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摘要：【目的】克隆羽衣甘蓝蛋白激酶C1受体（RACK1）基因（BoRACK1）序列，并对其进行亚细胞定位及表达分析，为研究RACK1基因在植物生长发育过程中的调控机制提供理论参考。【方法】PCR扩增BoRACK1基因，构建其亚细胞定位表达载体，通过基因枪法转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微鏡下观察绿色荧光蛋白（GEP）的分布情况。利用荧光定量PCR（qRT-PCR）检测BoRACK1基因在不同组织中及在非生物胁迫（200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和1 mmol/L H2O2溶液）下幼苗中的表达情况。【结果】PCR扩增获得BoRACK1基因的开放阅读框（ORF）序列，其cDNA全长980 bp，编码326个氨基酸，氨基酸序列与其他植物的RACK1具有较高同源性，在65%以上，尤其与拟南芥的同源性高达93%。BoRACK1基因在羽衣甘蓝的根、茎、叶、花和种子中均有表达，其中在根、叶和种子中的表达量较高，而在花、幼芽和茎的表达量较少。BoRACK1基因在ABA、H2O2和NaCl胁迫下的表达量整体上呈下调趋势，其中NaCl胁迫下其表达量在6 h时降至最低，而其他胁迫下其表达量均在4 h时降至最低。BoRACK1定位于细胞质、细胞核和细胞质膜。【结论】BoRACK1基因表达无组织特异性，除了与羽衣甘蓝花、果实及营养器官的发育存在关联外，还可能参与了植物的抗逆性调控过程。
关键词： 蛋白激酶C1受体（RACK1）；羽衣甘蓝；亚细胞定位；荧光定量PCR（qRT-PCR）
中图分类号： S681.903.6 文献标Cloning， subcellular localization and expression analysis
of gene BoRACK1 in Brassica oleracea
PANG Ke-qin1， LIU Hong-wei2， ZHEN Ping-ping3， GUO Jun-jie4，
LI Wei4， LI Da-hong4， LI Hong-yan4*
（1Garden Center， Huanghuai University， Zhumadian， Henan 463000， China； 2Green Department of Zhumadian，Zhumadian， Henan 463000， China； 3Agricultural and Forestry Bureau of Linyi County，Shandong Province， Linyi， Shandong 276000， China； 4 School of Biotechnology and Food Engineering， Huanghuai University，
Zhumadian， Henan 463000， China）
Abstract：【Objective】Gene（BoRACK1） sequence of tyrosine kinase receptorC1（RACK1） from Brassica oleracea was cloned； subcellular localization and expression analysis were also conducted， in order to provide theoretical basis for research on the regulation mechanism of gene RACK1 in the process of plant growth and development. 【Method】Gene BoRACK1 was amplified by PCR and expression vector of subcellular localization was constructed.Onion epidermal cells were transformed by the particle bombardment method. The distribution of green fluorescent protein（GEP） was observed under a laser scanning confocal microscope. The fluorescent quantitative PCR（qRT-PCR） method was used to detect the expression of gene BoRACK1 in different tissues and seedlings under abiotic stress（200 mmol/L NaCl， 100 μmol/L ABA and 1 mmol/L H2O2 solution）. 【Result】The open reading frame（ORF） sequence of gene BoRACK1 was acquired by PCR amplification. cDNA was 980 bp in length，encoding 326 amino acids. Amino acid sequence hadhigh homology with the RACK1 of other plants， which was over 65%. In particular， the homology with Arabidopsis thaliana reached 93%. Gene BoRACK1 expressed in roots， stems， leaves， flowers and seeds of B.oleracea. The expressions in roots， leaves and seeds were high while those in flowers， seedlings and stems were low. The overall expression of gene BoRACK1 was down-re-gulated under abiotic stress of ABA， H2O2 and NaCl. The expression level reached the lowest point at 6 h under NaCl stress，and the expression level reached the lowest point at 4 h under other stresses. BoRACK1 was localized in the cytoplasm， cell nuclear and plasma membrane. 