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【摘要】 目的 检测肌营养不良症患者的血清血管生长因子(VEGF)水平,鉴定其是否与肌营养不良症的疾病发展有关。方法 对46例肌营养不良患者,其中32例Duchenne 肌营养不良症 (DMD)、9例Becker肌营养不良症 (BMD)、5例强直性肌营养不良症(DM)患者的血清VEGF水平进行检测。15例健康人和8例疾病患者为对照组。结果 DMD患者血清VEGF为(274.7 ± 2.52)pg/ml,BMD患者的为(358.8 ± 9.64) pg/ml,DM患者为(165.0 ± 6.34) pg/ml,而健康对照组为(1 48.3 ± 2.91) pg/ml,疾病对照组为(153.7 ± 5.42) pg/ml。与DM组和对照组相比,BMD的VEGF水平显著提高。而DMD组中卧床的患者相对于坐轮椅的DMD、DM组和对照组则VEGF水平显著升高。结论 VEGF可以反映肌肉组织低氧和/或缺血状况,并且与DMD和BMD患者的疾病发展过程有关。
【关键词】 Becker肌营养不良症; Duchenne 肌营养不良症; 血管生长因子
The relationship between serum levels of vascular endothelial growth factor andmuscular dystrophy development
WANG Wen-feng,PENG Jia- peng,MA Pei-jiong,et al.
Chao-Nan Hospital of Shantou,Shantou Guangdong 515144,China
【Abstract】 Objective To detect serum levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) in patients with muscular dystrophy and further to examine whether VEGF is associated with muscular dystrophy development. Methods We measured serum levels of VEGF in 32 patients with DMD,9 with Becker muscular dystrophy (BMD),5 with myotonic dystrophy (DM),as well as in 15 healthy and eight disease controls. Results The serum level of VEGF in the DMD patients was (274.7 ± 2.52)pg/ml,while it was(358.8 ± 9.64) pg/ml in the BMD patients,(165.0 ± 6.34)pg/ml in the DM patients,(1 48.3 ± 2.91) pg/ml in the healthy controls,and (153.7 ± 5.42) pg/mlin the disease controls. The level of VEGF in BMD was significantly elevated,as compared with DM and control groups. Further,the level of VEGF in the bedridden sub-group of DMD patients was significantly elevated as compared with chair-bound DMD,DM,and control groups. Conclusion We concluded that VEGF may reflect hypoxic and/or ischemic conditions in muscle tissue,and have a relationship with the process of disease progression in DMD and BMD patients.
【Key words】 Becker muscular dystrophy (BMD); Duchenne muscular dystrophy (DMD); Vascular endothelial growth factor (VEGF)
肌营养不良症患者存在无症状纤维蛋白溶解凝聚异常[1]。已有研究报道在DMD患者早期病程中即存在内皮细胞异常肿胀、基底膜增厚、血小板粘附聚集、小血管血栓形成。这些结果表明肌营养不良症的患者肌肉组织因微循环异常容易发生缺血缺氧。
