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摘 要： 酸性轉化酶作为蔗糖代谢中的关键酶，在还原糖积累型荔枝中表达及酶活性显著高于蔗糖积累型荔枝。为了全面了解酸性转化酶的生物学特征，该文通过运用生物信息学方法对荔枝果实酸性转化酶LcSAI基因的基本理化性质、蛋白二级结构、亲水性/疏水性、跨膜结构域、信号肽、磷酸化位点、保守结构域、系统进化进行系统的分析;利用qRT-PCR技术对LcSAI在‘妃子笑’不同组织和果实不同发育阶段进行表达分析。结果表明：（1）荔枝果实酸性转化酶为定位于液泡的亲水性不稳定蛋白，无信号肽，其蛋白的二级结构主要有无规则卷曲和延伸链构件，并散布于整个蛋白;（2）在N-端含有一个跨膜区，包含两个保守结构域，位于N-端的Pfam DUF3357结构域和Glyco_32结构域，属于糖基水解酶基因家族32超家族;（3）系统进化分析结果显示LcSAI与龙眼酸性转化酶基因同源，不同组织间LcSAI表达水平为雄花>根>嫩茎>种子>嫩叶>雌花>果皮>老叶，果实不同发育阶段LcSAI表达具有特异性。该研究为深入研究LcSAI果实酸性转化酶基因调控蔗糖代谢途径机理提供数据依据。
关键词： 荔枝， 酸性转化酶， 生物信息学， 表达分析
中图分类号： Q943
文献标识码： A
文章编号： 1000-3142（2021）06-0989-08
收稿日期： 2020-01-19
基金项目： 国家重点研发计划（2019YFD1000900）;中央级公益性科研院所基本科研业务专项（1630062021010）;国家荔枝龙眼产业技术体系（CARS-32-20）;广东省自然科学基金（2018A030307012）[Supported by the National Key R & D Program of China （2019YFD1000900）; Special Program of Central Public Research Institutes for Basic Research （1630062021010）; China Litchi and Longan Industry Technology Research System （CARS-32-20）; Natural Science Foundation of Guangdong Province （2018A030307012]。
作者简介： 董晨（1981-），硕士，副研究员，主要从事热带果树分子生物学研究，（E-mail）[email protected]。
*通信作者： 李伟才，研究员，主要从事果树学研究，（E-mail）[email protected]。
Bioinformatics and expression analysis of acid invertase LcSAI of Litchi chinesis
DONG Chen， WEI Yongzan， WANG Yi， ZHENG Xuewen， LI Weicai*
（ Institute of South Subtropical Corp Research， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science， Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture， Zhanjiang 524091， Guangdong， China ）
Abstract： As a key enzyme in sucrose metabolism， acid invertase expression and enzyme activity was significantly higher in reducing sugar accumulation litchi than in sucrose accumulation litchi. In order to fully understand the biological characteristics of acid invertase， we systematically analyzed the basic physical and chemical properties， protein secondary structure， hydrophilic/hydrophobic， transmememal domain， signal peptide， phosphorylation site， conserved domain and phylogenetic evolution of LcSAI by bioinformatics， and analyzed the expression of LcSAI in different tissues and fruits at different developmental stages of Litchi chinesis ‘Feizixiao’ by using qRT-PCR. The results were as follows： （1） The acid invertase of litchi fruit was a hydrophilic unstable protein localized to vacuole， and there