论文部分内容阅读
中图分类号 R284.2 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）23-3232-08
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.23.12
摘 要 目的：分析消肿止痛液有效部位的化学成分，为阐明其药效物质基础及将其二次开发为软膏制剂提供依据。方法：采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF-MS）法对消肿止痛液有效部位（经D101大孔树脂分离得到的40%乙醇洗脱部位）进行成分分析。色谱条件为采用Hypersil GOLD aQ C18色谱柱，以0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）为流动相进行梯度洗脫，流速0.4 mL/min，进样量4 μL，柱温30 ℃;质谱条件为采用电喷雾离子源（ESI）在正/负离子扫描模式（ESI+/ESI-）下进行检测，扫描范围100～2 000 Da，碰撞能量45/-45 eV，扩展碰撞器能量10/15 eV。获得图谱后收集化合物的精确分子量、保留时间和多级碎片离子信息，通过与对照品质谱信息及参考文献比对进行化学成分鉴定。结果：共鉴定出48个化合物，在ESI+、ESI-检测模式下分别鉴定出9、39个。其中，酚酸类成分10个、苯丙素类成分8个、蒽醌类成分9个、黄酮类成分3个、生物碱类成分7个、鞣质类成分5个、其他类成分6个。结论：UPLC-Q-TOF-MS法可快速、高效、准确地鉴定消肿止痛液有效部位的化学成分，该部位的主要化学成分为酚酸类、苯丙素类、蒽醌类、生物碱类和鞣质类。
关键词 消肿止痛液;有效部位;超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用法;化学成分;鉴定
Identification of Chemical Components in Active Fraction of Xiaozhong Zhitong Lotion by UPLC-Q-TOF- MS
WANG Yinjie1，2，LIU Benchen1，LIU Jun1，MO Jiaxin2，HU Anqi2，LIU Jiaqi2，FENG Qianyi2，GONG Kaimin1 （1.Preparation Center， Yinchuan Hospital of TCM， Yinchuan 750001， China;2.School of TCM， Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510006， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To analyze chemical components in active fraction of Xiaozhong zhitong lotion， to clarify the material basis of its efficacy， and to provide reference for the second development of ointment preparation. METHODS： UPLC-Q-TOF-MS was adopted to analyze the chemical components of active fraction （40% ethanol elution site separated by D101 macroporous resin） of Xiaozhong zhitong lotion. The determination was performed on Hypersil GOLD aQ C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid acetonitrile （A）-0.1% formic acid water （B） （gradient elution） at the flow rate of 0.4 mL/min. The sample size was 4 μL， and the column temperature was 30 ℃. The condition of mass spectrometry was ESI detection in positive and negative scanning ion mode （ESI+/ESI-）. The scanning range was 100-2 000 Da. The collision energy was 45/-45 eV， and the energy of the extended collider was 10/15 eV. The accurate molecular weight， retention time and multi-stage fragment ion information of the compounds were collected after obtaining the chromatogram， and the chemical components were identified by comparing with the mass spectrum information of reference materials and references. RESULTS： A total of 48 compounds were identified， and 9 and 39 compounds were identified under ESI+/ESI- ion mode， mainly including 10 phenolic acids， 8 phenylpropanoids， 9 anthraquinones， 3 flavones， 7 alkaloids， 5 tannins and 6 other categories. CONCLUSIONS： UPLC-Q-TOF- MS method is rapid， efficient and accurate for identify chemical components from active fraction of Xiaozhong zhitong lotion. Main chemical components of the active fraction are phenolic acids， phenylpropanoids， anthraquinones， alkaloids and tannins. KEYWORDS Xiaozhong zhitong lotion; Active fraction; UPLC-Q-TOF-MS; Chemical components; Identification
消肿止痛液是银川市中医医院（后文简称“我院”）的院内制剂（批准文号：宁药制字Z20140005），主要由大黄、黄柏、地榆、五倍子等八味中药组成，用于各种原因所致痔疮初期及外痔、混合痔、肛裂术后的消肿、止痛等，其治疗肛肠疾病术后疼痛、水肿的临床总有效率达93.33%[1]。本课题组前期通过动物实验筛选得到了该制剂具有消肿、促溃疡面愈合、镇痛的有效部位（经D101大孔树脂分离得到的40%乙醇洗脱部位）[2]，本研究拟采用超高液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF-MS）法对消肿止痛液有效部位的化学成分进行鉴定，以揭示该制剂的药效物质基础，为该制剂二次开发为软膏制剂提供依据，同时也为中药新药开发奠定基础。
1 材料
1.1 仪器
Triple-TOFTM 5600质谱仪（美国AB Sciex公司）;LC-30AD超高液相色谱仪（日本岛津公司）;XA105电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）。
1.2 药品与试剂