VEGF是肝素结合糖蛋白,同源二聚体结构,是血管生成的关键调节因子,可由缺血或/和缺氧引起,能改善无临床症状的轻微缺血状况,与多种疾病状态有关。在神经肌肉病的研究中,VEGF已经在神经细胞、心肌细胞、再生的肌纤维、以及mdx鼠的脑中被检测到。
本研究对肌营养不良症患者的血清VEGF水平进行检测,鉴定VEGF是否与疾病的发展有关联。
1 对象和方法
笔者对46例肌营养不良症患者男43例,女3例),15例健康对照男4例,女11例)和8例疾病对照组(男3例,女5例) 进行研究。其中,46例肌营养不良症患者中包括32例DMD和9例BMD,均由临床体征以及肌肉活检或基因分析进行诊断,有5例DM由临床体征、基因分析诊断[2-4]。疾病对照组包括1例亚急性硬化性全脑炎,1例脑梗死,2例脊髓小脑共济失调,3例周围神经病,1例原因不明的肌肉病变。
1.1 运动功能 所有患者中,6例DMD、8例BMD、4例DM可独立或辅助行走,22例DMD、1例BMD,1例DM依靠轮椅活动,4例DMD卧床。所有的疾病对照组均为卧床患者。呼吸状况:38例患者和7例疾病对照组患者保持自主通气,3例DMD(1轮椅,2卧床)和2例BMD(轮椅)采用无创性通气,1例DMD(卧床)和1例疾病对照采用气管间歇正压通气。>10岁能自主通气的患者和所有的机械辅助通气的患者PaO2(正常>80mm Hg)得到改善和/或24 h SpO2监测(正常>95%)。所有患者的呼吸状况控制良好。
有报道VEGF水平呈24 h周期性波动,但夜间或白天内分别是恒定的。因此,对肌营养不良症患者和对照组在白天日常活动的时候采集血液样本,卧床患者除外。笔者应用凝聚和溶解参数检测所有患者血液肌酸激酶(CK值)、VEGF值、纤维蛋白和纤维蛋白原降解物(FDP),应用心功能参数检测血浆脑钠肽水平(BNP)。BNP是肌营养不良症评价心功能的一项基本、可靠的指标。应用酶联免疫吸附试验(ELIAS)检测VEGF水平,最低检测计量为0.1 pg/ml,区间、区内变异系数分别是5.2% 和 6.1%。应用乳胶凝聚试验检测FDP。
1.2 统计学方法 各组研究对象年龄、检测结果以(x±s)表示。各组参数比较采用单因素方差分析,F检验。统计学标准 P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
研究对象的人口统计学特征以及血液CK、VEGF、FDP、BNP检测结果总结为表1。肌营养不良症组患者年龄具有可比性,而健康、疾病对照平均年龄较高。DMD 患者CK值与DM、健康、疾病对照组显著增高,BMD组与健康对照相比显著增高。 BMD组 VEGF值与DM、健康对照、疾病对照组比较显著增高,而DMD 组与DM、对照组相比较高的趋势,尽管差异无统计学意义。DMD 组FDP与DM,组相比显著增高 。尽管DMD组BNP水平显示出较高的趋势,但它在各组患者中比较相似。除了BMD组VEGF和BNP,不论哪种疾病在 VEGF水平、年龄、CK值、FDP值以及BNP值间均无显著关联。而BMD组BNP水平正常。
表1
研究对象的统计学特征和血清CK、 VEGF、FDP、BNP 水平(x±s)
DMDBMDDM健康对照组疾病对照组(正常值)
数目3295158
性别a32/09/02/34/113/5
年龄(岁)13.9 ± 1.7316.3 ± 1.92 17.9 ± 3.57 28.3 ± 1.94 32.4 ± 4.72
运动功能b3/3/22/43/5/1/04/0/1/015/0/0/00/0/0/8
CK (U/L)42590 ± 6.79 4002 ± 1.76 447 ± 9.12 82 ± 1.14 121 ± 1.47 (47-277)
VEGF(pg/ml)274.7 ± 2.52 358.8 ± 9.64 165.0 ± 6.34 148.3 ± 2.91 153.7 ± 5.42
BFDP (μg/ml)18.9 ± 3.16 11.1 ± 4.62 2.9 ± 1.54 (<10)
BNP (pg/ml)25.0 ± 6.41 5.2 ± 1.4 49.6 ± 3.46
注:a男/女;b可独立行走/可辅助行走/依靠轮椅/卧床;单因素方法分析P<0.05
DMD组VEGF平均水平:可独立行走患者(247.0±7.61)pg/ml;可辅助行走患者(213.0±6.71)pg/ml;依靠轮椅患者(253.0±4.21)pg/ml;卧床患者(415.3±5.47)pg/ml。BMD组VEGF平均水平:可独立行走患者(246.0±3.29)pg/ml;可辅助行走患者(647.0±3.38)pg/ml;依靠轮椅患者(318.0±7.60)pg/ml。DMD轮椅亚组的VEGF值与健康对照比较显著升高。而且,DMD卧床患者的VEGF值比DMD轮椅患者、DM组、对照组显著增高。
3 讨论