was no signal peptide. The secondary structure of the protein mainly consisted of irregularly coiled and extended chain members， which were scattered throughout the protein. （2） LcSAI contained a transmembrane region at the N-terminus， including two conserved domains， the N-terminal Pfam DUF3357 domain and the Glyco_32 domain， belonging to the glycosyl hydrolase gene family 32 superfamily. Phylogenetic evolution indicated LcSAI homology with the longan acid invertase gene， the LcSAI expression levels were male flower > root > young stem > seed > young leaf > female flower > peel >mature leaf; the expression of LcSAI in different stages of fruit development was specific， LcSAI expression reached a peak in the second week， then LcSAI expression dropped sharply in the third week， gradually increased in the fourth and fifth weeks， and decreased to a minimum in the eighth week of fruit development. This study provides a theoretical reference for further study of the mechanism of LcSAI fruit acid invertase gene regulation of sucrose metabolism pathway. Key words： Litchi chinensis， acid invertase， bioinformatics， expression analysis
荔枝（Litchi chinensis）是岭南名贵水果，有“岭南果王”之美誉。糖与果实产量和质量密切相关，在果实生成发育成熟过程中起关键作用。荔枝为糖直接积累型果实，果实中主要糖组分有蔗糖、葡萄糖和果糖，这三种糖中果糖甜度最高，其甜度约是葡萄糖的3倍，蔗糖的1.8倍，因此它们的含量及比例与果实的甜度和风味密切相关，因此，研究果实糖组分形成特点有助于提高果实内在品质。荔枝果肉含糖量高，而且品种间存在一定差异，‘糯米糍’果肉含糖量占鲜重的15.3%或干重的91.3%，‘妃子笑’则占鲜重的14.6%或干重的78.7%（陈杰忠，2011）。
荔枝不同品种的糖分构成不同，实质是不同酶系统调控的结果，而酶系统及其活性与基因表达相关。不同荔枝品种积累的主要糖分不同，如‘妃子笑’和‘黑叶’以积累还原糖为主，‘无核荔’和‘糯米糍’以积累蔗糖为主，这些糖组分受蔗糖代谢相关酶活性的调控（王惠聪等， 2003; 杨转英等， 2012）。研究结果表明，转化酶是分解蔗糖成为还原糖和果糖的关键酶之一，以积累蔗糖为主的‘糯米糍’在果实成熟过程中几乎检测不到酸性转化酶活性，而以积累还原糖为主的‘妃子笑’则保持了高的酸性转化酶活性，说明酸性转化酶活性可能与荔枝糖的积累类型密切相关（Yang et al.， 2013），因此研究酸性转化酶在调控荔枝果实糖积累中的作用机制具有重要的意义。
Sturm & Chrispeels （1990）首次从胡萝卜中克隆到酸性转化酶基因，随着高通量测序技术及生物信息学的飞速发展，目前已从番茄（孙威等，2009）、甘蔗（牛俊奇等，2013）、番木瓜（严丹凤等，2014）、柑橘（安新民等，2001）、苹果（安新民等，2003）、枸杞（王丽娟等，2014）、石斛（孟衡玲等，2017）等植物中分离出酸性转化酶基因。然而目前关于荔枝酸性转化酶系统分析尚未见报道，基于课题组‘妃子笑’果实不同发育阶段果肉转录组数据库（未发表），检索到酸性转化酶基因（Unigene0007246），该基因含有完整的ORF，NCBI Blast比对结果表明该基因与Yang et al.（2013）从‘糯米糍’假种皮中克隆的荔枝酸性转化酶基因 AFP23357.1同源性为97.98%，存在13个单核苷酸差异，命名为LcSAI。为了全面了解酸性转化酶的生物学特征，本研究利用生物信息学及qRT-PCR技术探究荔枝果实酸性转化酶LcSAI基因的基本理化性质、亚细胞定、蛋白二级结构、亲疏水性、信号肽、跨膜结构、系统进化及在不同组织及果实不同发育阶段表达情况进行系统的分析，旨在为下一步对LcSAI功能研究及其应用提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为‘妃子笑’荔枝，采自中国热带农业科学院南亚热带作物研究所荔枝种植园。‘妃子笑’果实酸性转化酶基因LcSAI（Unigene0007246）通过课题组‘妃子笑’果实不同发育阶段果肉转录组数据库搜索查询Unigene0007246全长为2 226 bp，CDS全长为1 929 bp，编码643 aa。