【Conclusion】The expression of gene BoRACK1 has no tissue specificity. The gene has different degrees of correlations with development of flowers， fruits and vegetative organof B.oleracea； and the gene may also be involved in the regulation process of plant stress resistance. Key words：tyrosine kinase receptorC1（RACK1）；Brassica oleracea；subcellular localization；fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）志碼：A 文章编号：2095-1191（2018）04-0635-08
0 引言
【研究意义】蛋白激酶C1受体（RACK1）是一种含有7个β-螺旋桨结构的多功能支架蛋白，广泛存在于真核细胞中，属于WD（色氨酸和天冬氨酸）重复蛋白家族成员（McCahill et al.，2002），参与多个信号转导通路和不同信号分子调节过程，如cAMP信号转导、mRNA翻译调控、细胞骨架重构和蛋白质降解等（Ullah et al.，2008；Guo et al.，2009；Komatsu et al.，2014）。因此，开展RACK1基因克隆、亚细胞定位及表达分析，对研究RACK1基因在植物生长发育过程中的生物学功能和作用机理具有重要意义。【前人研究进展】目前有关RACK1基因的研究报道较多。McCahill等（2002）研究发现，蛇、鸡和人类等体内仅含一个单一的RACK1基因。Chen等（2006）研究发现，拟南芥基因组包含3个RACK1基因，水稻基因组中有2个RACK1基因。Nakashima等（2008）研究认为，水稻RACK1与其他蛋白相互作用形成复合体共同参与植株对稻瘟病菌的响应，其响应机理是水稻感染稻瘟病后RACK1基因过表达导致其体内活性氧（ROS）含量和病程相关基因（PR）表达量增加，从而缓解稻瘟病症状。Guo等（2009）研究发现，RACK1基因参与植物的生物和非生物胁迫。Li等（2009，2018）、李大红等（2014）分别利用RNA干扰（RNAi）技术抑制水稻和大豆的RACK1基因表达，结果发现，二者的转基因植株抗旱能力均显著高于野生型。Wang等（2014）采用PCR对玉米RACK1基因（ZmRACK1）进行扩增，结果发现ZmRACK1基因过表达可缓解玉米叶片大斑病症状。Zhang等（2014）研究表明，水稻RACK1基因通过调节内源H2O2含量参与其种子萌发。Nielsen等（2017）研究发现，RACK1蛋白氨基酸序列高度保守，可特异性与核糖体紧密结合，表明RACK1是一个完整的核糖体蛋白。Schmitt等（2017）研究认为，Asc1p/RACK1是一个与核糖体40S亚基相互作用的关键因子，RACK1可能是在核糖体翻译后加工过程中发挥蛋白磷酸化信号转导的作用。【本研究切入点】羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala f.tricolor）是十字花科芸薹属的观赏植物，叶片形态美观多变，色彩绚丽如花，但至今鲜见羽衣甘蓝RACK1基因（BoRACK1）克隆、亚细胞定位及表达分析的研究报道。【拟解决的关键问题】克隆BoRACK1基因，采用荧光定量PCR（qRT-PCR）检测其在羽衣甘蓝不同组织及非生物胁迫下幼苗中的表达情况，并对其编码蛋白进行亚细胞定位，为研究RACK1基因在植物生长发育过程中的生物学功能和作用机理提供参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
羽衣甘蓝由河南省驻马店市园林绿化科研所提供，种植于黄淮学院南区温室内。大肠杆菌DH5α感受态细胞和洋葱瞬时表达载体pCAMBIA1301由黄淮学院园林中心实验室保存提供，pMD18-T载体、DNA聚合酶I、RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、限制性内切酶、PCR试剂盒和随机引物试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，DNA快速纯化回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，SYBR Green Supermix Ex Taq（ABI）试剂盒购自美国Bio-Rad公司，抗生素、植物生长调节剂等购自美国Sigma公司，其他试剂采用进口或国产分析纯。主要仪器设备：ABI7500实时定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）、PDS-1000台式基因枪（美国Bio-Rad公司）和激光共聚焦显微镜（德国ZEISS公司）。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 样品处理及采集 羽衣甘蓝种子萌发后30 d移栽大棚，浇灌Hoagland’s营养液；10 d后采集其根和叶。植株抽苔时采集茎和幼芽，初花期采集整花，种子成熟后收集种子，用于BoRACK1基因克隆及组织特异性表达分析。另外，将40 d的羽衣甘蓝幼苗分为3组，每组30株，分别置于200 mmol/L NaCl、100 μmol/L脱落酸（ABA）和1 mmol/L H2O2中，于胁迫处理0、2、4、6和8 h后取样（整个植株），立即放入液氮中待冷冻后于-80 ℃保存，用于研究BoRACK1基因对非生物胁迫的响应。