消肿止痛液有效部位提取物（由我院制剂室自制，批号：20171025，纯度：每1 g提取物相当于14.78 g生药）;没食子酸对照品（批号：110831-201605，纯度：≥98%）、小檗碱对照品（批号：110713-201212，纯度：≥98%）、大黄酸对照品（批号：110886-201612，纯度：≥98%）、大黄素对照品（批号：110756-201512，纯度：≥98%）均购于中国食品药品检定研究院;阿魏酸对照品（批号：wkq17112004，纯度：≥98%）、芦丁对照品（批号：wkq19010203，纯度：≥98%）均购于四川省维克奇生物科技有限公司;乙腈（德国默克公司，色谱纯）;甲酸（美国Fisher公司，色谱纯）;水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱与MS条件
2.1.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil GOLD aQ C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）;流动相：0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱（1～2 min，95%B;2～4 min，90%→85%B;4～6 min，85%→80%B;6～8 min，80%→75%B;8～15 min，75%→65%B;15～20 min，65%→55%B;20～22 min，55%→5%B;22～23 min，5%→0%B;23～24 min，0%→95%B;24～25 min，95%B），流速：0.4 mL/min;柱温：30 ℃;进样量：4 μL。
2.1.2 MS条件 采用电喷雾离子源（ESI），在信息关联（IDA）模式下进行正/负离子（ESI+/ESI-）扫描;离子喷雾电压为5 500/-4 500 V，去簇电压为100/-100 V;去溶剂温度为500 ℃;雾化气为氮气，雾化气压、辅助加热气压和气帘气压分别为55、55和35 psi;扫描范围为100～2 000 Da;碰撞能量为45/-45 eV;扩展碰撞器能量为10/15 eV。
2.2 溶液的制备
2.2.1 供试品溶液的制备 精密称取消肿止痛液有效部位干粉样品0.023 1 g，置于50 mL量瓶中，以50%甲醇超声（频率：40 kHz，功率：500 W）提取10 min，摇匀，滤过，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱、没食子酸、大黄素、大黄酸、阿魏酸、芦丁对照品适量，分别置于不同10 mL量瓶中，加入甲醇溶解，制备为单一对照品贮备液;分别精密量取上述贮备液适量，将其混合后加甲醇稀释，制备成混合对照品溶液（含盐酸小檗碱8.56 μg/mL、没食子酸4.16 μg/mL、大黄素5.62 μg/mL、大黄酸4.26 μg/mL、阿魏酸3.23 μg/mL、芦丁3.45 μg/mL）。
2.3 消肿止痛液有效部位化学成分的分析
首先查阅文献资料[3-29]及相关数据庫（PubMed、Mass Bank、Chemical Book），建立组方中各味药所含的化学成分库信息，信息内容包括中文名、英文名、分子式、准确分子质量、结构式和药材来源。再按“2.1”项下色谱和MS条件进样，将化学成分信息库导入PeakView 2.0软件 （AB Sciex）进行目标化合物峰查找，通过精准质量数（mass error<5 ppm）对结果进行过滤，获得匹配化合物后，解析其二级裂解碎片离子信息，进一步准确识别化学成分。结果，从该有效部位中共鉴定出了48个化学成分。在ESI-模式下响应较好，共鉴定出了39个化学成分;在ESI+模式下鉴定出了9个化学成分。消肿止痛液有效部位总离子流图见图1，化学成分鉴定结果见表1。
2.4 化合物的裂解特征分析
2.4.1 酚酸类 酚酸类化合物是指同一苯环上有若干个酚性羟基的一类化合物。本研究从消肿止痛液有效部位中共鉴定出了10个酚酸类化合物，分别是没食子酸、没食子酸乙酯、对香豆酸、没食子酸儿茶素、儿茶素没食子酸酯、3，3′-O-二甲基鞣花酸-硫酸酯、3，3′4′-O-三甲基鞣花酸-4-O-硫酸酯、对羟基苯甲酸、3，4′-O-二甲基鞣花酸和3，3′4′-O-三甲基鞣花酸。此类化合物在MS扫描过程中多以[M-H]-的准分子离子峰形式存在，高能碰撞下易产生[M-H-H2O]-或[M-H-CO2]-中性丢失的碎片离子。现以峰2和峰40为例进行裂解规律分析。 峰2的保留时间为0.84 min，ESI-模式下的准分子离子峰为m/z 169.018 8[M-H]-，二级碎片信息主要有 m/z 125.024 8[M-H-CO2]-、m/z 107.014 7[M-H-CO2-H2O]-，为脱去中性分子二氧化碳与相继脱去一分子水的碎片离子。可知该化合物的分子式为C7H6O5，其相对分子质量为170.021 5;该峰相对分子质量的理论值为169.014 25，实测值为169.014 82，误差为3.37 ppm。参考文献[3-4]，并与没食子酸对照品二级碎片离子信息进行比对，可判断该化合物为没食子酸。没食子酸的裂解途径见图2，峰2和没食子酸对照品的MS/MS图见图3。
峰40的保留时间为10.97 min，ESI-模式下的准分子离子峰为m/z 329.030 4[M-H]-，脱去一分子二氧化碳形成m/z 285.003 1[M-H-CO2]-，相继脱去一分子亚甲基形成m/z 270.987 6[M-H-CO2- CH2]-，再脱去一分子羰基形成m/z 242.992 6[M-H-CO2-CH2-CO]-;另一裂解途径为准分子离子峰脱去两分子甲基得到特征离子m/z 298.983 3[M-H-2CH3]-。该化合物的分子式为C16H10O8，其相对分子质量为330.037 6，该峰相对分子质量的理论值为329.030 29，实测值329.030 34，误差为0.16 ppm。参考文献[3，25]，可判断该化合物为3，4′-O-二甲基鞣花酸。3，4′-O-二甲基鞣花酸的MS裂解途径见图4，峰40的MS/MS图见图5。
2.4.2 苯丙素类 苯丙素类化合物是指基本母核具有一个或几个C6-C3单元的天然有机化合物类群，狭义而言，苯丙素类化合物是指简单苯丙素类、香豆素类、木质素类化合物。本研究从消肿止痛有效部位中共鉴定出了8个苯丙素类化合物，分别是新绿原酸、葡萄糖基丁香酸、阿魏酰奎宁酸、绿原酸、阿魏酸、3，5′-二咖啡酰奎宁酸、花椒毒素和九里香酮，其中新绿原酸和绿原酸为同分异构体（通过Chem Draw14.0软件计算化合物的脂水分配系数，根据不同脂水分配系数保留时间不同指认同分异构体，其与参考文献中两个化合物保留时间前后顺序一致[6]）。由于该类化合物一般具有多个和芳环连接的氧原子、羟基、甲氧基，故其质谱经常出现一系列连续失去羰基、羟基、 水、甲基或甲氧基的碎片离子峰，现以峰10为例进行裂解规律分析。
峰10的保留时间为6.49 min，ESI+模式下准分子离子峰为m/z 193.048 8[M-H]-，脱去一分子甲基形成m/z 178.024 8[M-H-CH3]-，相继脱去一分子二氧化碳形成 m/z 134.035 8[M-H-CH3-CO2]-。该化合物的分子式为C10H10O4，其相对分子质量为194.05 79;该峰相对分子质量的实测值为193.050 48，相对分子质量的理论值为193.050 63，误差为-0.79 ppm。参考文献[8，28]，并与阿魏酸对照品二级碎片离子信息进行比对，可判断该化合物为阿魏酸。阿魏酸的MS裂解途径见图6，峰10和阿魏酸对照品的MS/MS图见图7。
2.4.3 蒽醌类 蒽醌类化合物是指具有醌式结构的化学成分，天然蒽醌以9，10-蒽醌最为常见，整个分子形成共轭体系，C9、C10又处于最高氧化水平，比较稳定。在本研究中共从消肿止痛液有效部位鉴定出了9个蒽醌类化合物，分别是芦荟大黄素、大黄素-1-O-糖苷、大黄酸-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黄酚、大黄酸、大黄素、大黄酚-8-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芦荟苷、芦荟大黄素-8-O-（6′-O-乙酰）-糖苷。蒽醌母核上常有羟基、羟甲基、甲基、甲氧基和羧酸取代，游离蒽醌的MS裂解依次脱去两分子羰基。现以峰47和峰48为例进行裂解规律分析。
