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摘要 [目的]研究基于GC/MS的烤烟香型识别。[方法]通过GC/MS的方法研究浓香型烤烟与中间香型烤烟中性致香物质的差异。[结果]用GC/MS的方法共鉴定出烤烟中25种中性致香物质，用两独立样本的T测验检验出17种物质的P≤0.05，用这17种中性致香物质建立PCA模型，两类型烤烟被完全分在2个区域。通过ROC曲线验证模型的鲁棒性，曲线下面积为1.000。[结论]此方法可以用于烤烟的香型识别。
关键词 中性致香物质；烤烟；香型；GC/MS
中图分类号 TS41+1 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）09-0179-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.052
Abstract [Objective] The research aimed to study the identification of fluecured tobacco based on GC/MS.[Method] The difference of neutral aroma components between full flavor fluecured tobacco and middleflavored fluecured tobacco was studied by the gas chromatography/mass spectrometry （GC/MS）.[Result] A total of 25 neutral aroma substances in fluecured tobacco were identified by GC/MS. Two independent samples of the T test were used to test P ≤ 0.05 for 17 substances. The PCA model was established using these 17 neutral aroma substances， and the two types of fluecured tobacco were completely divided into two regions.The robustness of the model was verified by the ROC curve with a curved area of 1.000.[Conclusion]This method can be used for the scent identification of fluecured tobacco.
Key words Neutral aroma substances；Fluecured tobacco；Scent type；GC/MS
烤烟的香型鉴评，由于受主观因素的制约，往往会出现同一样品在不同地点、时间、人员的鉴评结果相去甚远的情况，因此建立一个客观的、可重复验证的、数字化的香型评价方法就显得尤为重要[1-2]。中性致香物质是烤烟中的重要化学成分，与烤烟香型密切相关，不同香型烤烟的香气质量有很大差异，中性致香物质可以作为烤烟香型鉴评的指标[3-4]。该研究通过GC/MS获取不同香型烤烟中性致香物质的含量，并用此建立PCA识别模型，以期为烤烟的香型鉴评提供更稳定的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
该试验于2012年采集了10个省份的47个烤烟样品进行分析，其来自河南、江西、湖南、山东、广东、陕西、广西、安徽、江西的27个烤烟样品代表浓香型烟叶，贵州的20个烤烟样品代表中间香型烟叶[5]。烤烟样品均为C3F，样品合格率在85%以上。有研究表明，生态条件对致香物质含量的影响大于品种，因此该研究仅考虑生态条件，而不考虑品种因素[6]。样品信息见表1。
1.2 中性致香物质的测定
该试验中性致香物质的提取及定性定量分析：在前处理采用水蒸气蒸馏-二氯甲烷溶剂萃取法。装置的一端接盛有20.0 g烤后烟叶粉末及1 500 mL水的2 000 mL平底烧瓶，使用电炉加热；装置的另一端接盛有40.0 mL二氯甲烷的100 mL烧瓶，并加入乙酸苯乙酯内标溶液1 mL，该端在水浴锅上加热，水浴温度为55 ℃。同时蒸馏萃取进行5.0 h。蒸馏萃取完成后，用10 mL蒸馏水冲洗冷凝管并入二氯甲烷溶液，将二氯甲烷水溶液转入125 mL分液漏斗中用5%的硫酸溶液5 mL洗去碱性成分，将二氯甲烷溶液浓缩至1.0 mL，供仪器分析用。
GC/MS条件：DB-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为高纯氦，流速1.0 mL/min；进样口温度250 ℃；进样方式为分流进样，分流比为30∶1；程序升温条件：初始温度50 ℃，保持5 min，再以2 ℃/min升温至80 ℃，再以3 ℃/min升温至230 ℃，保持16 min，最后以12 ℃/min升至250 ℃，保持20 min。质谱条件：电离方式为EI+；离子化电压为70 ev；离子源温度180 ℃；传输线温度260 ℃；谱图检索为WILEY、NIST谱库进行检索。