1. 2. 2 总RNA提取 参照RNA提取试剂盒说明提取样品总RNA。利用超微量核酸蛋白分析仪检测总RNA的浓度和纯度，并利用1%甲醛变性胶电泳进行其完整性检测。
1. 2. 3 cDNA合成 以总RNA为模板，利用逆转录试剂盒反转录合成第一链cDNA。参照DNA聚合酶I使用说明合成第二链DNA。
1. 2. 4 引物设计及合成 在NCBI网站上将羽衣甘蓝基因组DNA与拟南芥（Arabidopsis thaliana）RACK1基因（GenBank登录号LOC106317602）进行序列比对，获得同源性达93%的基因序列。并利用Primer Premier 5.0设计其引物（表1），扩增目的片段为980 bp。
1. 2. 5 基因克隆 PCR反应体系50.0 μL：10×PCR Buffer（Mg2+ Plus）5.0 μL，dNTP Mixture 4.0 μL，BoRACK1-F和RACK1-R cDNA各2.0 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O补足至50.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，进行30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。 1. 2. 6 亚细胞定位表达载体构建 利用DNA快速纯化回收试剂盒回收PCR产物中的目的条带，并连接至pMD18-T载体上，热激转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。对测序正确的阳性质粒和含绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的表达载体pCAMBIA1301（pCAMBIA1301-GFP）进行BamH I和Bcl I双酶切。回收目的基因和表达载体，并按照3∶1比例混合，加入T4连接酶于4 ℃连接过夜。最后经酶切和测序验证后获得重组表达载体pCAMBIA1301-BoRACK1-GFP，BoRACK1基因的开放阅读框（ORF）被插入花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子与GFP报告基因之间（图1），用于亚细胞定位。
1. 2. 7 生物信息学分析 测序结果在NCBI的BLAST上进行同源性比对，并利用ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）预测目的基因的ORF，从而推导出氨基酸序列。利用DNAMAN构建系统发育进化树，采用ProtParam在线工具（http：//web.expasy.org/protparam/）预测该序列编码蛋白的基本理化性质，并以Smart（http：//smart. embl-heidilberg.de/）预测其保守结构域。
1. 2. 8 qRT-PCR检测 利用qRT-PCR检测羽衣甘蓝不同组织中及非生物胁迫（200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和1 mmol/L H2O2）下幼苗中的表达情况，以iTaqTM Universal SYBR Green Supermix作为荧光试剂，管家基因Boactin（GenBank登录号AF044573）作为内参基因，其引物序列见表1。每处理3次重复。qRT-PCR反应体系50.0 μL：25.0 μL 2×SYBR Green Premix Ex Taq、10 μmol/L正、反向引物（qBoRACK1-F/qBoRACK1-F）各5.0 μL、5.0 μL cDNA 模板，灭菌蒸馏水补足至50.0 μL。扩增程序：50 ℃ 2 min，95 ℃预变性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，进行40个循环。
1. 2. 9 亚细胞定位 构建的pCAMBIA1301-BoRACK1-GFP利用基因枪轰击洋葱表皮细胞，并通过GFP报告基因在洋葱表皮细胞内的表达情况对BoRACK1基因编码蛋白进行亚细胞定位（Zhang et al.，2016），以空载体pCAMBIA1301-GFP为对照。
2 结果与分析
2. 1 BoRACK1基因扩增结果
如图2所示，PCR扩增获得一条大小约980 bp的清晰条带，与目的基因长度基本相符。测序结果显示，其与羽衣甘蓝基因组中的RACK1基因参考序列相似性达100%，表明成功克隆获得BoRACK1基因。
2. 2 生物信息学分析结果
采用ProtParam预测BoRACK1蛋白的理化性质，结果显示，其分子量为35.6 kD，等电点（pI）为7.03，由326个氨基酸组成。DNAMAN分析结果表明，BoRACK1与拟南芥AtRACK1C、AtRACK1B和AtRACK1A（A. thaliana，Np_188441、Np_175296和Np_173248）的同源性分别达93%、91%和87%，与核桃（Juglans regia L.，xp_018829694.1）、木豆（Cajanus cajan L.，kyp67473.1）、菜豆（Phaseolus vulgaris L.，acj24167.1）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula L.，xp_003631071.1）、蔓花生（Arachis duranensis L.，xp_015966958.1）、大豆（Glycine max L.，q39836）、枣树（Zizyphus jujuba L.，xp_015882908.1）和草莓（Fraga-ria，xp_004299548.1）的同源性均为85%，与雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii L.，xp_012486409.1）和亚洲棉（G. arboreum L.，khg29145.1）的同源性为86%，与水稻OsRACK1A和OsRACK1B（Oryza sativa L.，NP_916988和XP_475866）的同源性分别为86%和66%。利用Smart预测BoRACK1蛋白氨基酸序列的保守结构域，结果显示，其氨基酸序列中有典型的GH（甘氨酸和组氨酸）和WD二肽结构，其中有7个WD重复，7个GH重复，是蛋白激酶C（PKC）保守结构域的内部序列，其数量和位置与大豆、水稻等植物PKC基本一致；BoRACK1蛋白的N端为WH，C端为WG，且第6和第7个GH-WD核心序列间的序列与其他植物RACK1蛋白存在明显差异（图3），表明该蛋白与其他同源蛋白间发生了明显变异。