1.2 荔枝酸性转化酶LcSAI生物信息学分析
LcSAI的基本理化性質通过在线软件ExPASY ProtParam tool （https：//web.expasy.org/protparam/）预测分析;LcSAI的亚细胞定位通过在线工具Plant-mPLoc （http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Plant-multi/）分析;LcSAI蛋白的二级结构预测通过在线工具SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？pa ge=npsa_sopma.html）进行;LcSAI蛋白的亲疏水性通过在线软件ExPASY ProtScale （https：//web.expasy.org/protscale/）分析;LcSAI蛋白信号肽预测通过在线工具SignaIP 4.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析;LcSAI蛋白的跨膜结构通过在线软件TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析;LcSAI蛋白的磷酸化位点采用在线软件NetPhos （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析;LcSAI蛋白的保守结构域利用在线工具NCBI CONSERVED Domain Architecture Retrieval Tool （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/lexington/lexington.cgi？cmd=rps）分析，通过NCBI blast比较荔枝酸性转化酶LcSAI序列的同源性，进一步利用Clustalx 1.83 软件对候选序列进行多重序列比对后采用MEGA6.0 软件Neighbor-Joining法构建系统进化树，分析与其他物种的亲缘关系。
1.3 荔枝酸性转化酶LcSAI不同组织和果实发育阶段表达分析
采集‘妃子笑’不同组织样品，采集新抽梢的幼叶、老熟梢的成熟老叶、花期雄蕊、雌蕊、幼根、成熟果的果皮、果肉和种子;果实不同发育阶段表达分析采集果肉开始时间为2019年4月11日（1周），每周取样，直到果实成熟2019年5月30日（8周），共8周;经液氮速冻后置-80 ℃冰箱保存备用。不同组织RNA提取使用华越洋植物RNA提取试剂盒，利用M-MLV 逆转录酶（TaKaRa 公司）合成cDNA 第一链。LcSAI荧光定量引物序列为LcSAI qFW 5′-TCAGCAGGTGAGGAAGAAGG-3′，LcSAI qRE 5′-TCAGGAGCCAATGTTGACCT-3′;LcActinFW 5′-GTGGTTCTACTATGTTCCCTG，LcActin- RE 5′-CTCGTCGTACTCATCCTTTG，引物序列委托广州艾基生物技术有限公司合成。使用仪器Roche 480 Ⅱ，SYBR Premix Ex TaqTM （ TaKaRa） 试剂盒，采用96孔板，qRT-PCR反应体系为20 μL，PCR 产物的长度为200 bp。荧光定量PCR 的反应程序如下：94 ℃ 预变性 2 min; 94 ℃ 15 s， 58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 共40个循环。每个样品进行 3 次重复。 采用2 -ΔΔCT 法计算目标基因相对表达量。
2 结果与分析
2.1 LcSAI蛋白基本理化性质和二级结构分析
通过ExPASY预测LcSAI的基本理化性质，LcSAI编码643个氨基酸，蛋白的分子量为72 005.18，分子方程式为C3270H4944N850O962S14，理论等电点为5.18，半衰期为30 h，不稳定指数为39.30，为稳定蛋白，脂肪指数为83.69，亲水性的平均值为-0.262，为亲水蛋白。LcSAI蛋白的氨基酸组成中亮氨酸（Leu）含量最高，为9.2%;而半胱氨酸（Cys）含量最低，为0.5%。从整个氨基酸带电荷情况来看，带负电荷氨基酸残基（Asp+Glu）总数为71个，带正电荷氨基酸残基（Arg+Lys）总数为47个（图1）。Plant-mPLoc预测亚细胞定位LcSAI定位于液泡。LcSAI 蛋白质二级结构由α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲和延伸链组成（图2），其中，无规则卷曲比例最高（359 aa， 55.83%），其次为延伸链（152 aa， 23.64%）、α-螺旋（94 aa， 14.62%），β-折叠比例最低（38 aa，5.91%）。
通过在线软件ProtScale对LcSAI进行亲水/疏水性分析（算法： Kyte & Doolittle， 其中，>0表示疏水性， 数值越大蛋白疏水性越强; <0表示亲水性， 数值越大蛋白亲水性越强）。整体分析结果表明，LcSAI蛋白存在明显的疏水区和亲水区，虽然蛋白多肽链的第43位、第44位氨基酸得分（3.156）比第395位的最低值（-2.689）要高，但是，亲水性氨基酸数目（392个）比疏水性氨基酸要多（243个），结果与一级结构预测一致，为亲水性蛋白。