峰47的保留时间为16.83 min，ESI-模式下的准分子离子峰为m/z 283.025 5[M-H]-，其脱去一分子二氧化碳形成m/z 239.034 9[M-H-CO2]-，再连续2次脱去一分子羰基分别形成m/z 211.039 8[M-H-CO2-CO]-、m/z 183.044 8[M-H-CO2-2CO]-。该化合物的分子式为C15H8O6，其相对分子质量为284.032 1;该峰相对分子质量的理论值为283.024 81，实测值为283.025 03，誤差为0.78 ppm。参考文献[9，24]，并与大黄酸对照品二级碎片离子信息进行比对，可判断该化合物为大黄酸。大黄酸的MS裂解途径见图8，峰47和大黄酸对照品的MS/MS图见图9。
峰48的保留时间为21.34 min，ESI-模式下的准分子离子峰为m/z 269.043 6[M-H]-，脱去一分子羰基得到特征离子m/z 241.049 1[M-H-CO]-;二级碎片信息主要有准分子离子峰脱去一分子二氧化碳形成m/z 225.053 9[M-H-CO2]-，相继脱去一分子甲基形成m/z 210.031 4[M-H-CO2-CH3]-，再脱去一分子羰基形成m/z182.036 7[M-H-CO2-CH3-CO]-。该化合物的分子式为C15H10O5，其相对分子质量为270.052 8;该峰相对分子质量的理论值为269.045 55，实测值为269.045 80，误差为0.96 ppm。参考文献[7，22]，并与大黄素对照品二级碎片离子信息进行比对，可判断该化合物为大黄素。大黄素的MS裂解途径见图10，峰48和大黄素对照品的MS/MS图见图11。
2.4.4 黄酮类 黄酮类化合物是指基本母核为2-苯基色原酮的一类化合物。本研究从消肿止痛液有效部位中共鉴定出了3个黄酮类化合物，分别是山萘酚、芦丁、金丝桃苷。黄酮类质谱特征性强，除分子离子峰外，会失去甲基、羰基等碎片离子峰，现以峰16为例进行裂解规律分析。 峰16的保留时间为6.72 min，ESI-模式下的准分子离子峰为m/z 609.144 7[M-H]-，其脱去一分子芸香糖形成黄酮类特征基本母核离子碎片m/z 301.033 1[M-H- C12H20O9-C6H10O4]-，以及其他二级碎片离子m/z 178.997 7 [M-H-C6H10O5-C6H10O4-C7H6O2]-、m/z 151.003 1[M-H-C6H10O5- C6H10O4-C8H6O3]-。该化合物的分子式为C27H30O16，相对分子质量为610.153 4;该峰相对分子质量的理论值为609.146 57，实测值为609.146 11，误差为0.75 ppm。参考文献[12，29]，并与芦丁对照品二级碎片离子信息进行比对，可判断该化合物为芦丁。芦丁的MS裂解途径见图12，峰16和芦丁对照品的MS/MS图见图13。
2.4.5 生物碱类 生物碱是一类含氮有机化合物，多具有较强的生理活性。本研究共鉴定出了7个生物碱类化合物，分别是四氢药根碱、莲心季铵碱、益母草碱、四氢帕马丁、益母草碱衍生物、药根碱、小檗碱。生物碱主要为芳香体系组成，环系多、分子结构紧密，裂解困难，一般看不到由骨架裂解产生的特征离子，裂解主要发生在取代基或侧链上，现以峰41为例进行裂解规律分析。
峰41的保留时间为12.07 min，ESI+模式下的准分子离子峰为m/z 337.124 0[M+H]+，其脱去一分子甲基形成m/z 321.092 3[M+H-CH3-H]+，相继脱去一分子羰基形成m/z 293.097 5[M+H-CH3-H-CO]+;另一裂解途径为准分子离子峰m/z 337.124 0[M+H]+ 脱去两分子甲基和一分子羰基形成m/z 279.081 9[M+H-2CH3-CO]+。该化合物的分子式为C20H18NO4，相对分子质量为336.123 6，该峰相对分子质量的理论值为337.130 86，实测值为337.129 22，误差为-4.87 ppm。参考文献[4-5]，并与小檗碱对照品碎片离子进行对比，可判断该化合物为小檗碱。小檗碱的MS裂解途径见图14，峰41和小檗碱对照品的MS/MS图见图15。
2.4.6 鞣质 鞣质是由没食子酸（或其聚合物）的葡萄糖（及其他多元醇）酯、黄烷醇及其衍生物的聚合物以及两者混合共同组成的植物多元酚，分为水解鞣质、缩合鞣质和复合鞣质。可水解鞣质的裂解特点为连续丢失m/z为152的基团（没食子酰基）[30]，m/z为169和125的是没食子酸的裂解碎片离子。根据这些裂解特点结合文献[8]，本研究共鉴定出了2，3-O-二没食子酰葡萄糖苷、三没食子酸酰基葡萄糖或异构体、2，3，4，6-O-四没食子酰基-β-D-葡萄糖苷、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、2，3，4，6-O-四没食子酰基-β-D-甲基吡喃葡萄糖苷5个鞣质类化合物。
2.4.7 其他类 此外，本研究还从消肿止痛液有效部位中鉴定出了2个苯丁酮类化合物（莲花掌苷、异莲花掌苷）和白藜芦醇-4′-O-β-D-（6″-O-没食子酰）葡萄糖苷、对羰基苯甲酸乙酯、三棱酸以及决明松-8-O-β-吡喃葡萄糖苷。
3 讨论
中药复方的有效成分是复杂的多成分组合，即多种成分共同发挥作用。本研究在前期药效学研究的基础上，对筛选得到的有效部位采用UPLC-Q-TOF-MS法进行了全面分析。该法具有良好的分离能力且灵敏度和准确性高，目前已广泛应用于中药或复杂未知物的鉴定及定量分析。
本研究在选择色谱柱时，考察了ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Hypersil GOLD aQ C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）的分离效果。结果，若以ACQUITY UPLC BEH C18为色谱柱，在流速为0.4 mL/min时，柱压较高;而以Hypersil GOLD aQ C18为色谱柱时柱压较低且分离度较好。故最终选择Hypersil GOLD aQ C18色谱柱进行分析。在优化色谱条件时，比较了流动相乙腈-水和0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水，结果采用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水作为流动相时响应值和峰形均较好。
本研究选用ESI+、ESI-两种模式对样品进行分析，结果样品在ESI-模式下MS响应较好。通过目标筛选，参考特征裂解途径以及相关文献，共鉴定出了48个化合物，其相对分子质量理论值与实测值的误差均小于5 ppm。其中，酚酸类成分10个、苯丙素类成分8个、蒽醌类成分9个、黄酮类成分3个、生物碱类成分7个、鞣质成分5个，其他类成分6个。以上鉴定到的化学成分具有多方面药理活性。如酚酸类化学成分具有抗氧化、抗菌、消炎等活性[31];苯丙素类成分花椒毒素、九里香酮具有抗血小板聚集活性作用[32];小檗碱具有抗利尿和抗菌作用[33];蒽醌类成分大黄酸是大黄中的主要成分之一，具有抗炎、抗肿瘤、抗糖尿病肾病、抗病毒、抑菌等活性[34]，大黄素具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等作用[35];黄酮类成分具有抗心肌缺血、促进心肌收缩力、兴奋子宫、抗氧化及抑菌等作用[36]。鞣质成分主要来自地榆和大黄，地榆鞣质具有止血、抑菌、抗炎等作用，其止血成分主要为鞣花鞣质[37]，而大黄鞣质具有凉血止血功效[38]。以上不同种类、不同来源的活性成分，通过协同或互补的作用发挥消肿、止痛、抗溃疡愈合的功效，起到多通路、多靶點治疗作用。
综上，本研究基于UPLC-Q-TOF-MS法对消肿止痛液有效部位中的化学成分进行了快速、准确识别，明确了消肿止痛液消肿、止痛、抗溃疡愈合的药效成分，为促进医院制剂消肿止痛软膏的二次开发以及为中药新药的研发奠定了基础。
参考文献
[ 1 ] 余军，范娴娴.消肿止痛液治疗肛肠疾病术后疼痛水肿60例疗效观察[J].河北中医，2012，34（10）：1474-1475. [ 2 ] 王银洁，刘本臣，刘军，等.消肿止痛液消肿、促溃疡面愈合、镇痛的有效部位筛选[J].中国药房，2019，30（13）：1080-1086.