2. 3 系统发育进化分析结果
利用DNAMAN基于BoRACK1蛋白氨基酸序列与拟南芥（Np_173248、Np_175296和Np_188441）、核桃（xp_018829694.1）、木豆（kyp67473.1）、菜豆（acj24167.1）、蒺藜苜蓿（xp_003631071.1）、蔓花生（xp_015966958.1）、雷蒙德氏棉（xp_012486409.1）、大豆（q39836）、棗树（xp_015882908.1）、草莓（xp_004299548.1）、亚洲棉（khg29145.1）、水稻（NP-916988和XP-475866）等植物的RACK1蛋白氨基酸序列构建系统发育进化树，结果如图4所示。羽衣甘蓝RACK1与同为十字花科的拟南芥和禾本科植物水稻聚在同一分支上，与拟南芥AtRACK1C（NP_188441）蛋白聚于同一亚分支，且拟南芥AtRACK1A（NP_173248）和水稻OsRACK1A（NP_916988）在最近的亚分支，表明羽衣甘蓝与拟南芥亲缘关系最近，其次为水稻，同时证明RACK1在长期生物进化过程中具有较强的保守性，在近缘种中变异很小。 2. 4 BoRACK1基因的组织特异性表达分析结果
利用qRT-PCR检测羽衣甘蓝不同组织中BoRACK1基因的表达情况，结果如图5所示。BoRACK1基因在羽衣甘蓝的根、茎、叶、花、幼芽和种子中均有表达，其中在根、叶和种子中的表达量较高，而在花、幼芽和茎的表达量较少。说明BoRACK1基因在不同组织中的表达量存在一定差异，但无组织特异性。
2. 5 BoRACK1基因在非生物胁迫下的表达情况
分别以200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和1 mmol/L H2O2胁迫处理40 d的羽衣甘蓝幼苗，于处理0、2、4、6和8 h后取样，利用qRT-PCR检测其表达情况，结果如图6所示。100 μmol/L ABA处理0～4 h BoRACK1基因表达量呈显著降低趋势（P<0.05，下同），处理4 h时表达量降至最低，之后又显著上升，最后趋于稳定（图6-A）。200 mmol/L NaCl处理0～6 h BoRACK1基因表达量呈显著降低，处理6 h时表达量降至最低，是处理0 h表达量的35%，随后又显著回升（图6-B）。1 mmol/L H2O2处理0～2 h BoRACK1基因表达量无显著变化（P>0.05，下同），但处理4 h时表达量显著降低至最低，随后表达量无显著变化（图6-C）。由此推测，BoRACK1基因参与非生物胁迫响應。
2. 6 BoRACK1蛋白的亚细胞定位结果
测序结果显示，构建的重组表达载体pGAMBIA1301-BoRACK1-GFP上BoRACK1基因序列与PCR扩增获得序列完全一致，且ORF序列正确，表明表达载体构建成功，可用于亚细胞定位分析。利用基因枪轰击洋葱表皮细胞后，利用激光共聚焦显微镜观察洋葱表皮细胞内BoRACK1和GFP的融合表达情况，结果显示，洋葱表皮细胞的细胞基质、细胞膜和细胞核均有绿色荧光，表明BoRACK1定位于细胞质、细胞核和细胞膜（图7）。
3 讨论
RACK1含有7个WD重复结构，每一个WD重复跨度为40～60氨基酸，称为WD40结构域，其并非绝对保守（Guo et al.，2007），可能被其他氨基酸代替。前人研究表明，RACK1蛋白的7个β-螺旋桨结构N端为GH，C端为WD（Smith et al.，1999；Guo et al.，2007；Adams et al.，2011；Peng et al.，2016）。但本研究结果显示，BoRACK1蛋白的N端为WH，C端为WG，且第6和第7个GH-WD核心序列间的序列与其他植物RACK1蛋白存在明显差异，说明BoRACK1蛋白与其他同源蛋白间发生了明显变异。已有研究发现，在所有WD重复蛋白中，第6与第7个GH-WD核心序列间存在一个较大的可变区域，推测其暴露在WD重复蛋白的7叶螺旋桨结构的表面，决定了其可作为PKC受体的特性（Smith et al.，1999；Guo et al.，2007；Adams et al.，2011；Peng et al.，2016）。
RACK1基因不仅在拟南芥等植物不同组织中均有表达（Guo et al.，2007），且在哺乳动物不同组织和器官也均有表达，尤其是人类的大脑、肝脏和脾脏的表达水平较高（Adams et al.，2011）。本研究发现，BoRACK1基因在羽衣甘蓝的根、茎、叶、花、幼芽和种子中均有表达，其中在根、叶和种子中的表达量较高，而在花、幼芽及茎的表达量较少，说明BoRACK1基因在不同组织中的表达量存在一定差异，但无组织特异性，与RACK1基因在大多数动物不同组织中的表达情况一致（Chou et al.，1999；Corsini et al.，2016）。
RACK1基因参与对植物激素信号的响应。Ishida等（1993）首次从烟草BY-2悬浮细胞中分离获得RACK1基因，并发现其参与生长素介导的细胞分裂，是一种生长素诱导基因。Nakashima等（2008）研究发现，水稻RACK1A基因表达与茉莉酸甲酯（MeJA）、ABA和IAA密切相关。Guo等（2009）研究发现，拟南芥rack1a突变体在种子萌发、幼苗生长及根形成过程中均对生长素不敏感，但对ABA超敏感，且种子萌发期间对赤霉素（GA）和油菜素内酯的敏感性明显降低。本研究发现，BoRACK1基因在ABA、H2O2和NaCI胁迫下的表达整体上呈下调趋势，表明其参与激素和非生物胁迫响应。但须通过基因敲除或过表达的方法对其抗逆性响应机制进行深入探索。
RACK1在不同物种的亚细胞定位不同。如在哺乳动物细胞中RACK1定位于细胞质、细胞核和内质网中（Guo et al.，2011）；在水稻细胞中RACK1A存在于细胞质和微粒体中（Nakashima et al.，2008）。本研究通过构建一个含BoRACK1基因和GFP报告基因融合表达载体，并用基因枪法转化洋葱表皮细胞，在激光共聚焦荧光显微镜下观察发现BoRACK1和GFP融合蛋白分布在洋葱表皮细胞的细胞质、细胞核和细胞膜中，说明BoRACK1定位于细胞质、细胞核和细胞膜，与前人研究结果（Nakashima et al.，2008；Guo et al.，2011）一致。RACK1是一个核糖体相关蛋白，在翻译过程中发挥关键作用，可与拟南芥真核起始因子6（eIF6）相互作用（Guo et al.，2011）；在细胞核中的RACK1复合物可促进部分基因的转录（He et al.，2002，2010）；RACK1与膜蛋白Rboh相互作用（Nakashima et al.，2008）。表明RACK1存在于细胞质、细胞膜和细胞核中，但其具体发挥的生物学功能有待进一步研究。