研究结果,DMD、BMD的VEGF值较DM组和对照组显示出增高的趋势。肌肉变性轻微的DM患者与两组对照VEGF均无增高。而且,依靠轮椅和卧床的DMD患者VEGF值增高,其中一些比较中发现有显著差异,在疾病的早期VEGF没有增高。需辅助行走的BMD患者VEGF明显增高。尽管CK值和VEGF值之间没有发现明显联系,结果仍提示VEGF值增高与DMD、BMD患者易破碎的病变肌肉组织有关。卧床的疾病对照组的VEGF值低于卧床的DMD患者,提示如卧床类似固定状态不是VEGF增高的必要因素。
DMD、BMD患者早期纤维蛋白凝聚溶解障碍有增加[1],VEGF在损伤肌肉实验模型再生肌纤维上表达,提示VEGF参与了肌肉再生过程[5]。DMD和BMD患者的肌肉坏死和再生在疾病早期较晚期更活跃、更系统。因此,本研究期望发现DMD和BMD患者VEGF水平高度增高。然而,目前的结果并没有肯定笔者的推测,VEGF在那些疾病早期的患者中似乎不受影响。相反,VEGF在DMD和BMD患者的晚期发展中表达增高。
DMD患者功能肌肉缺血[6],萎缩肌肉运动过程中交感兴奋性血管收缩并没有减弱,因此肌肉保留的血流保护机制减弱,BMD可能存在同样的缺陷机制。VEGF可被缺氧缺血诱导表达,通过一过性动力学运动可在人类骨骼肌上表达上调。一种大鼠严重肢体缺血模型显示缺血组织大量VEGF表达[7],说明运动功能减弱的DMD和BMD患者日常生活的运动负担可诱导短暂缺血缺氧状态,导致运动肌肉的VEGF表达。目前这些患者有自主呼吸或辅助通气,均无慢性广泛性缺氧。因此,进展中的DMD、BMD患者VEGF表达增高可能反映运动肌肉的缺血缺氧状态。患者的慢性缺氧状况非广泛存在而是集中在运动肌肉上这是很合理的。而晚期DMD、BMD患者严重的肌纤维变性可反映缺血缺氧范围疾病较早期增大。
需要辅助行走的BMD患者有2例显示出VEGF水平显著增高,但是他们的整体状态与另外2例无明显差异。动物实验模型结果显示延迟暴露于缺氧环境可减弱大鼠肌组织VEGF的表达。可能患者各自在日常活动中的运动状态较其血液标本采集的时期更能反映真实结果。尽管笔者通常加强呼吸状况的监控,但是呼吸状态可能是另外一种影响VEGF表达的因素。因此,需要更大数目的注重调整呼吸状态的患者进行研究。
已经有报道缺氧诱导大鼠心脏VEGFmRNA表达增高[8]。BMD和DMD患者同样存在导致缺血缺氧诱发心肌纤维化变性的心肌症。心肌缺氧也可增加BNP的基因表达。尽管在研究的DMD患者中没有发现VEGF和BNP之间有显著的联系,但在BMD患者中二者存在弱的联系,这可能与心肌病的心脏状态相关。
总之,VEGF可反映肌组织的缺血缺氧状态,并可部分程度上影响DMD、BMD患者的疾病发展过程。然而,本研究中,在肌萎缩类型和运动功能之间的样本数量不匹配,数据的比例也有差异。因此,笔者对结果的评估和解释可能会有部分不恰当。还需要更多的大样本实验去鉴定笔者的结果的正确性,并解释VEGF在肌萎缩症中更精确的作用。
参考文献
[1] T Saito,M Takenaka,I Miyai,et al.Coagulation and fibrinolysis disorder in muscular dystrophy.Muscle Nerve,2001,24 : 399-402.
[2] T Saito,T Matsumura,S Nozaki,et al. A case of Duchenne muscular dystrophy showing coagulation cascade activation induced by muscle destruction due to convulsion (in Japanese). Clinica Neurol,2003,43 :274-276.
[3] K Arahata,S Ishiura,T Ishiguro,et al. Immunostaining of skeletal and cardiac muscle surface membrane with antibody against Duchenne muscular dystrophy peptide.Nature,1988,333 : 861-863.
[4] E Bonilla,CE Samitt,AF Miranda,et al. Duchenne muscular dystrophy: deficiency of dystrophin at the muscle cell surface. Cell,1988,54:447-452.
[5] A Germani,A Di Carlo,A Mangoni,et al. Vascular endothelial growth factor modulates skeletal myoblast function. Am J Pathol,2003,163 :1417-1428.