1.3 数据处理
采用SPSS 12.0对数据进行非参秩和检验，采用simca-p建立主成分分析（PCA）模型。
2 结果与分析
2.1 样本的中性致香物质分析
通过NIST色谱检索共查出25种物质，包括类胡萝卜素降解产物、棕色化反应产物、苯丙氨酸产物及新植二烯，这些物质均为烤烟的中性致香物质[7]。数据标准化以后，非参秩和检验用来检验浓香型和中间香型烤烟的差异，如表2所示，17种物质P值<0.05，这些物质可能是区分浓香型和中间香型烤烟的特征成分。除6-甲基-5-庚烯-2醇、芳樟醇之外，其余类胡萝卜素类中性致香物质均以浓香型烤烟含量较高，尤其是二氢猕猴桃内酯，是中间香型烤煙含量的4倍。而中间香型烤烟含有较高的棕色化反应产物，尤其是糠醛，是浓香型烤烟含量的2倍。 2.2 模式识别和功能分析
PCA是一种无师监督模式识别，常用于多元统计。PCA通过降维的方式实现对大量复杂对象的异同的可视化，结果通过得分图显示[8-9]。利用特征成分建立PCA模型。得分图显示（图1），浓香型烟叶和清香型烟叶被完全地分在2个区域。ROC曲线（Receiver-operator characteristic）用来检验PCA模型的鲁棒性（robustness）。ROC曲线以敏感性为纵坐标、1-特异性为横坐标绘制成曲线，曲线下面积（AUC）越大，识别准确性越高。利用交叉验证预测Y的值建立ROC曲线，AUC为1.000（图2），表明PCA模型有很好的识别能力。
大马酮、巨豆三烯酮、茄酮是在不同香型烤烟中均为含量较高的中性致香物质[10]，有研究表明，这3种中性致香物质受生态因素影响较大[11]，且在不同香型烤烟中含量差异达到显著水平[12]。该研究中不同香型烤烟这3类物质的含量均有较大差异。
质体色素是烟叶中重要的香气前体物，其降解产物对烟叶的质量和风格有很大的影响[13]，有研究者认为，浓香型烤烟类胡萝卜素降解产物含量较低[14]；也有研究表明，浓香型烤烟中含量较多的为分子量相对较大的香气物质[15]。但鉴于浓香型烤烟有较明显的颗粒感，且类胡萝卜素降解产物的相对分子量往往较大，笔者认为浓香型烤烟应该含有较高的类胡萝卜素降解产物，该研究也证明了这一点。
中间香型烤烟产区（贵州中海拔地区）的昼夜温差相对较大，还原糖含量相对较高[5]，这可能是其美拉德反应产物相对较高的原因。
3 总结
该研究通过GC/MS的方法获取不同香型烤烟烤后样的中性致香物質。17种物质被选择用来建立PCA模型，且曲线下面积达1.000，表明此模型有很好的识别能力。
值得注意的是，该模型并不能完全取代评吸评价。香型是人对烤烟燃烧产生的烟气的整体感受，中性致香物质仅是烤烟中一个重要的化学成分，并不能代表整体，但此模型在烤烟香型评鉴、产地识别方面有重要的参考意义。
参考文献
[1] 唐远驹.关于烤烟香型问题的探讨[J].中国烟草科学，2011，32（3）：1-7.
[2] 李忠，杨洪明，徐世涛，等.基于质谱的代谢组学方法在烟草化学研究中的应用研究[J].分析测试学报，2007，26（S1）：294-295，299.
[3] 廉芸芸.我国部分典型烤烟产区烟叶品质特色分析[D].北京：中国农业科学院，2008.
[4] 周冀衡，杨虹琦，林桂华，等.不同烤烟产区烟叶中主要挥发性香气物质的研究[J].湖南农业大学学报（自然科学版），2004，30（1）：20-23.
[5] 李继新，潘文杰，田野，等.贵州典型生态区烟叶质量特点分析[J].中国烟草科学，2009，30（1）：62-67.
[6] 邵丽，晋艳，杨宇虹，等.生态条件对不同烤烟品种烟叶产质量的影响[J].烟草科技，2002（10）：40-45.
[7] 周昆，周清明，胡晓兰.烤烟香气物质研究进展[J].中国烟草科学，2008，29（2）：58-61.
[8] ANTHONY M L，ROSE V S，NICHOLSON J K，et al.Classification of toxininduced changes in 1H NMR spectra of urine using an artificial neural network[J].J Pharm Biomed Anal，1995，13（3）：205-211.
[9] BECKONERT O，BOLLARD M E，EBBELS T M D，et al.NMRbased metabonomic toxicity classification：Hierarchical cluster analysis and knearstneighbour approaches[J].Anal Chim Acta，2003，490：3-15.
[10] 沈剑波.清香型与浓香型烤烟部分质量因素的比较[D].郑州：河南农业大学，2008.
[11] 王能如，李章海，王东胜，等.我国烤烟主体香味成分研究初报[J].中国烟草科学，2009，30（3）：1-6.
[12] 杜咏梅，张建平，王树声，等.主导烤烟香型风格及感官质量差异的主要化学指标分析[J].中国烟草科学，2010，31（5）：7-12.