2.2 LcSAI蛋白信号肽预测和跨膜结构分析
信号肽大多位于氨基酸序列的N端的短肽链，一般长度为5～30个氨基酸。利用在线分析工具SignaIP 4.1 Server的euk network算法对 LcSAI蛋白是否含有信号肽进行预测（图3），显示LcSAI 蛋白没有信号肽，属于非分泌蛋白，由此推测LcSAI蛋白在细胞质中合成，没有蛋白转运功能。
跨膜区即蛋白质序列中跨越细胞膜的区域，通常为α-螺旋结构，约20～25个氨基酸残基，构成跨膜区蛋白的氨基酸大部分是疏水性氨基酸。利用TMHMM在线软件对LcSAI蛋白进行跨膜结构分析，结果表明，LcSAI在43～63氨基酸范围产生1个跨膜区（图4）。
2.3 LcSAI蛋白磷酸化位点和保守结构域分析
利用NetPhos 3.1 Server 在线软件分析LcSAI磷酸化位点，结果如图5所示。可能的蛋白激酶磷酸化位点中有30个丝氨酸（Ser）、26个苏氨酸（Thr）、10个酪氨酸（Tyr）。
利用NCBI CONSERVED Domain Architecture Retrieval Tool 工具对LcSAI的保守结构域进行分析（图6），结果表明该蛋白包含两个保守结构域，位于N-端的Pfam DUF3357结构域（13～117）和Glyco_32结构域（125～593），属于糖基水解酶基因家族32超家族。
2.4 LcSAI系统进化关系分析
通过NCBI blast比对分析发现，‘妃子笑’LcSAI与龙眼（AKJ70978）、漆树（AHB33921）、柑橘（XP_024046763）、巴西橡胶树（XP_021687094）、木薯（AFH77956）、桃（XP_007218854）、可可（XP_017972919）、苹果（AFU56882）、沙梨（BAG30919）、葡萄（XP_002265534）SAI氨基酸序列的同源性分别为95.18%、79.53%、77.81%、77.8%、77.48%、70.85%、75.43%、69.94%、70.35%、65.2%。将‘妃子笑’与以上10 个物种进行氨基酸序列多重比对，结果表明‘妃子笑’LcSAI 与其它物种SAI 蛋白有高度的保守性，其中，5′N端Pfam DUF3357 结构域（13～117）保守性较低，不同物种间保守的Glyco_32 结构域（125～593）也存在一定的差异。将以上不同物种的SAI蛋白利用MEGA 6.0 软件构建系统进化树分析，LcSAI与同为无患子科的龙眼SAI亲缘关系最近，为直系同源基因（图7）。苹果、梨、桃同為蔷薇科的SAI进化聚类在一起，亲缘关系较近;同为大戟科的木薯和巴西橡胶树SAI亲缘关系较近。
2.5 LcSAI 在不同组织部位及果实不同发育阶段表达分析
利用qRT-PCR技术对LcSAI在‘妃子笑’不同组织部位及果实不同发育阶段进行相对表达分析。结果表明：‘妃子笑’中雄花中的表达量最高，其次是根、嫩茎、嫩叶、种子，雌花、果皮、老叶中表达量相对较低（图8）;果实不同发育阶段果肉中LcSAI的表达量在第2周达到峰值，随后LcSAI的表达量在第3周急剧下降，在第4、5、6周表达量逐渐升高，在果实发育的第8周LcSAI的表达量降至最低（图9）。
3 讨论与结论
酸性转化酶为多基因编码蛋白，在调控液泡的库活力、渗透压、糖信号、蔗糖积累、蔗糖浓度、对外界胁迫、激素和细胞伸长等发挥作用（Lu et al.， 2017; Chikov et al.， 2015; Zhang et al.， 2014; Kulshrestha et al.， 2013）。前人借助生物信息学手段对枸杞（雷建武等， 2014;王丽娟等，2014）、番木瓜（严丹凤等， 2014）、甘蔗（牛俊奇等，2013）石斛（孟衡玲等，2017）的酸性性转化酶基因进行了系统的生物信息学和表达分析。本研究利用生物信息学手段对已克隆荔枝果实酸性转化酶的基本理化性质、亚细胞定位、跨膜结构、信号肽、磷酸化位点、系统进化等进行预测分析，该基因为亲水性蛋白、包含一个跨膜结构、不含信号肽，结果与对甘蔗（牛俊奇等， 2014）、枸杞（雷建武等， 2014）、番木瓜（严丹凤等， 2014）的研究一致。LcSAI蛋白包含两个保守结构域，位于N-端的Pfam DUF3357结构域（13～117）和Glyco_32结构域（125～593），属于糖基水解酶基因家族32超家族，LcSAI编码氨基酸与龙眼、柑橘等序列相似性很高，相似性范围在85%～95%，NJ 法聚类结果显示，荔枝SAI与龙眼酸性转化酶为直系同源基因，而与其他植物苹果、梨、桃、葡萄亲缘关系较远。 虽然酸性转化酶基因在植物不同发育阶段以及不同组织中呈组成型表达，但其不同组织间存在表达量的差异，例如枸杞LbSAI在各组织中表达量水平为花>果柄>果实>茎>叶>根（王丽娟等，2014）;铁皮石斛中不同发育阶段不同组织的SAI表达量差异较大，叶片中SAI表达量逐年下降，而根中SAI表达量则逐年上升，茎中SAI的表达量在第二年达到峰值（孟衡玲等，2017）;甘蔗SoSAI1在伸长期至生理成熟前期，未成熟的幼叶和成熟叶的表达量高于老叶，而茎在4 个发育时期总体上表现为幼茎>成熟茎>老茎 （牛俊奇等， 2014）。本研究表明LcSAI在不同组织中均有表达，而表达量存在差异，具有组织特异性，其中，在雄花、根、种子、嫩茎、嫩叶中表达量较高，在雌花、老叶、果皮中表达量最低;LcSAI的表达在果实不同发育阶段具有特异性。该结果与甘蔗中研究结果相似，幼嫩的组织LcSAI表达量较高，酸性转化酶主要在快速生长的幼嫩组织和器官中酶活性高呈正相关相一致（牛俊奇等， 2014）。本研究基于转录组数据对‘妃子笑’LcSAI进行了系统的生物信息学和表达分析，为今后深入研究荔枝SAI基因功能及糖积累机制奠定基础。