[6] M Sander,B Chavoshan,SA Harris,ST Iannaccone,et al. Functional muscle ischemia in neuronal nitric oxide synthase-deficient skeletal muscle of children with Duchenne muscular dystrophy. PNAS 2000,97: 13818-13823.
[7] F Luo,D Wariaro,G Lundberg,et al. Vascular growth factor expression in a rat model of severe limb ischemia. J Surg Res,2002,108 :258-267.
[8] E Hashimoto,T Ogita,T Nakaoka,et al. Kira,Rapid induction of vascular endothelial growth factor expression by transient ischemia in rat heart. Am J Physiol,1994,267 :1948-1954.
【关键词】 Becker肌营养不良症; Duchenne 肌营养不良症; 血管生长因子
The relationship between serum levels of vascular endothelial growth factor andmuscular dystrophy development
WANG Wen-feng,PENG Jia- peng,MA Pei-jiong,et al.
Chao-Nan Hospital of Shantou,Shantou Guangdong 515144,China
【Abstract】 Objective To detect serum levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) in patients with muscular dystrophy and further to examine whether VEGF is associated with muscular dystrophy development. Methods We measured serum levels of VEGF in 32 patients with DMD,9 with Becker muscular dystrophy (BMD),5 with myotonic dystrophy (DM),as well as in 15 healthy and eight disease controls. Results The serum level of VEGF in the DMD patients was (274.7 ± 2.52)pg/ml,while it was(358.8 ± 9.64) pg/ml in the BMD patients,(165.0 ± 6.34)pg/ml in the DM patients,(1 48.3 ± 2.91) pg/ml in the healthy controls,and (153.7 ± 5.42) pg/mlin the disease controls. The level of VEGF in BMD was significantly elevated,as compared with DM and control groups. Further,the level of VEGF in the bedridden sub-group of DMD patients was significantly elevated as compared with chair-bound DMD,DM,and control groups. Conclusion We concluded that VEGF may reflect hypoxic and/or ischemic conditions in muscle tissue,and have a relationship with the process of disease progression in DMD and BMD patients.
【Key words】 Becker muscular dystrophy (BMD); Duchenne muscular dystrophy (DMD); Vascular endothelial growth factor (VEGF)
肌营养不良症患者存在无症状纤维蛋白溶解凝聚异常[1]。已有研究报道在DMD患者早期病程中即存在内皮细胞异常肿胀、基底膜增厚、血小板粘附聚集、小血管血栓形成。这些结果表明肌营养不良症的患者肌肉组织因微循环异常容易发生缺血缺氧。
VEGF是肝素结合糖蛋白,同源二聚体结构,是血管生成的关键调节因子,可由缺血或/和缺氧引起,能改善无临床症状的轻微缺血状况,与多种疾病状态有关。在神经肌肉病的研究中,VEGF已经在神经细胞、心肌细胞、再生的肌纤维、以及mdx鼠的脑中被检测到。