[ 3 ] 许维桐，霍志鹏，雷磊，等. HPLC-IT-TOF/MS分析地榆水煎液的化学成分群[J].中草药，2018，49（6）：1277-1288.
[ 4 ] 杨贤英，李金花，段宝忠，等.五倍子抑制流感病毒神经氨酸酶活性及活性部位的UPLC-Q-TOF-MS分析[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（16）：68-72.
[ 5 ] 李媛.黄柏、黄连体内外成分对比研究[D].哈尔滨：黑龙江中医药大学，2013.
[ 6 ] 王宇卿，耿榕徽，张须学.采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析宛艾化学成分[J].中国医院药学杂志，2018，38（5）：500-505.
[ 7 ] LI YB，ZHANG TJ，ZHANG XL，et al. Chemical fingerprint analysis of Phellodendri Amurensis Cortex by ultra performance LC/Q-TOF-MS methods combined with chemometrics[J]. J Sep Sci，2010，33（21）：3347-3353.
[ 8 ] 王晴，卢志威，刘月红，等. UPLC-Q-TOF/MSE结合诊断离子过滤方法快速分析大黄中酚类成分[J].中国中药杂志，2017，42（10）：1922-1931.
[ 9 ] 刘梦娇，王云，李玲云，等.三黄片化学成分的UPLC-Q- TOF-MS/MS快速鉴定分析[J].中国中药杂志，2017，42（9）：1685-1692.
[10] 崔培珅.大黄蒽醌ESI-ITMSn质谱行为的量子化学辅助研究[D].佳木斯：佳木斯大学，2013.
[11] 高亮亮.唐古特大黄、药用大黄和掌叶大黄的化学成分和生物活性研究[D].北京：北京协和医学院，2012.
[12] 庞汉青.基于药对作用的新生化颗粒配伍效应与物质基础研究[D].南京：南京中医药大学，2017.
[13] WANG GY，XU LW，SHI YP. Rapid analysis of multiple components in Radix Et Rhizoma Rhei using ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Acta Chromatogr，2011，23 （4）：653-672.
[14] 林敏婷，张超，唐思丽，等. LC/MS/MS鉴定莲子心生物碱在Caco-2细胞中的代谢产物[J].中药材，2015，38（12）：2531-2534.
[15] 刘冰松，陈应林. LC-MS/MS法测定复方益母草膏中有效成分的含量[J].沈阳药科大学学报，2016，33（4）：303- 306.
[16] 来进君.唐古特大黄蒽醌提取工艺、水提部位化学成分分离及抑菌活性的研究[D].西宁：青海师范大学，2017.
[17] 王冬梅，林森森，郑司浩，等.五倍子抑制表皮生长因子受体活性及活性部位的UPLC/Q-TOF-MS分析[J].中草药，2013，44（18）：2515-2519.
[18] 王旭光，杨洪军，王松松，等.基于LTQ-Orbitrap的白芷中5种呋喃香豆素类化合物的质谱裂解规律研究[J].中国中药杂志，2015，40（7）：1334-1341.
[19] 何成军.附子化学成分研究及益母草注射液化学成分研究[D].成都：成都中医药大学，2014.
[20] 熊亮，彭成.基于中药质量标志物（Q-Marker）的基本条件研究益母草和赶黄草的Q-Marker[J].中草药，2016，47（13）：2212-2220.
[21] 邱昆成.药对知母-黄柏的降糖作用及基于液质联用技术的化学物质研究[D].广州：广州中医药大学，2016.
[22] 陈瑶.关黄柏药材化学特性与环境因子的相关性研究[D].北京：北京协和医学院，2017.
[23] 张青青，辛欣，杨尚仁，等.复方栀黄提取物化学成分的快速定性分析[J].沈阳药科大学学报，2017，34（5）：389-395.
[24] 马冰.赤芍、大黄和黄柏中化学成分提取分离及结构鉴定研究[D].长春：长春师范大学，2014.
[25] 郭群，袁桥玉.高效液相色谱-电喷雾质谱联用分析喜树果鞣花酸类成分[J].林业科技，2012，37（1）：21-23.
[26] 任晓蕾，霍金海，孙国东，等.UPLC-Q-TOF-MS法分析防风中香豆素类化学成分[J].中国药房，2019，30（3）：349- 354.
[27] 元超，王鸿发，胡璇，等.UPLC-Q-TOF-MSE技术快速定性艾纳香抗菌有效部位的化学成分[J].天然产物研究与开发，2018，30（11）：1904-1912.
[28] 秦伟瀚，冉继春，叶良红，等. UPLC-Q/TOF法同时定性定量分析滇芹药材中主要化学成分[J].中草药，2018，49（15）：3576-3582.
[29] 伍明江，吴晓磊，张德芹，等. UPLC-Q-TOF/MS鉴定芦丁在大鼠体内的代谢产物[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（17）：91-97.
[30] 马尚智，秦惠玉，龙飞，等.没食子多酚类化合物的鉴定及其在UPLC-MS/MS中的裂解规律研究[J].中草药，2017，48（22）：4632-4638.
[31] 林鹏飞，贾小舟，祁燕，等.酚酸类化合物研究进展[J].广东化工，2017，44（1）：50-52.
[32] 杨槐，周勤梅，彭成，等.益母草香豆素类化学成分与抗血小板聚集活性[J].中国中药杂志，2014，39（22）：4356- 4359.
[33] 李先宽，冯杉，郑艳超，等.黄柏与关黄柏的化学成分及生物活性研究进展[J].药物评价研究，2019，42（5）：1033- 1037.
[34] 陈秋荷，皮荣标，陈景考.大黄酸及其衍生物：合成与药理作用研究进展[J].药学研究，2016，35（3）：161-167.
[35] 陈艳琰，唐于平，陈嘉倩，等.大黄资源化学研究进展与利用策略[J].中草药，2018，49（21）：5170-5178.
[36] 李聘，陸治名，张百霞.益母草中黄酮类成分的研究进展[J].医学研究与教育，2017，34（4）：63-68.
[37] 陈鹏，周本宏.地榆鞣质的化学成分及生物活性研究进展[J].中国药师，2018，21（7）：1253-1258.
[38] 王亦君，冯舒涵，程锦堂，等.大黄蒽醌类化学成分和药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2018，24（13）：227-234.