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（责任编辑 李 莉）
关键词： 荔枝， 酸性转化酶， 生物信息学， 表达分析
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文章编号： 1000-3142（2021）06-0989-08
收稿日期： 2020-01-19
基金项目： 国家重点研发计划（2019YFD1000900）;中央级公益性科研院所基本科研业务专项（1630062021010）;国家荔枝龙眼产业技术体系（CARS-32-20）;广东省自然科学基金（2018A030307012）[Supported by the National Key R & D Program of China （2019YFD1000900）; Special Program of Central Public Research Institutes for Basic Research （1630062021010）; China Litchi and Longan Industry Technology Research System （CARS-32-20）; Natural Science Foundation of Guangdong Province （2018A030307012]。
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Bioinformatics and expression analysis of acid invertase LcSAI of Litchi chinesis
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（ Institute of South Subtropical Corp Research， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science， Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture， Zhanjiang 524091， Guangdong， China ）
Abstract： As a key enzyme in sucrose metabolism， acid invertase expression and enzyme activity was significantly higher in reducing sugar accumulation litchi than in sucrose accumulation litchi. In order to fully understand the biological characteristics of acid invertase， we systematically analyzed the basic physical and chemical properties， protein secondary structure， hydrophilic/hydrophobic， transmememal domain， signal peptide， phosphorylation site， conserved domain and phylogenetic evolution of LcSAI by bioinformatics， and analyzed the expression of LcSAI in different tissues and fruits at different developmental stages of Litchi chinesis ‘Feizixiao’ by using qRT-PCR. The results were as follows： （1） The acid invertase of litchi fruit was a hydrophilic unstable protein localized to vacuole， and there was no signal peptide. The secondary structure of the protein mainly consisted of irregularly coiled and extended chain members， which were scattered throughout the protein. （2） LcSAI contained a transmembrane region at the N-terminus， including two conserved domains， the N-terminal