4 结论
BoRACK1基因表达无组织特异性，除了与羽衣甘蓝花、果实及营养器官的发育存在关联外，还可能参与了植物的抗逆性调控过程。 參考文献：
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（責任编辑 陈 燕）
关键词： 蛋白激酶C1受体（RACK1）；羽衣甘蓝；亚细胞定位；荧光定量PCR（qRT-PCR）
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of gene BoRACK1 in Brassica oleracea
PANG Ke-qin1， LIU Hong-wei2， ZHEN Ping-ping3， GUO Jun-jie4，
LI Wei4， LI Da-hong4， LI Hong-yan4*
（1Garden Center， Huanghuai University， Zhumadian， Henan 463000， China； 2Green Department of Zhumadian，Zhumadian， Henan 463000， China； 3Agricultural and Forestry Bureau of Linyi County，Shandong Province， Linyi， Shandong 276000， China； 4 School of Biotechnology and Food Engineering， Huanghuai University，
Zhumadian， Henan 463000， China）
Abstract：【Objective】Gene（BoRACK1） sequence of tyrosine kinase receptorC1（RACK1） from Brassica oleracea was cloned； subcellular localization and expression analysis were also conducted， in order to provide theoretical basis for research on the regulation mechanism of gene RACK1 in the process of plant growth and development. 【Method】Gene BoRACK1 was amplified by PCR and expression vector of subcellular localization was constructed.Onion epidermal cells were transformed by the particle bombardment method. The distribution of green fluorescent protein（GEP） was observed under a laser scanning confocal microscope. The fluorescent quantitative PCR（qRT-PCR） method was used to detect the expression of gene BoRACK1 in different tissues and seedlings under abiotic stress（200 mmol/L NaCl， 100 μmol/L ABA and 1 mmol/L H2O2 solution）. 【Result】The open reading frame（ORF） sequence of gene BoRACK1 was acquired by PCR amplification. cDNA was 980 bp in length，encoding 326 amino acids. Amino acid sequence hadhigh homology with the RACK1 of other plants， which was over 65%. In particular， the homology with Arabidopsis thaliana reached 93%. Gene BoRACK1 expressed in roots， stems， leaves， flowers and seeds of B.oleracea. The expressions in roots， leaves and seeds were high while those in flowers， seedlings and stems were low. The overall expression of gene BoRACK1 was down-re-gulated under abiotic stress of ABA， H2O2 and NaCl. The expression level reached the lowest point at 6 h under NaCl stress，and the expression level reached the lowest point at 4 h under other stresses. BoRACK1 was localized in the cytoplasm， cell nuclear and plasma membrane. 【Conclusion】The expression of gene BoRACK1 has no tissue specificity. The gene has different degrees of correlations with development of flowers， fruits and vegetative organof B.oleracea； and the gene may also be involved in the regulation process of plant stress resistance. Key words：tyrosine kinase receptorC1（RACK1）；Brassica oleracea；subcellular localization；fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）志碼：A 文章编号：2095-1191（2018）04-0635-08