（收稿日期：2019-08-12 修回日期：2019-09-26）
（编辑：林 静）
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.23.12
摘 要 目的：分析消肿止痛液有效部位的化学成分，为阐明其药效物质基础及将其二次开发为软膏制剂提供依据。方法：采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF-MS）法对消肿止痛液有效部位（经D101大孔树脂分离得到的40%乙醇洗脱部位）进行成分分析。色谱条件为采用Hypersil GOLD aQ C18色谱柱，以0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）为流动相进行梯度洗脫，流速0.4 mL/min，进样量4 μL，柱温30 ℃;质谱条件为采用电喷雾离子源（ESI）在正/负离子扫描模式（ESI+/ESI-）下进行检测，扫描范围100～2 000 Da，碰撞能量45/-45 eV，扩展碰撞器能量10/15 eV。获得图谱后收集化合物的精确分子量、保留时间和多级碎片离子信息，通过与对照品质谱信息及参考文献比对进行化学成分鉴定。结果：共鉴定出48个化合物，在ESI+、ESI-检测模式下分别鉴定出9、39个。其中，酚酸类成分10个、苯丙素类成分8个、蒽醌类成分9个、黄酮类成分3个、生物碱类成分7个、鞣质类成分5个、其他类成分6个。结论：UPLC-Q-TOF-MS法可快速、高效、准确地鉴定消肿止痛液有效部位的化学成分，该部位的主要化学成分为酚酸类、苯丙素类、蒽醌类、生物碱类和鞣质类。
关键词 消肿止痛液;有效部位;超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用法;化学成分;鉴定
Identification of Chemical Components in Active Fraction of Xiaozhong Zhitong Lotion by UPLC-Q-TOF- MS
WANG Yinjie1，2，LIU Benchen1，LIU Jun1，MO Jiaxin2，HU Anqi2，LIU Jiaqi2，FENG Qianyi2，GONG Kaimin1 （1.Preparation Center， Yinchuan Hospital of TCM， Yinchuan 750001， China;2.School of TCM， Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510006， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To analyze chemical components in active fraction of Xiaozhong zhitong lotion， to clarify the material basis of its efficacy， and to provide reference for the second development of ointment preparation. METHODS： UPLC-Q-TOF-MS was adopted to analyze the chemical components of active fraction （40% ethanol elution site separated by D101 macroporous resin） of Xiaozhong zhitong lotion. The determination was performed on Hypersil GOLD aQ C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid acetonitrile （A）-0.1% formic acid water （B） （gradient elution） at the flow rate of 0.4 mL/min. The sample size was 4 μL， and the column temperature was 30 ℃. The condition of mass spectrometry was ESI detection in positive and negative scanning ion mode （ESI+/ESI-）. The scanning range was 100-2 000 Da. The collision energy was 45/-45 eV， and the energy of the extended collider was 10/15 eV. The accurate molecular weight， retention time and multi-stage fragment ion information of the compounds were collected after obtaining the chromatogram， and the chemical components were identified by comparing with the mass spectrum information of reference materials and references. RESULTS： A total of 48 compounds were identified， and 9 and 39 compounds were identified under ESI+/ESI- ion mode， mainly including 10 phenolic acids， 8 phenylpropanoids， 9 anthraquinones， 3 flavones， 7 alkaloids， 5 tannins and 6 other categories. CONCLUSIONS： UPLC-Q-TOF- MS method is rapid， efficient and accurate for identify chemical components from active fraction of Xiaozhong zhitong lotion. Main chemical components of the active fraction are phenolic acids， phenylpropanoids， anthraquinones， alkaloids and tannins. KEYWORDS Xiaozhong zhitong lotion; Active fraction; UPLC-Q-TOF-MS; Chemical components; Identification
消肿止痛液是银川市中医医院（后文简称“我院”）的院内制剂（批准文号：宁药制字Z20140005），主要由大黄、黄柏、地榆、五倍子等八味中药组成，用于各种原因所致痔疮初期及外痔、混合痔、肛裂术后的消肿、止痛等，其治疗肛肠疾病术后疼痛、水肿的临床总有效率达93.33%[1]。本课题组前期通过动物实验筛选得到了该制剂具有消肿、促溃疡面愈合、镇痛的有效部位（经D101大孔树脂分离得到的40%乙醇洗脱部位）[2]，本研究拟采用超高液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF-MS）法对消肿止痛液有效部位的化学成分进行鉴定，以揭示该制剂的药效物质基础，为该制剂二次开发为软膏制剂提供依据，同时也为中药新药开发奠定基础。
1 材料
1.1 仪器
Triple-TOFTM 5600质谱仪（美国AB Sciex公司）;LC-30AD超高液相色谱仪（日本岛津公司）;XA105电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）。
1.2 药品与试剂