本研究对肌营养不良症患者的血清VEGF水平进行检测,鉴定VEGF是否与疾病的发展有关联。
1 对象和方法
笔者对46例肌营养不良症患者男43例,女3例),15例健康对照男4例,女11例)和8例疾病对照组(男3例,女5例) 进行研究。其中,46例肌营养不良症患者中包括32例DMD和9例BMD,均由临床体征以及肌肉活检或基因分析进行诊断,有5例DM由临床体征、基因分析诊断[2-4]。疾病对照组包括1例亚急性硬化性全脑炎,1例脑梗死,2例脊髓小脑共济失调,3例周围神经病,1例原因不明的肌肉病变。
1.1 运动功能 所有患者中,6例DMD、8例BMD、4例DM可独立或辅助行走,22例DMD、1例BMD,1例DM依靠轮椅活动,4例DMD卧床。所有的疾病对照组均为卧床患者。呼吸状况:38例患者和7例疾病对照组患者保持自主通气,3例DMD(1轮椅,2卧床)和2例BMD(轮椅)采用无创性通气,1例DMD(卧床)和1例疾病对照采用气管间歇正压通气。>10岁能自主通气的患者和所有的机械辅助通气的患者PaO2(正常>80mm Hg)得到改善和/或24 h SpO2监测(正常>95%)。所有患者的呼吸状况控制良好。
有报道VEGF水平呈24 h周期性波动,但夜间或白天内分别是恒定的。因此,对肌营养不良症患者和对照组在白天日常活动的时候采集血液样本,卧床患者除外。笔者应用凝聚和溶解参数检测所有患者血液肌酸激酶(CK值)、VEGF值、纤维蛋白和纤维蛋白原降解物(FDP),应用心功能参数检测血浆脑钠肽水平(BNP)。BNP是肌营养不良症评价心功能的一项基本、可靠的指标。应用酶联免疫吸附试验(ELIAS)检测VEGF水平,最低检测计量为0.1 pg/ml,区间、区内变异系数分别是5.2% 和 6.1%。应用乳胶凝聚试验检测FDP。
1.2 统计学方法 各组研究对象年龄、检测结果以(x±s)表示。各组参数比较采用单因素方差分析,F检验。统计学标准 P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
研究对象的人口统计学特征以及血液CK、VEGF、FDP、BNP检测结果总结为表1。肌营养不良症组患者年龄具有可比性,而健康、疾病对照平均年龄较高。DMD 患者CK值与DM、健康、疾病对照组显著增高,BMD组与健康对照相比显著增高。 BMD组 VEGF值与DM、健康对照、疾病对照组比较显著增高,而DMD 组与DM、对照组相比较高的趋势,尽管差异无统计学意义。DMD 组FDP与DM,组相比显著增高 。尽管DMD组BNP水平显示出较高的趋势,但它在各组患者中比较相似。除了BMD组VEGF和BNP,不论哪种疾病在 VEGF水平、年龄、CK值、FDP值以及BNP值间均无显著关联。而BMD组BNP水平正常。
表1
研究对象的统计学特征和血清CK、 VEGF、FDP、BNP 水平(x±s)
DMDBMDDM健康对照组疾病对照组(正常值)
数目3295158
性别a32/09/02/34/113/5
年龄(岁)13.9 ± 1.7316.3 ± 1.92 17.9 ± 3.57 28.3 ± 1.94 32.4 ± 4.72
运动功能b3/3/22/43/5/1/04/0/1/015/0/0/00/0/0/8
CK (U/L)42590 ± 6.79 4002 ± 1.76 447 ± 9.12 82 ± 1.14 121 ± 1.47 (47-277)
VEGF(pg/ml)274.7 ± 2.52 358.8 ± 9.64 165.0 ± 6.34 148.3 ± 2.91 153.7 ± 5.42
BFDP (μg/ml)18.9 ± 3.16 11.1 ± 4.62 2.9 ± 1.54 (<10)
BNP (pg/ml)25.0 ± 6.41 5.2 ± 1.4 49.6 ± 3.46
注:a男/女;b可独立行走/可辅助行走/依靠轮椅/卧床;单因素方法分析P<0.05
DMD组VEGF平均水平:可独立行走患者(247.0±7.61)pg/ml;可辅助行走患者(213.0±6.71)pg/ml;依靠轮椅患者(253.0±4.21)pg/ml;卧床患者(415.3±5.47)pg/ml。BMD组VEGF平均水平:可独立行走患者(246.0±3.29)pg/ml;可辅助行走患者(647.0±3.38)pg/ml;依靠轮椅患者(318.0±7.60)pg/ml。DMD轮椅亚组的VEGF值与健康对照比较显著升高。而且,DMD卧床患者的VEGF值比DMD轮椅患者、DM组、对照组显著增高。
3 讨论
研究结果,DMD、BMD的VEGF值较DM组和对照组显示出增高的趋势。肌肉变性轻微的DM患者与两组对照VEGF均无增高。而且,依靠轮椅和卧床的DMD患者VEGF值增高,其中一些比较中发现有显著差异,在疾病的早期VEGF没有增高。需辅助行走的BMD患者VEGF明显增高。尽管CK值和VEGF值之间没有发现明显联系,结果仍提示VEGF值增高与DMD、BMD患者易破碎的病变肌肉组织有关。卧床的疾病对照组的VEGF值低于卧床的DMD患者,提示如卧床类似固定状态不是VEGF增高的必要因素。
DMD、BMD患者早期纤维蛋白凝聚溶解障碍有增加[1],VEGF在损伤肌肉实验模型再生肌纤维上表达,提示VEGF参与了肌肉再生过程[5]。DMD和BMD患者的肌肉坏死和再生在疾病早期较晚期更活跃、更系统。因此,本研究期望发现DMD和BMD患者VEGF水平高度增高。然而,目前的结果并没有肯定笔者的推测,VEGF在那些疾病早期的患者中似乎不受影响。相反,VEGF在DMD和BMD患者的晚期发展中表达增高。