0 引言
【研究意义】蛋白激酶C1受体（RACK1）是一种含有7个β-螺旋桨结构的多功能支架蛋白，广泛存在于真核细胞中，属于WD（色氨酸和天冬氨酸）重复蛋白家族成员（McCahill et al.，2002），参与多个信号转导通路和不同信号分子调节过程，如cAMP信号转导、mRNA翻译调控、细胞骨架重构和蛋白质降解等（Ullah et al.，2008；Guo et al.，2009；Komatsu et al.，2014）。因此，开展RACK1基因克隆、亚细胞定位及表达分析，对研究RACK1基因在植物生长发育过程中的生物学功能和作用机理具有重要意义。【前人研究进展】目前有关RACK1基因的研究报道较多。McCahill等（2002）研究发现，蛇、鸡和人类等体内仅含一个单一的RACK1基因。Chen等（2006）研究发现，拟南芥基因组包含3个RACK1基因，水稻基因组中有2个RACK1基因。Nakashima等（2008）研究认为，水稻RACK1与其他蛋白相互作用形成复合体共同参与植株对稻瘟病菌的响应，其响应机理是水稻感染稻瘟病后RACK1基因过表达导致其体内活性氧（ROS）含量和病程相关基因（PR）表达量增加，从而缓解稻瘟病症状。Guo等（2009）研究发现，RACK1基因参与植物的生物和非生物胁迫。Li等（2009，2018）、李大红等（2014）分别利用RNA干扰（RNAi）技术抑制水稻和大豆的RACK1基因表达，结果发现，二者的转基因植株抗旱能力均显著高于野生型。Wang等（2014）采用PCR对玉米RACK1基因（ZmRACK1）进行扩增，结果发现ZmRACK1基因过表达可缓解玉米叶片大斑病症状。Zhang等（2014）研究表明，水稻RACK1基因通过调节内源H2O2含量参与其种子萌发。Nielsen等（2017）研究发现，RACK1蛋白氨基酸序列高度保守，可特异性与核糖体紧密结合，表明RACK1是一个完整的核糖体蛋白。Schmitt等（2017）研究认为，Asc1p/RACK1是一个与核糖体40S亚基相互作用的关键因子，RACK1可能是在核糖体翻译后加工过程中发挥蛋白磷酸化信号转导的作用。【本研究切入点】羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala f.tricolor）是十字花科芸薹属的观赏植物，叶片形态美观多变，色彩绚丽如花，但至今鲜见羽衣甘蓝RACK1基因（BoRACK1）克隆、亚细胞定位及表达分析的研究报道。【拟解决的关键问题】克隆BoRACK1基因，采用荧光定量PCR（qRT-PCR）检测其在羽衣甘蓝不同组织及非生物胁迫下幼苗中的表达情况，并对其编码蛋白进行亚细胞定位，为研究RACK1基因在植物生长发育过程中的生物学功能和作用机理提供参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
羽衣甘蓝由河南省驻马店市园林绿化科研所提供，种植于黄淮学院南区温室内。大肠杆菌DH5α感受态细胞和洋葱瞬时表达载体pCAMBIA1301由黄淮学院园林中心实验室保存提供，pMD18-T载体、DNA聚合酶I、RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、限制性内切酶、PCR试剂盒和随机引物试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，DNA快速纯化回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，SYBR Green Supermix Ex Taq（ABI）试剂盒购自美国Bio-Rad公司，抗生素、植物生长调节剂等购自美国Sigma公司，其他试剂采用进口或国产分析纯。主要仪器设备：ABI7500实时定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）、PDS-1000台式基因枪（美国Bio-Rad公司）和激光共聚焦显微镜（德国ZEISS公司）。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 样品处理及采集 羽衣甘蓝种子萌发后30 d移栽大棚，浇灌Hoagland’s营养液；10 d后采集其根和叶。植株抽苔时采集茎和幼芽，初花期采集整花，种子成熟后收集种子，用于BoRACK1基因克隆及组织特异性表达分析。另外，将40 d的羽衣甘蓝幼苗分为3组，每组30株，分别置于200 mmol/L NaCl、100 μmol/L脱落酸（ABA）和1 mmol/L H2O2中，于胁迫处理0、2、4、6和8 h后取样（整个植株），立即放入液氮中待冷冻后于-80 ℃保存，用于研究BoRACK1基因对非生物胁迫的响应。
1. 2. 2 总RNA提取 参照RNA提取试剂盒说明提取样品总RNA。利用超微量核酸蛋白分析仪检测总RNA的浓度和纯度，并利用1%甲醛变性胶电泳进行其完整性检测。
1. 2. 3 cDNA合成 以总RNA为模板，利用逆转录试剂盒反转录合成第一链cDNA。参照DNA聚合酶I使用说明合成第二链DNA。
1. 2. 4 引物设计及合成 在NCBI网站上将羽衣甘蓝基因组DNA与拟南芥（Arabidopsis thaliana）RACK1基因（GenBank登录号LOC106317602）进行序列比对，获得同源性达93%的基因序列。并利用Primer Premier 5.0设计其引物（表1），扩增目的片段为980 bp。
