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摘要：血凝抑制试验是兽医实验室常用的检测方法之一。该方法具有敏感度高、特异性好、试验条件要求低、设备投入少、适于大批量样品检验等优点，但试验结果的准确性易受多方面因素的影响。作者从实验材料的选择、操作方法、结果判定等方面对常出现的问题进行分析，以期对相关人员提供帮助，提高实验结果的准确度。
关键词：血凝抑制试验；影響因素；分析
中图分类号：S852.5 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-07-0064-1
某些病毒具有能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集的特性，这种现象称为血凝（HA），属非特异性反应。血凝现象可以被特异性抗体抑制，称为血凝抑制（HI）反应，具有特异性。HA—HI试验可用于病毒分离、鉴定、分型，病毒性疾病诊断和抗体效价的检测等方面。现就试验中易出现的问题进行探讨。
1 试验材料的选择与处理
1.1 反应板、移液器、吸头的选择与处理
反应板：一般选用“V”型医用血凝板，图形清晰、易于判定。试验结束后及时冲净血球，在含有洗涤剂的温水中浸泡30min，用棉试纸擦洗凹孔，自来水反复冲洗后浸入2%的盐酸溶液中过夜，自来水冲洗，再放入1%的氢氧化钠溶液中24h，自来水充分冲洗，最后用蒸馏水冲洗3遍，37℃温箱中烘干备用；移液器：使用前要检查量程是否与试验移加的液体量相匹配，刻度是否准确，吸头安装是否牢固；安装吸头时，不可以用反复撞击的方法来达到上紧的目的；设定移液体积时，应从大体积调节到小体积；加样完毕后，应将量程调至最大值，使弹簧处于松弛状态；平时做好移液器的检验校正与保养；吸头：吸头应表面光洁平滑，形状规则，与移液器上的吸头套密封完好，尽量使用一次性吸头。
1.2 样品的采集与处理
样品的采集。禽类一般在翅静脉采血。采血器具要求清洁、干燥、无菌；每采一只鸡应更换1个注射器；采血速度适中，防止注射器抽吸太快而产生气泡。抽取的血液可经以下方法制备血清：室温下倾斜放置2-4h，自然析出；置4℃冰箱过夜；放在25-37℃水浴或37℃温箱内1h；1500-2000r/min离心5min。采集的样品应新鲜、无杂质、无溶血、不腐败；样品的处理。样品应于2－8℃条件下密封保存，若需较长时间保存，应冷冻于-20℃条件下，解冻样品使用前要彻底混合，确保蛋白质分散均匀。确需多次分批检测时，应分装，避免反复冻融。在试验中，有时会出现非特异性凝集现象，尤其是在选用非同种家禽的红细胞时。可用受体破坏酶（RDE）或高碘酸钠法处理，每0.5mL血清中加入0.025mL的鸡红细胞悬液，轻摇后静置至少30min，1500r/min离心5min，取上清，即为处理后的血清。
1.3 试剂的配制
稀释液：试验用稀释液必须为0.01mol/L，pH值7.2的等渗磷酸盐缓冲液(PBS液)，灭菌后4℃保存。一般不能用生理盐水代替；4单位抗原。以HA试验中使红细胞完全凝集的抗原最高稀释度作为抗原效价进行4单位抗原的配制，4单位抗原的血凝价与抗体效价成反比关系，因此配好的4单位抗原需用回归试验进行检测。溶解的抗原原液应-15℃冷冻保存。每一次试验的4单位抗原都要新鲜配制，室温放置不超过4h；1%红细胞悬液。应选用至少3只成年SPF公鸡或无相应抗体的健康公鸡来获得红细胞。红细胞用PBS液按2500－3000r/min离心洗涤3次，对免疫状态不明的鸡，应至少洗涤5次，每次离心后都要将红细胞上层的灰白色层（白细胞、血小板等）吸除，最后一次离心后在管底取红细胞泥进行稀释，或使用有详细刻度的离心管，准确读取红细胞压积，用PBS液进行1%红细胞悬液配制。若洗好的红细胞需保存，可加入大量无菌阿氏液4℃冷藏。