Pfam DUF3357 domain and the Glyco_32 domain， belonging to the glycosyl hydrolase gene family 32 superfamily. Phylogenetic evolution indicated LcSAI homology with the longan acid invertase gene， the LcSAI expression levels were male flower > root > young stem > seed > young leaf > female flower > peel >mature leaf; the expression of LcSAI in different stages of fruit development was specific， LcSAI expression reached a peak in the second week， then LcSAI expression dropped sharply in the third week， gradually increased in the fourth and fifth weeks， and decreased to a minimum in the eighth week of fruit development. This study provides a theoretical reference for further study of the mechanism of LcSAI fruit acid invertase gene regulation of sucrose metabolism pathway. Key words： Litchi chinensis， acid invertase， bioinformatics， expression analysis
荔枝（Litchi chinensis）是岭南名贵水果，有“岭南果王”之美誉。糖与果实产量和质量密切相关，在果实生成发育成熟过程中起关键作用。荔枝为糖直接积累型果实，果实中主要糖组分有蔗糖、葡萄糖和果糖，这三种糖中果糖甜度最高，其甜度约是葡萄糖的3倍，蔗糖的1.8倍，因此它们的含量及比例与果实的甜度和风味密切相关，因此，研究果实糖组分形成特点有助于提高果实内在品质。荔枝果肉含糖量高，而且品种间存在一定差异，‘糯米糍’果肉含糖量占鲜重的15.3%或干重的91.3%，‘妃子笑’则占鲜重的14.6%或干重的78.7%（陈杰忠，2011）。
荔枝不同品种的糖分构成不同，实质是不同酶系统调控的结果，而酶系统及其活性与基因表达相关。不同荔枝品种积累的主要糖分不同，如‘妃子笑’和‘黑叶’以积累还原糖为主，‘无核荔’和‘糯米糍’以积累蔗糖为主，这些糖组分受蔗糖代谢相关酶活性的调控（王惠聪等， 2003; 杨转英等， 2012）。研究结果表明，转化酶是分解蔗糖成为还原糖和果糖的关键酶之一，以积累蔗糖为主的‘糯米糍’在果实成熟过程中几乎检测不到酸性转化酶活性，而以积累还原糖为主的‘妃子笑’则保持了高的酸性转化酶活性，说明酸性转化酶活性可能与荔枝糖的积累类型密切相关（Yang et al.， 2013），因此研究酸性转化酶在调控荔枝果实糖积累中的作用机制具有重要的意义。
Sturm & Chrispeels （1990）首次从胡萝卜中克隆到酸性转化酶基因，随着高通量测序技术及生物信息学的飞速发展，目前已从番茄（孙威等，2009）、甘蔗（牛俊奇等，2013）、番木瓜（严丹凤等，2014）、柑橘（安新民等，2001）、苹果（安新民等，2003）、枸杞（王丽娟等，2014）、石斛（孟衡玲等，2017）等植物中分离出酸性转化酶基因。然而目前关于荔枝酸性转化酶系统分析尚未见报道，基于课题组‘妃子笑’果实不同发育阶段果肉转录组数据库（未发表），检索到酸性转化酶基因（Unigene0007246），该基因含有完整的ORF，NCBI Blast比对结果表明该基因与Yang et al.（2013）从‘糯米糍’假种皮中克隆的荔枝酸性转化酶基因 AFP23357.1同源性为97.98%，存在13个单核苷酸差异，命名为LcSAI。为了全面了解酸性转化酶的生物学特征，本研究利用生物信息学及qRT-PCR技术探究荔枝果实酸性转化酶LcSAI基因的基本理化性质、亚细胞定、蛋白二级结构、亲疏水性、信号肽、跨膜结构、系统进化及在不同组织及果实不同发育阶段表达情况进行系统的分析，旨在为下一步对LcSAI功能研究及其应用提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为‘妃子笑’荔枝，采自中国热带农业科学院南亚热带作物研究所荔枝种植园。‘妃子笑’果实酸性转化酶基因LcSAI（Unigene0007246）通过课题组‘妃子笑’果实不同发育阶段果肉转录组数据库搜索查询Unigene0007246全长为2 226 bp，CDS全长为1 929 bp，编码643 aa。
1.2 荔枝酸性转化酶LcSAI生物信息学分析
