科大学珠江医院药剂科）。
1.2 复合血管的制备 采用文献[1]方法制备小口径人工血管，即将丝素蛋白膜涂覆于聚四氟乙烯小口径人工血管内侧壁，采用等离子体技术对涂覆后的小口径人工血管磺酸化，制成改良小口径人工血管。
1.3 小口径人工血管血液相容性研究 根据相关文献中的方法，设实验组和对照组分别进行溶血试验、动态凝血时间、复钙时间评价血液相容性[2-3]。
1.3.1 溶血实验 分复合血管组，阳性、阴性对照组，均设6个试样。复合血管组，浸泡在10 ml生理盐水的试管中；阳性对照组：每个试管加入10 ml去离子水备用；阴性对照组：于每个试管中加入10 ml生理盐水备用。将所有将检测试管放在恒温水浴箱水浴30 min。取新鲜人血9 ml， 1 ml 3.8%枸橼酸钠抗凝，加入0.9% NaCl溶液12.5 ml，制备出新鲜抗凝血。每个试管加入0.2 ml稀释血液，检测试管放在恒温水浴箱水浴60 min后，置离心机中以2500 r/min离心6 min，留取上清液，用紫外可见光光度计测定其吸光度（A）值。取每组6支试管的均值作为该组的A值。阴性对照组不应大于0.03、阳性对照组A应为0.8±0.3，溶血率以百分比表示：D（%）=（试验样品的吸光度-阴性对照吸光度）/（阳性对照吸光度-阴性对照吸光度）×100%。溶血率评判的标准为溶血率小于5%[4]。
1.3.2 动态凝血时间实验 设实验组与对照组，将血管剪成0.5 cm×0.5 cm的小条，取6个小条置于6个小烧杯底部的中心，在37 ℃水浴恒温5 min后，向烧杯中注入0.25 ml新鲜抗凝人血，恒温5 min后，向血液中注入0.02 ml CaCl2溶液（0.2 mol/L），开始记时，同时摇晃小烧杯1 min，使CaCl2与血混合均匀，盖好烧杯分别恒温10、20、30、50、70、90 min。取出烧杯，向烧杯中加入50 ml蒸馏水，摇晃烧杯10 min，离心取上清液，测量其在540 nm处的吸光度。6组数据取平均值。
1.3.3 复钙实验 抽取新鲜人血与3.8%枸橼酸钠溶液，以质量比9：1配液和备用，全血3 ml，5000 r/min离心，15 min，取上清液血浆备用。设实验组及对照组，将实验组血管及对照组血管剪成0.5 cm×0.5 cm的小条各6个，放入0.9% NaCl溶液中浸泡24 h，在37 ℃恒温水浴中，将小条移至试管底部，加入0.2 ml上清液血浆，再加入0.2 ml 0.025 mol/L CaCl2溶液，开始计时，轻摇试管使CaCl2溶液与上清液混合均匀。当试管中出现白色纤状沉淀时，时间即为复钙时间。数据取平均值[5]。
1.4 统计学处理 使用SPSS 13.0统计软件分析，计量资料以（x±s）表示，行两样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 溶血试验 阴性对照组平均吸光度0.0297±0.0084，小于0.03，阳性平均吸光度0.5358±0.1229，实验组血管吸光度为（0.0527±0.0062），溶血率为4.5%，小于5%，符合溶血要求[4]。
2.2 动态凝血实验 小口径人工血管组与普通血管组每个时间点都测得吸光度6个，所得数据使用SPSS 13.0统计软件行不同组别及不同时间的析因分析的统计分析，得表1，不同组别之间有显著差异（F组别=249.567，P<0.01），即改良小口径人工血管组与普通血管组有显著差异，结合相关均数，改良小口径人工血管组平均吸光度要高于普通血管组；不同时间点有显著差异（F=86.940，P<0.01）。根据各时间点吸光度平均值可见改良小口径人工血管组吸光度整体位于普通血管之上，且下降趋势较缓，经历时间较长，与普通血管相比，其抗凝血性能较好。交互效应表示不同处理随时间不同，吸光度不同，差异显著（F=3.470，P=0.047）。
2.3 复钙实验 本实验中实验组及对照组时间取平均值，予以两样本t检验，结果提示改良小口径人工血管（实验组）复钙时间为（450.00±32.18）s，对照组为（610.06±37.65）s，方差齐性检验提示方差齐（F=0.212，P=0.634），两样本t检验提示两结果有显著的统计学差异（t=-6.239，P=0.000）。
3 讨论