2 操作中的注意事项
2.1 移液器
操作时拇指用力要均匀，移液器吸头所吸液体液面高度一致，吸时二档，排时一档。倍比稀释时，应彻底排尽吸头内的液体，再慢慢吸取加入下一孔的液体。吸液时动作要缓慢，防止吸入过快。一般取样时应先取一次，以“润洗”吸头，然后再正式取样。
2.2 加样
试验前所有试剂应恢复至室温，检查所用试剂有无污染，红细胞有无溶血等。用移液器吸取液体时，吸头需碰触器壁以除去多余液体，要注意吸头内液面是否一致。红细胞悬液和4单位抗原在试验前要充分混匀，在滴加过程中应同方向边加边摇。
2.3 温度与时间
实验室温度应为20-25℃，禁止在通风口或日光下操作，防止过冷、过热及蒸发。孵育温度为20-25℃；抗原抗体的作用时间为25-30min，加入红细胞后，以红细胞对照完全沉淀的前后5min内判定结果较好，大约为30-40min。
3 结果判定
应严格按照试验要求的时间进行结果判定。若稀释液对照孔凝集，或抗原孔不凝集，则试验不成立，而且，只有在阴性对照孔血清效价不大于2log2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度时，试验结果才有效。判定结果时，将反应板倾斜45°，在白色背景下观察，红细胞呈泪滴样流淌，边缘无凝集颗粒，为凝集抑制。以完全抑制4单位抗原的血清最高稀释倍数作为HI效价。
4 试验中常见错误分析
全部凝集：红细胞受到污染或保存时间过长；4单位抗原效价过高或滴加失误；生理盐水受污染。整板无凝集：4单位抗原失效；试验中少了加4单位抗原步骤；环境温度高，读数时间拖延。跳孔：倍比稀释时，操作顺序错乱；使用多道移液器时，每次吸取的液体量不一致；个别孔滴加4单位抗原遗漏。整板样品效价为1log2：操作时遗漏了倍比稀释步骤。
作者简介：杨萍(1980-)，女，汉族，陕西富平人，硕士研究生，咸阳市动物疫病预防控制中心助理兽医师，从事动物疫病监测诊断与流行病学调查工作。
关键词：血凝抑制试验；影響因素；分析
中图分类号：S852.5 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-07-0064-1
某些病毒具有能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集的特性，这种现象称为血凝（HA），属非特异性反应。血凝现象可以被特异性抗体抑制，称为血凝抑制（HI）反应，具有特异性。HA—HI试验可用于病毒分离、鉴定、分型，病毒性疾病诊断和抗体效价的检测等方面。现就试验中易出现的问题进行探讨。
1 试验材料的选择与处理
1.1 反应板、移液器、吸头的选择与处理
反应板：一般选用“V”型医用血凝板，图形清晰、易于判定。试验结束后及时冲净血球，在含有洗涤剂的温水中浸泡30min，用棉试纸擦洗凹孔，自来水反复冲洗后浸入2%的盐酸溶液中过夜，自来水冲洗，再放入1%的氢氧化钠溶液中24h，自来水充分冲洗，最后用蒸馏水冲洗3遍，37℃温箱中烘干备用；移液器：使用前要检查量程是否与试验移加的液体量相匹配，刻度是否准确，吸头安装是否牢固；安装吸头时，不可以用反复撞击的方法来达到上紧的目的；设定移液体积时，应从大体积调节到小体积；加样完毕后，应将量程调至最大值，使弹簧处于松弛状态；平时做好移液器的检验校正与保养；吸头：吸头应表面光洁平滑，形状规则，与移液器上的吸头套密封完好，尽量使用一次性吸头。
1.2 样品的采集与处理