[13] 史宏志，刘国顺，杨惠娟，等.烟草香味学[M].北京：中国农业出版社，1998.
[14] 杨虹琦，周冀衡，罗泽民，等.不同产区烤烟中质体色素及降解产物的研究[J].西南农业大学学报（自然科学版），2004，26（5）：640-644.
[15] 肖协忠.烟草化学[M].北京：中国农业科技出版社，1997.
关键词 中性致香物质；烤烟；香型；GC/MS
中图分类号 TS41+1 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）09-0179-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.052
Abstract [Objective] The research aimed to study the identification of fluecured tobacco based on GC/MS.[Method] The difference of neutral aroma components between full flavor fluecured tobacco and middleflavored fluecured tobacco was studied by the gas chromatography/mass spectrometry （GC/MS）.[Result] A total of 25 neutral aroma substances in fluecured tobacco were identified by GC/MS. Two independent samples of the T test were used to test P ≤ 0.05 for 17 substances. The PCA model was established using these 17 neutral aroma substances， and the two types of fluecured tobacco were completely divided into two regions.The robustness of the model was verified by the ROC curve with a curved area of 1.000.[Conclusion]This method can be used for the scent identification of fluecured tobacco.
Key words Neutral aroma substances；Fluecured tobacco；Scent type；GC/MS
烤烟的香型鉴评，由于受主观因素的制约，往往会出现同一样品在不同地点、时间、人员的鉴评结果相去甚远的情况，因此建立一个客观的、可重复验证的、数字化的香型评价方法就显得尤为重要[1-2]。中性致香物质是烤烟中的重要化学成分，与烤烟香型密切相关，不同香型烤烟的香气质量有很大差异，中性致香物质可以作为烤烟香型鉴评的指标[3-4]。该研究通过GC/MS获取不同香型烤烟中性致香物质的含量，并用此建立PCA识别模型，以期为烤烟的香型鉴评提供更稳定的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
该试验于2012年采集了10个省份的47个烤烟样品进行分析，其来自河南、江西、湖南、山东、广东、陕西、广西、安徽、江西的27个烤烟样品代表浓香型烟叶，贵州的20个烤烟样品代表中间香型烟叶[5]。烤烟样品均为C3F，样品合格率在85%以上。有研究表明，生态条件对致香物质含量的影响大于品种，因此该研究仅考虑生态条件，而不考虑品种因素[6]。样品信息见表1。
1.2 中性致香物质的测定
该试验中性致香物质的提取及定性定量分析：在前处理采用水蒸气蒸馏-二氯甲烷溶剂萃取法。装置的一端接盛有20.0 g烤后烟叶粉末及1 500 mL水的2 000 mL平底烧瓶，使用电炉加热；装置的另一端接盛有40.0 mL二氯甲烷的100 mL烧瓶，并加入乙酸苯乙酯内标溶液1 mL，该端在水浴锅上加热，水浴温度为55 ℃。同时蒸馏萃取进行5.0 h。蒸馏萃取完成后，用10 mL蒸馏水冲洗冷凝管并入二氯甲烷溶液，将二氯甲烷水溶液转入125 mL分液漏斗中用5%的硫酸溶液5 mL洗去碱性成分，将二氯甲烷溶液浓缩至1.0 mL，供仪器分析用。
GC/MS条件：DB-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为高纯氦，流速1.0 mL/min；进样口温度250 ℃；进样方式为分流进样，分流比为30∶1；程序升温条件：初始温度50 ℃，保持5 min，再以2 ℃/min升温至80 ℃，再以3 ℃/min升温至230 ℃，保持16 min，最后以12 ℃/min升至250 ℃，保持20 min。质谱条件：电离方式为EI+；离子化电压为70 ev；离子源温度180 ℃；传输线温度260 ℃；谱图检索为WILEY、NIST谱库进行检索。
1.3 数据处理