消肿止痛液有效部位提取物（由我院制剂室自制，批号：20171025，纯度：每1 g提取物相当于14.78 g生药）;没食子酸对照品（批号：110831-201605，纯度：≥98%）、小檗碱对照品（批号：110713-201212，纯度：≥98%）、大黄酸对照品（批号：110886-201612，纯度：≥98%）、大黄素对照品（批号：110756-201512，纯度：≥98%）均购于中国食品药品检定研究院;阿魏酸对照品（批号：wkq17112004，纯度：≥98%）、芦丁对照品（批号：wkq19010203，纯度：≥98%）均购于四川省维克奇生物科技有限公司;乙腈（德国默克公司，色谱纯）;甲酸（美国Fisher公司，色谱纯）;水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱与MS条件
2.1.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil GOLD aQ C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）;流动相：0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱（1～2 min，95%B;2～4 min，90%→85%B;4～6 min，85%→80%B;6～8 min，80%→75%B;8～15 min，75%→65%B;15～20 min，65%→55%B;20～22 min，55%→5%B;22～23 min，5%→0%B;23～24 min，0%→95%B;24～25 min，95%B），流速：0.4 mL/min;柱温：30 ℃;进样量：4 μL。
2.1.2 MS条件 采用电喷雾离子源（ESI），在信息关联（IDA）模式下进行正/负离子（ESI+/ESI-）扫描;离子喷雾电压为5 500/-4 500 V，去簇电压为100/-100 V;去溶剂温度为500 ℃;雾化气为氮气，雾化气压、辅助加热气压和气帘气压分别为55、55和35 psi;扫描范围为100～2 000 Da;碰撞能量为45/-45 eV;扩展碰撞器能量为10/15 eV。
2.2 溶液的制备
2.2.1 供试品溶液的制备 精密称取消肿止痛液有效部位干粉样品0.023 1 g，置于50 mL量瓶中，以50%甲醇超声（频率：40 kHz，功率：500 W）提取10 min，摇匀，滤过，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱、没食子酸、大黄素、大黄酸、阿魏酸、芦丁对照品适量，分别置于不同10 mL量瓶中，加入甲醇溶解，制备为单一对照品贮备液;分别精密量取上述贮备液适量，将其混合后加甲醇稀释，制备成混合对照品溶液（含盐酸小檗碱8.56 μg/mL、没食子酸4.16 μg/mL、大黄素5.62 μg/mL、大黄酸4.26 μg/mL、阿魏酸3.23 μg/mL、芦丁3.45 μg/mL）。
2.3 消肿止痛液有效部位化学成分的分析
首先查阅文献资料[3-29]及相关数据庫（PubMed、Mass Bank、Chemical Book），建立组方中各味药所含的化学成分库信息，信息内容包括中文名、英文名、分子式、准确分子质量、结构式和药材来源。再按“2.1”项下色谱和MS条件进样，将化学成分信息库导入PeakView 2.0软件 （AB Sciex）进行目标化合物峰查找，通过精准质量数（mass error<5 ppm）对结果进行过滤，获得匹配化合物后，解析其二级裂解碎片离子信息，进一步准确识别化学成分。结果，从该有效部位中共鉴定出了48个化学成分。在ESI-模式下响应较好，共鉴定出了39个化学成分;在ESI+模式下鉴定出了9个化学成分。消肿止痛液有效部位总离子流图见图1，化学成分鉴定结果见表1。
2.4 化合物的裂解特征分析
2.4.1 酚酸类 酚酸类化合物是指同一苯环上有若干个酚性羟基的一类化合物。本研究从消肿止痛液有效部位中共鉴定出了10个酚酸类化合物，分别是没食子酸、没食子酸乙酯、对香豆酸、没食子酸儿茶素、儿茶素没食子酸酯、3，3′-O-二甲基鞣花酸-硫酸酯、3，3′4′-O-三甲基鞣花酸-4-O-硫酸酯、对羟基苯甲酸、3，4′-O-二甲基鞣花酸和3，3′4′-O-三甲基鞣花酸。此类化合物在MS扫描过程中多以[M-H]-的准分子离子峰形式存在，高能碰撞下易产生[M-H-H2O]-或[M-H-CO2]-中性丢失的碎片离子。现以峰2和峰40为例进行裂解规律分析。 峰2的保留时间为0.84 min，ESI-模式下的准分子离子峰为m/z 169.018 8[M-H]-，二级碎片信息主要有 m/z 125.024 8[M-H-CO2]-、m/z 107.014 7[M-H-CO2-H2O]-，为脱去中性分子二氧化碳与相继脱去一分子水的碎片离子。可知该化合物的分子式为C7H6O5，其相对分子质量为170.021 5;该峰相对分子质量的理论值为169.014 25，实测值为169.014 82，误差为3.37 ppm。参考文献[3-4]，并与没食子酸对照品二级碎片离子信息进行比对，可判断该化合物为没食子酸。没食子酸的裂解途径见图2，峰2和没食子酸对照品的MS/MS图见图3。
峰40的保留时间为10.97 min，ESI-模式下的准分子离子峰为m/z 329.030 4[M-H]-，脱去一分子二氧化碳形成m/z 285.003 1[M-H-CO2]-，相继脱去一分子亚甲基形成m/z 270.987 6[M-H-CO2- CH2]-，再脱去一分子羰基形成m/z 242.992 6[M-H-CO2-CH2-CO]-;另一裂解途径为准分子离子峰脱去两分子甲基得到特征离子m/z 298.983 3[M-H-2CH3]-。该化合物的分子式为C16H10O8，其相对分子质量为330.037 6，该峰相对分子质量的理论值为329.030 29，实测值329.030 34，误差为0.16 ppm。参考文献[3，25]，可判断该化合物为3，4′-O-二甲基鞣花酸。3，4′-O-二甲基鞣花酸的MS裂解途径见图4，峰40的MS/MS图见图5。
2.4.2 苯丙素类 苯丙素类化合物是指基本母核具有一个或几个C6-C3单元的天然有机化合物类群，狭义而言，苯丙素类化合物是指简单苯丙素类、香豆素类、木质素类化合物。本研究从消肿止痛有效部位中共鉴定出了8个苯丙素类化合物，分别是新绿原酸、葡萄糖基丁香酸、阿魏酰奎宁酸、绿原酸、阿魏酸、3，5′-二咖啡酰奎宁酸、花椒毒素和九里香酮，其中新绿原酸和绿原酸为同分异构体（通过Chem Draw14.0软件计算化合物的脂水分配系数，根据不同脂水分配系数保留时间不同指认同分异构体，其与参考文献中两个化合物保留时间前后顺序一致[6]）。由于该类化合物一般具有多个和芳环连接的氧原子、羟基、甲氧基，故其质谱经常出现一系列连续失去羰基、羟基、 水、甲基或甲氧基的碎片离子峰，现以峰10为例进行裂解规律分析。
峰10的保留时间为6.49 min，ESI+模式下准分子离子峰为m/z 193.048 8[M-H]-，脱去一分子甲基形成m/z 178.024 8[M-H-CH3]-，相继脱去一分子二氧化碳形成 m/z 134.035 8[M-H-CH3-CO2]-。该化合物的分子式为C10H10O4，其相对分子质量为194.05 79;该峰相对分子质量的实测值为193.050 48，相对分子质量的理论值为193.050 63，误差为-0.79 ppm。参考文献[8，28]，并与阿魏酸对照品二级碎片离子信息进行比对，可判断该化合物为阿魏酸。阿魏酸的MS裂解途径见图6，峰10和阿魏酸对照品的MS/MS图见图7。
2.4.3 蒽醌类 蒽醌类化合物是指具有醌式结构的化学成分，天然蒽醌以9，10-蒽醌最为常见，整个分子形成共轭体系，C9、C10又处于最高氧化水平，比较稳定。在本研究中共从消肿止痛液有效部位鉴定出了9个蒽醌类化合物，分别是芦荟大黄素、大黄素-1-O-糖苷、大黄酸-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黄酚、大黄酸、大黄素、大黄酚-8-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芦荟苷、芦荟大黄素-8-O-（6′-O-乙酰）-糖苷。蒽醌母核上常有羟基、羟甲基、甲基、甲氧基和羧酸取代，游离蒽醌的MS裂解依次脱去两分子羰基。现以峰47和峰48为例进行裂解规律分析。