样品的采集。禽类一般在翅静脉采血。采血器具要求清洁、干燥、无菌；每采一只鸡应更换1个注射器；采血速度适中，防止注射器抽吸太快而产生气泡。抽取的血液可经以下方法制备血清：室温下倾斜放置2-4h，自然析出；置4℃冰箱过夜；放在25-37℃水浴或37℃温箱内1h；1500-2000r/min离心5min。采集的样品应新鲜、无杂质、无溶血、不腐败；样品的处理。样品应于2－8℃条件下密封保存，若需较长时间保存，应冷冻于-20℃条件下，解冻样品使用前要彻底混合，确保蛋白质分散均匀。确需多次分批检测时，应分装，避免反复冻融。在试验中，有时会出现非特异性凝集现象，尤其是在选用非同种家禽的红细胞时。可用受体破坏酶（RDE）或高碘酸钠法处理，每0.5mL血清中加入0.025mL的鸡红细胞悬液，轻摇后静置至少30min，1500r/min离心5min，取上清，即为处理后的血清。
1.3 试剂的配制
稀释液：试验用稀释液必须为0.01mol/L，pH值7.2的等渗磷酸盐缓冲液(PBS液)，灭菌后4℃保存。一般不能用生理盐水代替；4单位抗原。以HA试验中使红细胞完全凝集的抗原最高稀释度作为抗原效价进行4单位抗原的配制，4单位抗原的血凝价与抗体效价成反比关系，因此配好的4单位抗原需用回归试验进行检测。溶解的抗原原液应-15℃冷冻保存。每一次试验的4单位抗原都要新鲜配制，室温放置不超过4h；1%红细胞悬液。应选用至少3只成年SPF公鸡或无相应抗体的健康公鸡来获得红细胞。红细胞用PBS液按2500－3000r/min离心洗涤3次，对免疫状态不明的鸡，应至少洗涤5次，每次离心后都要将红细胞上层的灰白色层（白细胞、血小板等）吸除，最后一次离心后在管底取红细胞泥进行稀释，或使用有详细刻度的离心管，准确读取红细胞压积，用PBS液进行1%红细胞悬液配制。若洗好的红细胞需保存，可加入大量无菌阿氏液4℃冷藏。
2 操作中的注意事项
2.1 移液器
操作时拇指用力要均匀，移液器吸头所吸液体液面高度一致，吸时二档，排时一档。倍比稀释时，应彻底排尽吸头内的液体，再慢慢吸取加入下一孔的液体。吸液时动作要缓慢，防止吸入过快。一般取样时应先取一次，以“润洗”吸头，然后再正式取样。
2.2 加样
试验前所有试剂应恢复至室温，检查所用试剂有无污染，红细胞有无溶血等。用移液器吸取液体时，吸头需碰触器壁以除去多余液体，要注意吸头内液面是否一致。红细胞悬液和4单位抗原在试验前要充分混匀，在滴加过程中应同方向边加边摇。
2.3 温度与时间
实验室温度应为20-25℃，禁止在通风口或日光下操作，防止过冷、过热及蒸发。孵育温度为20-25℃；抗原抗体的作用时间为25-30min，加入红细胞后，以红细胞对照完全沉淀的前后5min内判定结果较好，大约为30-40min。
3 结果判定
应严格按照试验要求的时间进行结果判定。若稀释液对照孔凝集，或抗原孔不凝集，则试验不成立，而且，只有在阴性对照孔血清效价不大于2log2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度时，试验结果才有效。判定结果时，将反应板倾斜45°，在白色背景下观察，红细胞呈泪滴样流淌，边缘无凝集颗粒，为凝集抑制。以完全抑制4单位抗原的血清最高稀释倍数作为HI效价。
4 试验中常见错误分析
全部凝集：红细胞受到污染或保存时间过长；4单位抗原效价过高或滴加失误；生理盐水受污染。整板无凝集：4单位抗原失效；试验中少了加4单位抗原步骤；环境温度高，读数时间拖延。跳孔：倍比稀释时，操作顺序错乱；使用多道移液器时，每次吸取的液体量不一致；个别孔滴加4单位抗原遗漏。整板样品效价为1log2：操作时遗漏了倍比稀释步骤。
作者简介：杨萍(1980-)，女，汉族，陕西富平人，硕士研究生，咸阳市动物疫病预防控制中心助理兽医师，从事动物疫病监测诊断与流行病学调查工作。