1. 2. 5 基因克隆 PCR反应体系50.0 μL：10×PCR Buffer（Mg2+ Plus）5.0 μL，dNTP Mixture 4.0 μL，BoRACK1-F和RACK1-R cDNA各2.0 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O补足至50.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，进行30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。 1. 2. 6 亚细胞定位表达载体构建 利用DNA快速纯化回收试剂盒回收PCR产物中的目的条带，并连接至pMD18-T载体上，热激转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。对测序正确的阳性质粒和含绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的表达载体pCAMBIA1301（pCAMBIA1301-GFP）进行BamH I和Bcl I双酶切。回收目的基因和表达载体，并按照3∶1比例混合，加入T4连接酶于4 ℃连接过夜。最后经酶切和测序验证后获得重组表达载体pCAMBIA1301-BoRACK1-GFP，BoRACK1基因的开放阅读框（ORF）被插入花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子与GFP报告基因之间（图1），用于亚细胞定位。
1. 2. 7 生物信息学分析 测序结果在NCBI的BLAST上进行同源性比对，并利用ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）预测目的基因的ORF，从而推导出氨基酸序列。利用DNAMAN构建系统发育进化树，采用ProtParam在线工具（http：//web.expasy.org/protparam/）预测该序列编码蛋白的基本理化性质，并以Smart（http：//smart. embl-heidilberg.de/）预测其保守结构域。
1. 2. 8 qRT-PCR检测 利用qRT-PCR检测羽衣甘蓝不同组织中及非生物胁迫（200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和1 mmol/L H2O2）下幼苗中的表达情况，以iTaqTM Universal SYBR Green Supermix作为荧光试剂，管家基因Boactin（GenBank登录号AF044573）作为内参基因，其引物序列见表1。每处理3次重复。qRT-PCR反应体系50.0 μL：25.0 μL 2×SYBR Green Premix Ex Taq、10 μmol/L正、反向引物（qBoRACK1-F/qBoRACK1-F）各5.0 μL、5.0 μL cDNA 模板，灭菌蒸馏水补足至50.0 μL。扩增程序：50 ℃ 2 min，95 ℃预变性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，进行40个循环。
1. 2. 9 亚细胞定位 构建的pCAMBIA1301-BoRACK1-GFP利用基因枪轰击洋葱表皮细胞，并通过GFP报告基因在洋葱表皮细胞内的表达情况对BoRACK1基因编码蛋白进行亚细胞定位（Zhang et al.，2016），以空载体pCAMBIA1301-GFP为对照。
2 结果与分析
2. 1 BoRACK1基因扩增结果
如图2所示，PCR扩增获得一条大小约980 bp的清晰条带，与目的基因长度基本相符。测序结果显示，其与羽衣甘蓝基因组中的RACK1基因参考序列相似性达100%，表明成功克隆获得BoRACK1基因。
2. 2 生物信息学分析结果
采用ProtParam预测BoRACK1蛋白的理化性质，结果显示，其分子量为35.6 kD，等电点（pI）为7.03，由326个氨基酸组成。DNAMAN分析结果表明，BoRACK1与拟南芥AtRACK1C、AtRACK1B和AtRACK1A（A. thaliana，Np_188441、Np_175296和Np_173248）的同源性分别达93%、91%和87%，与核桃（Juglans regia L.，xp_018829694.1）、木豆（Cajanus cajan L.，kyp67473.1）、菜豆（Phaseolus vulgaris L.，acj24167.1）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula L.，xp_003631071.1）、蔓花生（Arachis duranensis L.，xp_015966958.1）、大豆（Glycine max L.，q39836）、枣树（Zizyphus jujuba L.，xp_015882908.1）和草莓（Fraga-ria，xp_004299548.1）的同源性均为85%，与雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii L.，xp_012486409.1）和亚洲棉（G. arboreum L.，khg29145.1）的同源性为86%，与水稻OsRACK1A和OsRACK1B（Oryza sativa L.，NP_916988和XP_475866）的同源性分别为86%和66%。利用Smart预测BoRACK1蛋白氨基酸序列的保守结构域，结果显示，其氨基酸序列中有典型的GH（甘氨酸和组氨酸）和WD二肽结构，其中有7个WD重复，7个GH重复，是蛋白激酶C（PKC）保守结构域的内部序列，其数量和位置与大豆、水稻等植物PKC基本一致；BoRACK1蛋白的N端为WH，C端为WG，且第6和第7个GH-WD核心序列间的序列与其他植物RACK1蛋白存在明显差异（图3），表明该蛋白与其他同源蛋白间发生了明显变异。
2. 3 系统发育进化分析结果