LcSAI的基本理化性質通过在线软件ExPASY ProtParam tool （https：//web.expasy.org/protparam/）预测分析;LcSAI的亚细胞定位通过在线工具Plant-mPLoc （http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Plant-multi/）分析;LcSAI蛋白的二级结构预测通过在线工具SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？pa ge=npsa_sopma.html）进行;LcSAI蛋白的亲疏水性通过在线软件ExPASY ProtScale （https：//web.expasy.org/protscale/）分析;LcSAI蛋白信号肽预测通过在线工具SignaIP 4.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析;LcSAI蛋白的跨膜结构通过在线软件TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析;LcSAI蛋白的磷酸化位点采用在线软件NetPhos （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析;LcSAI蛋白的保守结构域利用在线工具NCBI CONSERVED Domain Architecture Retrieval Tool （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/lexington/lexington.cgi？cmd=rps）分析，通过NCBI blast比较荔枝酸性转化酶LcSAI序列的同源性，进一步利用Clustalx 1.83 软件对候选序列进行多重序列比对后采用MEGA6.0 软件Neighbor-Joining法构建系统进化树，分析与其他物种的亲缘关系。
1.3 荔枝酸性转化酶LcSAI不同组织和果实发育阶段表达分析
采集‘妃子笑’不同组织样品，采集新抽梢的幼叶、老熟梢的成熟老叶、花期雄蕊、雌蕊、幼根、成熟果的果皮、果肉和种子;果实不同发育阶段表达分析采集果肉开始时间为2019年4月11日（1周），每周取样，直到果实成熟2019年5月30日（8周），共8周;经液氮速冻后置-80 ℃冰箱保存备用。不同组织RNA提取使用华越洋植物RNA提取试剂盒，利用M-MLV 逆转录酶（TaKaRa 公司）合成cDNA 第一链。LcSAI荧光定量引物序列为LcSAI qFW 5′-TCAGCAGGTGAGGAAGAAGG-3′，LcSAI qRE 5′-TCAGGAGCCAATGTTGACCT-3′;LcActinFW 5′-GTGGTTCTACTATGTTCCCTG，LcActin- RE 5′-CTCGTCGTACTCATCCTTTG，引物序列委托广州艾基生物技术有限公司合成。使用仪器Roche 480 Ⅱ，SYBR Premix Ex TaqTM （ TaKaRa） 试剂盒，采用96孔板，qRT-PCR反应体系为20 μL，PCR 产物的长度为200 bp。荧光定量PCR 的反应程序如下：94 ℃ 预变性 2 min; 94 ℃ 15 s， 58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 共40个循环。每个样品进行 3 次重复。 采用2 -ΔΔCT 法计算目标基因相对表达量。
2 结果与分析
2.1 LcSAI蛋白基本理化性质和二级结构分析
通过ExPASY预测LcSAI的基本理化性质，LcSAI编码643个氨基酸，蛋白的分子量为72 005.18，分子方程式为C3270H4944N850O962S14，理论等电点为5.18，半衰期为30 h，不稳定指数为39.30，为稳定蛋白，脂肪指数为83.69，亲水性的平均值为-0.262，为亲水蛋白。LcSAI蛋白的氨基酸组成中亮氨酸（Leu）含量最高，为9.2%;而半胱氨酸（Cys）含量最低，为0.5%。从整个氨基酸带电荷情况来看，带负电荷氨基酸残基（Asp+Glu）总数为71个，带正电荷氨基酸残基（Arg+Lys）总数为47个（图1）。Plant-mPLoc预测亚细胞定位LcSAI定位于液泡。LcSAI 蛋白质二级结构由α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲和延伸链组成（图2），其中，无规则卷曲比例最高（359 aa， 55.83%），其次为延伸链（152 aa， 23.64%）、α-螺旋（94 aa， 14.62%），β-折叠比例最低（38 aa，5.91%）。
通过在线软件ProtScale对LcSAI进行亲水/疏水性分析（算法： Kyte & Doolittle， 其中，>0表示疏水性， 数值越大蛋白疏水性越强; <0表示亲水性， 数值越大蛋白亲水性越强）。整体分析结果表明，LcSAI蛋白存在明显的疏水区和亲水区，虽然蛋白多肽链的第43位、第44位氨基酸得分（3.156）比第395位的最低值（-2.689）要高，但是，亲水性氨基酸数目（392个）比疏水性氨基酸要多（243个），结果与一级结构预测一致，为亲水性蛋白。
2.2 LcSAI蛋白信号肽预测和跨膜结构分析
信号肽大多位于氨基酸序列的N端的短肽链，一般长度为5～30个氨基酸。利用在线分析工具SignaIP 4.1 Server的euk network算法对 LcSAI蛋白是否含有信号肽进行预测（图3），显示LcSAI 蛋白没有信号肽，属于非分泌蛋白，由此推测LcSAI蛋白在细胞质中合成，没有蛋白转运功能。