DMD患者功能肌肉缺血[6],萎缩肌肉运动过程中交感兴奋性血管收缩并没有减弱,因此肌肉保留的血流保护机制减弱,BMD可能存在同样的缺陷机制。VEGF可被缺氧缺血诱导表达,通过一过性动力学运动可在人类骨骼肌上表达上调。一种大鼠严重肢体缺血模型显示缺血组织大量VEGF表达[7],说明运动功能减弱的DMD和BMD患者日常生活的运动负担可诱导短暂缺血缺氧状态,导致运动肌肉的VEGF表达。目前这些患者有自主呼吸或辅助通气,均无慢性广泛性缺氧。因此,进展中的DMD、BMD患者VEGF表达增高可能反映运动肌肉的缺血缺氧状态。患者的慢性缺氧状况非广泛存在而是集中在运动肌肉上这是很合理的。而晚期DMD、BMD患者严重的肌纤维变性可反映缺血缺氧范围疾病较早期增大。
需要辅助行走的BMD患者有2例显示出VEGF水平显著增高,但是他们的整体状态与另外2例无明显差异。动物实验模型结果显示延迟暴露于缺氧环境可减弱大鼠肌组织VEGF的表达。可能患者各自在日常活动中的运动状态较其血液标本采集的时期更能反映真实结果。尽管笔者通常加强呼吸状况的监控,但是呼吸状态可能是另外一种影响VEGF表达的因素。因此,需要更大数目的注重调整呼吸状态的患者进行研究。
已经有报道缺氧诱导大鼠心脏VEGFmRNA表达增高[8]。BMD和DMD患者同样存在导致缺血缺氧诱发心肌纤维化变性的心肌症。心肌缺氧也可增加BNP的基因表达。尽管在研究的DMD患者中没有发现VEGF和BNP之间有显著的联系,但在BMD患者中二者存在弱的联系,这可能与心肌病的心脏状态相关。
总之,VEGF可反映肌组织的缺血缺氧状态,并可部分程度上影响DMD、BMD患者的疾病发展过程。然而,本研究中,在肌萎缩类型和运动功能之间的样本数量不匹配,数据的比例也有差异。因此,笔者对结果的评估和解释可能会有部分不恰当。还需要更多的大样本实验去鉴定笔者的结果的正确性,并解释VEGF在肌萎缩症中更精确的作用。
参考文献
[1] T Saito,M Takenaka,I Miyai,et al.Coagulation and fibrinolysis disorder in muscular dystrophy.Muscle Nerve,2001,24 : 399-402.
[2] T Saito,T Matsumura,S Nozaki,et al. A case of Duchenne muscular dystrophy showing coagulation cascade activation induced by muscle destruction due to convulsion (in Japanese). Clinica Neurol,2003,43 :274-276.
[3] K Arahata,S Ishiura,T Ishiguro,et al. Immunostaining of skeletal and cardiac muscle surface membrane with antibody against Duchenne muscular dystrophy peptide.Nature,1988,333 : 861-863.
[4] E Bonilla,CE Samitt,AF Miranda,et al. Duchenne muscular dystrophy: deficiency of dystrophin at the muscle cell surface. Cell,1988,54:447-452.
[5] A Germani,A Di Carlo,A Mangoni,et al. Vascular endothelial growth factor modulates skeletal myoblast function. Am J Pathol,2003,163 :1417-1428.
[6] M Sander,B Chavoshan,SA Harris,ST Iannaccone,et al. Functional muscle ischemia in neuronal nitric oxide synthase-deficient skeletal muscle of children with Duchenne muscular dystrophy. PNAS 2000,97: 13818-13823.
[7] F Luo,D Wariaro,G Lundberg,et al. Vascular growth factor expression in a rat model of severe limb ischemia. J Surg Res,2002,108 :258-267.
[8] E Hashimoto,T Ogita,T Nakaoka,et al. Kira,Rapid induction of vascular endothelial growth factor expression by transient ischemia in rat heart. Am J Physiol,1994,267 :1948-1954.