利用DNAMAN基于BoRACK1蛋白氨基酸序列与拟南芥（Np_173248、Np_175296和Np_188441）、核桃（xp_018829694.1）、木豆（kyp67473.1）、菜豆（acj24167.1）、蒺藜苜蓿（xp_003631071.1）、蔓花生（xp_015966958.1）、雷蒙德氏棉（xp_012486409.1）、大豆（q39836）、棗树（xp_015882908.1）、草莓（xp_004299548.1）、亚洲棉（khg29145.1）、水稻（NP-916988和XP-475866）等植物的RACK1蛋白氨基酸序列构建系统发育进化树，结果如图4所示。羽衣甘蓝RACK1与同为十字花科的拟南芥和禾本科植物水稻聚在同一分支上，与拟南芥AtRACK1C（NP_188441）蛋白聚于同一亚分支，且拟南芥AtRACK1A（NP_173248）和水稻OsRACK1A（NP_916988）在最近的亚分支，表明羽衣甘蓝与拟南芥亲缘关系最近，其次为水稻，同时证明RACK1在长期生物进化过程中具有较强的保守性，在近缘种中变异很小。 2. 4 BoRACK1基因的组织特异性表达分析结果
利用qRT-PCR检测羽衣甘蓝不同组织中BoRACK1基因的表达情况，结果如图5所示。BoRACK1基因在羽衣甘蓝的根、茎、叶、花、幼芽和种子中均有表达，其中在根、叶和种子中的表达量较高，而在花、幼芽和茎的表达量较少。说明BoRACK1基因在不同组织中的表达量存在一定差异，但无组织特异性。
2. 5 BoRACK1基因在非生物胁迫下的表达情况
分别以200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和1 mmol/L H2O2胁迫处理40 d的羽衣甘蓝幼苗，于处理0、2、4、6和8 h后取样，利用qRT-PCR检测其表达情况，结果如图6所示。100 μmol/L ABA处理0～4 h BoRACK1基因表达量呈显著降低趋势（P<0.05，下同），处理4 h时表达量降至最低，之后又显著上升，最后趋于稳定（图6-A）。200 mmol/L NaCl处理0～6 h BoRACK1基因表达量呈显著降低，处理6 h时表达量降至最低，是处理0 h表达量的35%，随后又显著回升（图6-B）。1 mmol/L H2O2处理0～2 h BoRACK1基因表达量无显著变化（P>0.05，下同），但处理4 h时表达量显著降低至最低，随后表达量无显著变化（图6-C）。由此推测，BoRACK1基因参与非生物胁迫响應。
2. 6 BoRACK1蛋白的亚细胞定位结果
测序结果显示，构建的重组表达载体pGAMBIA1301-BoRACK1-GFP上BoRACK1基因序列与PCR扩增获得序列完全一致，且ORF序列正确，表明表达载体构建成功，可用于亚细胞定位分析。利用基因枪轰击洋葱表皮细胞后，利用激光共聚焦显微镜观察洋葱表皮细胞内BoRACK1和GFP的融合表达情况，结果显示，洋葱表皮细胞的细胞基质、细胞膜和细胞核均有绿色荧光，表明BoRACK1定位于细胞质、细胞核和细胞膜（图7）。
3 讨论
RACK1含有7个WD重复结构，每一个WD重复跨度为40～60氨基酸，称为WD40结构域，其并非绝对保守（Guo et al.，2007），可能被其他氨基酸代替。前人研究表明，RACK1蛋白的7个β-螺旋桨结构N端为GH，C端为WD（Smith et al.，1999；Guo et al.，2007；Adams et al.，2011；Peng et al.，2016）。但本研究结果显示，BoRACK1蛋白的N端为WH，C端为WG，且第6和第7个GH-WD核心序列间的序列与其他植物RACK1蛋白存在明显差异，说明BoRACK1蛋白与其他同源蛋白间发生了明显变异。已有研究发现，在所有WD重复蛋白中，第6与第7个GH-WD核心序列间存在一个较大的可变区域，推测其暴露在WD重复蛋白的7叶螺旋桨结构的表面，决定了其可作为PKC受体的特性（Smith et al.，1999；Guo et al.，2007；Adams et al.，2011；Peng et al.，2016）。
RACK1基因不仅在拟南芥等植物不同组织中均有表达（Guo et al.，2007），且在哺乳动物不同组织和器官也均有表达，尤其是人类的大脑、肝脏和脾脏的表达水平较高（Adams et al.，2011）。本研究发现，BoRACK1基因在羽衣甘蓝的根、茎、叶、花、幼芽和种子中均有表达，其中在根、叶和种子中的表达量较高，而在花、幼芽及茎的表达量较少，说明BoRACK1基因在不同组织中的表达量存在一定差异，但无组织特异性，与RACK1基因在大多数动物不同组织中的表达情况一致（Chou et al.，1999；Corsini et al.，2016）。
RACK1基因参与对植物激素信号的响应。Ishida等（1993）首次从烟草BY-2悬浮细胞中分离获得RACK1基因，并发现其参与生长素介导的细胞分裂，是一种生长素诱导基因。Nakashima等（2008）研究发现，水稻RACK1A基因表达与茉莉酸甲酯（MeJA）、ABA和IAA密切相关。Guo等（2009）研究发现，拟南芥rack1a突变体在种子萌发、幼苗生长及根形成过程中均对生长素不敏感，但对ABA超敏感，且种子萌发期间对赤霉素（GA）和油菜素内酯的敏感性明显降低。本研究发现，BoRACK1基因在ABA、H2O2和NaCI胁迫下的表达整体上呈下调趋势，表明其参与激素和非生物胁迫响应。但须通过基因敲除或过表达的方法对其抗逆性响应机制进行深入探索。
RACK1在不同物种的亚细胞定位不同。如在哺乳动物细胞中RACK1定位于细胞质、细胞核和内质网中（Guo et al.，2011）；在水稻细胞中RACK1A存在于细胞质和微粒体中（Nakashima et al.，2008）。本研究通过构建一个含BoRACK1基因和GFP报告基因融合表达载体，并用基因枪法转化洋葱表皮细胞，在激光共聚焦荧光显微镜下观察发现BoRACK1和GFP融合蛋白分布在洋葱表皮细胞的细胞质、细胞核和细胞膜中，说明BoRACK1定位于细胞质、细胞核和细胞膜，与前人研究结果（Nakashima et al.，2008；Guo et al.，2011）一致。RACK1是一个核糖体相关蛋白，在翻译过程中发挥关键作用，可与拟南芥真核起始因子6（eIF6）相互作用（Guo et al.，2011）；在细胞核中的RACK1复合物可促进部分基因的转录（He et al.，2002，2010）；RACK1与膜蛋白Rboh相互作用（Nakashima et al.，2008）。表明RACK1存在于细胞质、细胞膜和细胞核中，但其具体发挥的生物学功能有待进一步研究。
4 结论
BoRACK1基因表达无组织特异性，除了与羽衣甘蓝花、果实及营养器官的发育存在关联外，还可能参与了植物的抗逆性调控过程。 參考文献：
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（責任编辑 陈 燕）