跨膜区即蛋白质序列中跨越细胞膜的区域，通常为α-螺旋结构，约20～25个氨基酸残基，构成跨膜区蛋白的氨基酸大部分是疏水性氨基酸。利用TMHMM在线软件对LcSAI蛋白进行跨膜结构分析，结果表明，LcSAI在43～63氨基酸范围产生1个跨膜区（图4）。
2.3 LcSAI蛋白磷酸化位点和保守结构域分析
利用NetPhos 3.1 Server 在线软件分析LcSAI磷酸化位点，结果如图5所示。可能的蛋白激酶磷酸化位点中有30个丝氨酸（Ser）、26个苏氨酸（Thr）、10个酪氨酸（Tyr）。
利用NCBI CONSERVED Domain Architecture Retrieval Tool 工具对LcSAI的保守结构域进行分析（图6），结果表明该蛋白包含两个保守结构域，位于N-端的Pfam DUF3357结构域（13～117）和Glyco_32结构域（125～593），属于糖基水解酶基因家族32超家族。
2.4 LcSAI系统进化关系分析
通过NCBI blast比对分析发现，‘妃子笑’LcSAI与龙眼（AKJ70978）、漆树（AHB33921）、柑橘（XP_024046763）、巴西橡胶树（XP_021687094）、木薯（AFH77956）、桃（XP_007218854）、可可（XP_017972919）、苹果（AFU56882）、沙梨（BAG30919）、葡萄（XP_002265534）SAI氨基酸序列的同源性分别为95.18%、79.53%、77.81%、77.8%、77.48%、70.85%、75.43%、69.94%、70.35%、65.2%。将‘妃子笑’与以上10 个物种进行氨基酸序列多重比对，结果表明‘妃子笑’LcSAI 与其它物种SAI 蛋白有高度的保守性，其中，5′N端Pfam DUF3357 结构域（13～117）保守性较低，不同物种间保守的Glyco_32 结构域（125～593）也存在一定的差异。将以上不同物种的SAI蛋白利用MEGA 6.0 软件构建系统进化树分析，LcSAI与同为无患子科的龙眼SAI亲缘关系最近，为直系同源基因（图7）。苹果、梨、桃同為蔷薇科的SAI进化聚类在一起，亲缘关系较近;同为大戟科的木薯和巴西橡胶树SAI亲缘关系较近。
2.5 LcSAI 在不同组织部位及果实不同发育阶段表达分析
利用qRT-PCR技术对LcSAI在‘妃子笑’不同组织部位及果实不同发育阶段进行相对表达分析。结果表明：‘妃子笑’中雄花中的表达量最高，其次是根、嫩茎、嫩叶、种子，雌花、果皮、老叶中表达量相对较低（图8）;果实不同发育阶段果肉中LcSAI的表达量在第2周达到峰值，随后LcSAI的表达量在第3周急剧下降，在第4、5、6周表达量逐渐升高，在果实发育的第8周LcSAI的表达量降至最低（图9）。
3 讨论与结论
酸性转化酶为多基因编码蛋白，在调控液泡的库活力、渗透压、糖信号、蔗糖积累、蔗糖浓度、对外界胁迫、激素和细胞伸长等发挥作用（Lu et al.， 2017; Chikov et al.， 2015; Zhang et al.， 2014; Kulshrestha et al.， 2013）。前人借助生物信息学手段对枸杞（雷建武等， 2014;王丽娟等，2014）、番木瓜（严丹凤等， 2014）、甘蔗（牛俊奇等，2013）石斛（孟衡玲等，2017）的酸性性转化酶基因进行了系统的生物信息学和表达分析。本研究利用生物信息学手段对已克隆荔枝果实酸性转化酶的基本理化性质、亚细胞定位、跨膜结构、信号肽、磷酸化位点、系统进化等进行预测分析，该基因为亲水性蛋白、包含一个跨膜结构、不含信号肽，结果与对甘蔗（牛俊奇等， 2014）、枸杞（雷建武等， 2014）、番木瓜（严丹凤等， 2014）的研究一致。LcSAI蛋白包含两个保守结构域，位于N-端的Pfam DUF3357结构域（13～117）和Glyco_32结构域（125～593），属于糖基水解酶基因家族32超家族，LcSAI编码氨基酸与龙眼、柑橘等序列相似性很高，相似性范围在85%～95%，NJ 法聚类结果显示，荔枝SAI与龙眼酸性转化酶为直系同源基因，而与其他植物苹果、梨、桃、葡萄亲缘关系较远。 虽然酸性转化酶基因在植物不同发育阶段以及不同组织中呈组成型表达，但其不同组织间存在表达量的差异，例如枸杞LbSAI在各组织中表达量水平为花>果柄>果实>茎>叶>根（王丽娟等，2014）;铁皮石斛中不同发育阶段不同组织的SAI表达量差异较大，叶片中SAI表达量逐年下降，而根中SAI表达量则逐年上升，茎中SAI的表达量在第二年达到峰值（孟衡玲等，2017）;甘蔗SoSAI1在伸长期至生理成熟前期，未成熟的幼叶和成熟叶的表达量高于老叶，而茎在4 个发育时期总体上表现为幼茎>成熟茎>老茎 （牛俊奇等， 2014）。本研究表明LcSAI在不同组织中均有表达，而表达量存在差异，具有组织特异性，其中，在雄花、根、种子、嫩茎、嫩叶中表达量较高，在雌花、老叶、果皮中表达量最低;LcSAI的表达在果实不同发育阶段具有特异性。该结果与甘蔗中研究结果相似，幼嫩的组织LcSAI表达量较高，酸性转化酶主要在快速生长的幼嫩组织和器官中酶活性高呈正相关相一致（牛俊奇等， 2014）。本研究基于转录组数据对‘妃子笑’LcSAI进行了系统的生物信息学和表达分析，为今后深入研究荔枝SAI基因功能及糖积累机制奠定基础。
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（责任编辑 李 莉）