采用SPSS 12.0对数据进行非参秩和检验，采用simca-p建立主成分分析（PCA）模型。
2 结果与分析
2.1 样本的中性致香物质分析
通过NIST色谱检索共查出25种物质，包括类胡萝卜素降解产物、棕色化反应产物、苯丙氨酸产物及新植二烯，这些物质均为烤烟的中性致香物质[7]。数据标准化以后，非参秩和检验用来检验浓香型和中间香型烤烟的差异，如表2所示，17种物质P值<0.05，这些物质可能是区分浓香型和中间香型烤烟的特征成分。除6-甲基-5-庚烯-2醇、芳樟醇之外，其余类胡萝卜素类中性致香物质均以浓香型烤烟含量较高，尤其是二氢猕猴桃内酯，是中间香型烤煙含量的4倍。而中间香型烤烟含有较高的棕色化反应产物，尤其是糠醛，是浓香型烤烟含量的2倍。 2.2 模式识别和功能分析
PCA是一种无师监督模式识别，常用于多元统计。PCA通过降维的方式实现对大量复杂对象的异同的可视化，结果通过得分图显示[8-9]。利用特征成分建立PCA模型。得分图显示（图1），浓香型烟叶和清香型烟叶被完全地分在2个区域。ROC曲线（Receiver-operator characteristic）用来检验PCA模型的鲁棒性（robustness）。ROC曲线以敏感性为纵坐标、1-特异性为横坐标绘制成曲线，曲线下面积（AUC）越大，识别准确性越高。利用交叉验证预测Y的值建立ROC曲线，AUC为1.000（图2），表明PCA模型有很好的识别能力。
大马酮、巨豆三烯酮、茄酮是在不同香型烤烟中均为含量较高的中性致香物质[10]，有研究表明，这3种中性致香物质受生态因素影响较大[11]，且在不同香型烤烟中含量差异达到显著水平[12]。该研究中不同香型烤烟这3类物质的含量均有较大差异。
质体色素是烟叶中重要的香气前体物，其降解产物对烟叶的质量和风格有很大的影响[13]，有研究者认为，浓香型烤烟类胡萝卜素降解产物含量较低[14]；也有研究表明，浓香型烤烟中含量较多的为分子量相对较大的香气物质[15]。但鉴于浓香型烤烟有较明显的颗粒感，且类胡萝卜素降解产物的相对分子量往往较大，笔者认为浓香型烤烟应该含有较高的类胡萝卜素降解产物，该研究也证明了这一点。
中间香型烤烟产区（贵州中海拔地区）的昼夜温差相对较大，还原糖含量相对较高[5]，这可能是其美拉德反应产物相对较高的原因。
3 总结
该研究通过GC/MS的方法获取不同香型烤烟烤后样的中性致香物質。17种物质被选择用来建立PCA模型，且曲线下面积达1.000，表明此模型有很好的识别能力。
值得注意的是，该模型并不能完全取代评吸评价。香型是人对烤烟燃烧产生的烟气的整体感受，中性致香物质仅是烤烟中一个重要的化学成分，并不能代表整体，但此模型在烤烟香型评鉴、产地识别方面有重要的参考意义。
参考文献
[1] 唐远驹.关于烤烟香型问题的探讨[J].中国烟草科学，2011，32（3）：1-7.
[2] 李忠，杨洪明，徐世涛，等.基于质谱的代谢组学方法在烟草化学研究中的应用研究[J].分析测试学报，2007，26（S1）：294-295，299.
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[5] 李继新，潘文杰，田野，等.贵州典型生态区烟叶质量特点分析[J].中国烟草科学，2009，30（1）：62-67.
[6] 邵丽，晋艳，杨宇虹，等.生态条件对不同烤烟品种烟叶产质量的影响[J].烟草科技，2002（10）：40-45.
[7] 周昆，周清明，胡晓兰.烤烟香气物质研究进展[J].中国烟草科学，2008，29（2）：58-61.
[8] ANTHONY M L，ROSE V S，NICHOLSON J K，et al.Classification of toxininduced changes in 1H NMR spectra of urine using an artificial neural network[J].J Pharm Biomed Anal，1995，13（3）：205-211.
[9] BECKONERT O，BOLLARD M E，EBBELS T M D，et al.NMRbased metabonomic toxicity classification：Hierarchical cluster analysis and knearstneighbour approaches[J].Anal Chim Acta，2003，490：3-15.
[10] 沈剑波.清香型与浓香型烤烟部分质量因素的比较[D].郑州：河南农业大学，2008.
[11] 王能如，李章海，王东胜，等.我国烤烟主体香味成分研究初报[J].中国烟草科学，2009，30（3）：1-6.
[12] 杜咏梅，张建平，王树声，等.主导烤烟香型风格及感官质量差异的主要化学指标分析[J].中国烟草科学，2010，31（5）：7-12.
[13] 史宏志，刘国顺，杨惠娟，等.烟草香味学[M].北京：中国农业出版社，1998.
[14] 杨虹琦，周冀衡，罗泽民，等.不同产区烤烟中质体色素及降解产物的研究[J].西南农业大学学报（自然科学版），2004，26（5）：640-644.
[15] 肖协忠.烟草化学[M].北京：中国农业科技出版社，1997.