血液相容性研究是检测人工血管应用安全性的最重要指标之一，对研制的人工血管进行血液相容性研究具有重要意义。按照试验的要求，本实验中阳性、阴性对照组平均吸光度符合阳、阴性对照吸光度的要求，所检测的实验血管的溶血率有实际意义。测得改良小口径人工血管的溶血率<5%，符合医用材料的溶血率试验要求。影响溶血试验结果的因素很多，其中已有报道认为实验品的材料特性、样品形状、表面处理程度都与溶血率相关[6]。本实验中改良小口径人工血管的溶血率为4.5%，虽然符合医用材料的溶血率要求，但仍然较高，分析原因，可能与SO2等离子体处理、丝素膜的均匀程度等有关，在以后的研究中，对复合血管将作进一步处理，降低溶血率。动态凝血实验是通过检测内源性凝血因子被激活程度的高低来检测人工血管抗凝血特性的优略，本实验中，根据各时间点吸光度的平均值变化可以看出，改良小口径人工血管的吸光度平均值整体位于普通血管之上，且下降趋势缓慢，经历时间较长，与普通血管相比，其内源性凝血因子被激活的程度低，材料的抗凝血性能优良。除去Ca2+的血浆将失去凝血功能，复钙时间测定的意义在于：在已除去Ca2+的血浆中重新加入Ca2+，重新启动凝血过程，测定凝血启动后血液出现凝固的时间，其可以检测血管的抗凝血特性[7]。本实验中，改良小口径人工血管的复钙时间远远低于对照组的复钙时间，提示改良小口径人工血管抗凝血性能远远好于对照血管。这与其他研究者得出的数据类似。因此，通过溶血试验、动态凝血实验以及复钙实验验证了本实验制备出的改良小口径人工血管具有良好的血液相容性。
参考文献
[1] Chung Y M，Jung M W，Han J G.Surface modification effects on film growth with atmospheric Ar/Ar+O2 plasma[J].Surface and coatings Technology，2003，175（1）：1038-1042.
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[3] Meinel L，Hofmann S，Karageorgiou V，et al.The inflammatory responses to silk films in vitro and in vivo[J].Biomaterials，2005，26（2）：147-155. [4] Borsani E，Salgarello S，Mensi M，et al.Histochemical and immunohistochemical evaluation of gingival collagen and metal1oproteinases in peri-implantitis[J].Acta Histochem，2OO5，1O7（3）：231-240.
[5] 霍丹群，詹东妮，侯长军，等.生物材料的生物相容性综合评价研究[J].生物医学工程学杂志，2006，23（6）：1350-1354.
[6] 中华人民共和国国家标准-医疗器械生物学评价（GB/T 16886.4-2003）[S].北京：中国标准出版社，2003.
[7] Andreas F，Von Recum.Handbook of Biomaterials Evaluation[M].New York：Macmillan Publishing Company，1986：98-103.
[8] Zhou C，Yi Z.Blood-compatibility of polyurethane/liquid crystal of composite membranes[J].Biomaterials，1999，20（22）：2093-2099.
[9] 周索琼，李国明.聚氨酯/硫酸酯化壳聚糖复合膜的制备及其血液相容性的研究[J].化工时刊，2007，21（5）：257-260.
[10] Hunt J A.Techniques to investigate cellular and molecular interactions in the host response to implanted biomaterials[J].Biomaterials，1997，18（22）：1449-1459.
[11] Pan C J，Tang J J，Weng Y J，et al.Preparation and characterization of Rapamycin-1oaded PLGA coating stent[J].Mater Sci Mater Med，2007，18（11）：2193-2198.
（收稿日期：2013-02-27） （本文编辑：李静）