峰47的保留时间为16.83 min，ESI-模式下的准分子离子峰为m/z 283.025 5[M-H]-，其脱去一分子二氧化碳形成m/z 239.034 9[M-H-CO2]-，再连续2次脱去一分子羰基分别形成m/z 211.039 8[M-H-CO2-CO]-、m/z 183.044 8[M-H-CO2-2CO]-。该化合物的分子式为C15H8O6，其相对分子质量为284.032 1;该峰相对分子质量的理论值为283.024 81，实测值为283.025 03，誤差为0.78 ppm。参考文献[9，24]，并与大黄酸对照品二级碎片离子信息进行比对，可判断该化合物为大黄酸。大黄酸的MS裂解途径见图8，峰47和大黄酸对照品的MS/MS图见图9。
峰48的保留时间为21.34 min，ESI-模式下的准分子离子峰为m/z 269.043 6[M-H]-，脱去一分子羰基得到特征离子m/z 241.049 1[M-H-CO]-;二级碎片信息主要有准分子离子峰脱去一分子二氧化碳形成m/z 225.053 9[M-H-CO2]-，相继脱去一分子甲基形成m/z 210.031 4[M-H-CO2-CH3]-，再脱去一分子羰基形成m/z182.036 7[M-H-CO2-CH3-CO]-。该化合物的分子式为C15H10O5，其相对分子质量为270.052 8;该峰相对分子质量的理论值为269.045 55，实测值为269.045 80，误差为0.96 ppm。参考文献[7，22]，并与大黄素对照品二级碎片离子信息进行比对，可判断该化合物为大黄素。大黄素的MS裂解途径见图10，峰48和大黄素对照品的MS/MS图见图11。
2.4.4 黄酮类 黄酮类化合物是指基本母核为2-苯基色原酮的一类化合物。本研究从消肿止痛液有效部位中共鉴定出了3个黄酮类化合物，分别是山萘酚、芦丁、金丝桃苷。黄酮类质谱特征性强，除分子离子峰外，会失去甲基、羰基等碎片离子峰，现以峰16为例进行裂解规律分析。 峰16的保留时间为6.72 min，ESI-模式下的准分子离子峰为m/z 609.144 7[M-H]-，其脱去一分子芸香糖形成黄酮类特征基本母核离子碎片m/z 301.033 1[M-H- C12H20O9-C6H10O4]-，以及其他二级碎片离子m/z 178.997 7 [M-H-C6H10O5-C6H10O4-C7H6O2]-、m/z 151.003 1[M-H-C6H10O5- C6H10O4-C8H6O3]-。该化合物的分子式为C27H30O16，相对分子质量为610.153 4;该峰相对分子质量的理论值为609.146 57，实测值为609.146 11，误差为0.75 ppm。参考文献[12，29]，并与芦丁对照品二级碎片离子信息进行比对，可判断该化合物为芦丁。芦丁的MS裂解途径见图12，峰16和芦丁对照品的MS/MS图见图13。
2.4.5 生物碱类 生物碱是一类含氮有机化合物，多具有较强的生理活性。本研究共鉴定出了7个生物碱类化合物，分别是四氢药根碱、莲心季铵碱、益母草碱、四氢帕马丁、益母草碱衍生物、药根碱、小檗碱。生物碱主要为芳香体系组成，环系多、分子结构紧密，裂解困难，一般看不到由骨架裂解产生的特征离子，裂解主要发生在取代基或侧链上，现以峰41为例进行裂解规律分析。
峰41的保留时间为12.07 min，ESI+模式下的准分子离子峰为m/z 337.124 0[M+H]+，其脱去一分子甲基形成m/z 321.092 3[M+H-CH3-H]+，相继脱去一分子羰基形成m/z 293.097 5[M+H-CH3-H-CO]+;另一裂解途径为准分子离子峰m/z 337.124 0[M+H]+ 脱去两分子甲基和一分子羰基形成m/z 279.081 9[M+H-2CH3-CO]+。该化合物的分子式为C20H18NO4，相对分子质量为336.123 6，该峰相对分子质量的理论值为337.130 86，实测值为337.129 22，误差为-4.87 ppm。参考文献[4-5]，并与小檗碱对照品碎片离子进行对比，可判断该化合物为小檗碱。小檗碱的MS裂解途径见图14，峰41和小檗碱对照品的MS/MS图见图15。
2.4.6 鞣质 鞣质是由没食子酸（或其聚合物）的葡萄糖（及其他多元醇）酯、黄烷醇及其衍生物的聚合物以及两者混合共同组成的植物多元酚，分为水解鞣质、缩合鞣质和复合鞣质。可水解鞣质的裂解特点为连续丢失m/z为152的基团（没食子酰基）[30]，m/z为169和125的是没食子酸的裂解碎片离子。根据这些裂解特点结合文献[8]，本研究共鉴定出了2，3-O-二没食子酰葡萄糖苷、三没食子酸酰基葡萄糖或异构体、2，3，4，6-O-四没食子酰基-β-D-葡萄糖苷、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、2，3，4，6-O-四没食子酰基-β-D-甲基吡喃葡萄糖苷5个鞣质类化合物。
2.4.7 其他类 此外，本研究还从消肿止痛液有效部位中鉴定出了2个苯丁酮类化合物（莲花掌苷、异莲花掌苷）和白藜芦醇-4′-O-β-D-（6″-O-没食子酰）葡萄糖苷、对羰基苯甲酸乙酯、三棱酸以及决明松-8-O-β-吡喃葡萄糖苷。
3 讨论
中药复方的有效成分是复杂的多成分组合，即多种成分共同发挥作用。本研究在前期药效学研究的基础上，对筛选得到的有效部位采用UPLC-Q-TOF-MS法进行了全面分析。该法具有良好的分离能力且灵敏度和准确性高，目前已广泛应用于中药或复杂未知物的鉴定及定量分析。
本研究在选择色谱柱时，考察了ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Hypersil GOLD aQ C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）的分离效果。结果，若以ACQUITY UPLC BEH C18为色谱柱，在流速为0.4 mL/min时，柱压较高;而以Hypersil GOLD aQ C18为色谱柱时柱压较低且分离度较好。故最终选择Hypersil GOLD aQ C18色谱柱进行分析。在优化色谱条件时，比较了流动相乙腈-水和0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水，结果采用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水作为流动相时响应值和峰形均较好。
本研究选用ESI+、ESI-两种模式对样品进行分析，结果样品在ESI-模式下MS响应较好。通过目标筛选，参考特征裂解途径以及相关文献，共鉴定出了48个化合物，其相对分子质量理论值与实测值的误差均小于5 ppm。其中，酚酸类成分10个、苯丙素类成分8个、蒽醌类成分9个、黄酮类成分3个、生物碱类成分7个、鞣质成分5个，其他类成分6个。以上鉴定到的化学成分具有多方面药理活性。如酚酸类化学成分具有抗氧化、抗菌、消炎等活性[31];苯丙素类成分花椒毒素、九里香酮具有抗血小板聚集活性作用[32];小檗碱具有抗利尿和抗菌作用[33];蒽醌类成分大黄酸是大黄中的主要成分之一，具有抗炎、抗肿瘤、抗糖尿病肾病、抗病毒、抑菌等活性[34]，大黄素具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等作用[35];黄酮类成分具有抗心肌缺血、促进心肌收缩力、兴奋子宫、抗氧化及抑菌等作用[36]。鞣质成分主要来自地榆和大黄，地榆鞣质具有止血、抑菌、抗炎等作用，其止血成分主要为鞣花鞣质[37]，而大黄鞣质具有凉血止血功效[38]。以上不同种类、不同来源的活性成分，通过协同或互补的作用发挥消肿、止痛、抗溃疡愈合的功效，起到多通路、多靶點治疗作用。
综上，本研究基于UPLC-Q-TOF-MS法对消肿止痛液有效部位中的化学成分进行了快速、准确识别，明确了消肿止痛液消肿、止痛、抗溃疡愈合的药效成分，为促进医院制剂消肿止痛软膏的二次开发以及为中药新药的研发奠定了基础。
参考文献
[ 1 ] 余军，范娴娴.消肿止痛液治疗肛肠疾病术后疼痛水肿60例疗效观察[J].河北中医，2012，34（10）：1474-1475. [ 2 ] 王银洁，刘本臣，刘军，等.消肿止痛液消肿、促溃疡面愈合、镇痛的有效部位筛选[J].中国药房，2019，30（13）：1080-1086.
[ 3 ] 许维桐，霍志鹏，雷磊，等. HPLC-IT-TOF/MS分析地榆水煎液的化学成分群[J].中草药，2018，49（6）：1277-1288.
[ 4 ] 杨贤英，李金花，段宝忠，等.五倍子抑制流感病毒神经氨酸酶活性及活性部位的UPLC-Q-TOF-MS分析[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（16）：68-72.
[ 5 ] 李媛.黄柏、黄连体内外成分对比研究[D].哈尔滨：黑龙江中医药大学，2013.
[ 6 ] 王宇卿，耿榕徽，张须学.采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析宛艾化学成分[J].中国医院药学杂志，2018，38（5）：500-505.
[ 7 ] LI YB，ZHANG TJ，ZHANG XL，et al. Chemical fingerprint analysis of Phellodendri Amurensis Cortex by ultra performance LC/Q-TOF-MS methods combined with chemometrics[J]. J Sep Sci，2010，33（21）：3347-3353.
[ 8 ] 王晴，卢志威，刘月红，等. UPLC-Q-TOF/MSE结合诊断离子过滤方法快速分析大黄中酚类成分[J].中国中药杂志，2017，42（10）：1922-1931.
[ 9 ] 刘梦娇，王云，李玲云，等.三黄片化学成分的UPLC-Q- TOF-MS/MS快速鉴定分析[J].中国中药杂志，2017，42（9）：1685-1692.
[10] 崔培珅.大黄蒽醌ESI-ITMSn质谱行为的量子化学辅助研究[D].佳木斯：佳木斯大学，2013.
[11] 高亮亮.唐古特大黄、药用大黄和掌叶大黄的化学成分和生物活性研究[D].北京：北京协和医学院，2012.
[12] 庞汉青.基于药对作用的新生化颗粒配伍效应与物质基础研究[D].南京：南京中医药大学，2017.
[13] WANG GY，XU LW，SHI YP. Rapid analysis of multiple components in Radix Et Rhizoma Rhei using ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Acta Chromatogr，2011，23 （4）：653-672.
[14] 林敏婷，张超，唐思丽，等. LC/MS/MS鉴定莲子心生物碱在Caco-2细胞中的代谢产物[J].中药材，2015，38（12）：2531-2534.
[15] 刘冰松，陈应林. LC-MS/MS法测定复方益母草膏中有效成分的含量[J].沈阳药科大学学报，2016，33（4）：303- 306.
[16] 来进君.唐古特大黄蒽醌提取工艺、水提部位化学成分分离及抑菌活性的研究[D].西宁：青海师范大学，2017.
[17] 王冬梅，林森森，郑司浩，等.五倍子抑制表皮生长因子受体活性及活性部位的UPLC/Q-TOF-MS分析[J].中草药，2013，44（18）：2515-2519.
[18] 王旭光，杨洪军，王松松，等.基于LTQ-Orbitrap的白芷中5种呋喃香豆素类化合物的质谱裂解规律研究[J].中国中药杂志，2015，40（7）：1334-1341.
[19] 何成军.附子化学成分研究及益母草注射液化学成分研究[D].成都：成都中医药大学，2014.
[20] 熊亮，彭成.基于中药质量标志物（Q-Marker）的基本条件研究益母草和赶黄草的Q-Marker[J].中草药，2016，47（13）：2212-2220.
[21] 邱昆成.药对知母-黄柏的降糖作用及基于液质联用技术的化学物质研究[D].广州：广州中医药大学，2016.
[22] 陈瑶.关黄柏药材化学特性与环境因子的相关性研究[D].北京：北京协和医学院，2017.
[23] 张青青，辛欣，杨尚仁，等.复方栀黄提取物化学成分的快速定性分析[J].沈阳药科大学学报，2017，34（5）：389-395.
[24] 马冰.赤芍、大黄和黄柏中化学成分提取分离及结构鉴定研究[D].长春：长春师范大学，2014.
[25] 郭群，袁桥玉.高效液相色谱-电喷雾质谱联用分析喜树果鞣花酸类成分[J].林业科技，2012，37（1）：21-23.
[26] 任晓蕾，霍金海，孙国东，等.UPLC-Q-TOF-MS法分析防风中香豆素类化学成分[J].中国药房，2019，30（3）：349- 354.
[27] 元超，王鸿发，胡璇，等.UPLC-Q-TOF-MSE技术快速定性艾纳香抗菌有效部位的化学成分[J].天然产物研究与开发，2018，30（11）：1904-1912.
[28] 秦伟瀚，冉继春，叶良红，等. UPLC-Q/TOF法同时定性定量分析滇芹药材中主要化学成分[J].中草药，2018，49（15）：3576-3582.
[29] 伍明江，吴晓磊，张德芹，等. UPLC-Q-TOF/MS鉴定芦丁在大鼠体内的代谢产物[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（17）：91-97.
[30] 马尚智，秦惠玉，龙飞，等.没食子多酚类化合物的鉴定及其在UPLC-MS/MS中的裂解规律研究[J].中草药，2017，48（22）：4632-4638.
[31] 林鹏飞，贾小舟，祁燕，等.酚酸类化合物研究进展[J].广东化工，2017，44（1）：50-52.
[32] 杨槐，周勤梅，彭成，等.益母草香豆素类化学成分与抗血小板聚集活性[J].中国中药杂志，2014，39（22）：4356- 4359.
[33] 李先宽，冯杉，郑艳超，等.黄柏与关黄柏的化学成分及生物活性研究进展[J].药物评价研究，2019，42（5）：1033- 1037.
[34] 陈秋荷，皮荣标，陈景考.大黄酸及其衍生物：合成与药理作用研究进展[J].药学研究，2016，35（3）：161-167.
[35] 陈艳琰，唐于平，陈嘉倩，等.大黄资源化学研究进展与利用策略[J].中草药，2018，49（21）：5170-5178.
[36] 李聘，陸治名，张百霞.益母草中黄酮类成分的研究进展[J].医学研究与教育，2017，34（4）：63-68.
[37] 陈鹏，周本宏.地榆鞣质的化学成分及生物活性研究进展[J].中国药师，2018，21（7）：1253-1258.
[38] 王亦君，冯舒涵，程锦堂，等.大黄蒽醌类化学成分和药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2018，24（13）：227-234.
（收稿日期：2019-08-12 修回日期：2019-09-26）
（编辑：林 静）