研究背景与目的手足口病是肠道病毒71型(EV71)以及柯萨奇A组16型(CoxA16)等引起的急性传染病,多发生于学龄前儿童,尤其以3岁年龄组发病率最高。病人和隐性感染者均可能为传染源,主要通过消化道、呼吸道和密切接触等途径传播。手足口病的临床表现多为发热以及在手、足、口等各部位出现的皮肤或黏膜疱疹。大多数情况病情较轻,但有少数患者可发生脑干脑炎、急性弛缓性麻痹、致命性肺水肿等严重的神经系统和心肺功能并发症。不同病毒型感染的手足口病决定了疾病的严重程度,其中EV71所致手足口病最为严重,易导致重症病例,甚至死亡。1969年,世界范围内首次确定EV71是造成儿童神经性疾病的主要致病因素,随后在保加利亚、匈牙利、台湾和东南亚其它国家流行。我国大陆地区自1981年首次在上海发现第一例手足口病病例至今,发病呈逐年上升趋势,自2008年以来,手足口病报告病例仍居丙类传染病首位。因此对于 EV71的研究,特别是其所致手足口病的流行病学特征,易感人群的保护和传播途径的研究起到决定性作用。目前,手足口病的主要预防控制方法是阻止病毒传播,防止严重并发症和死亡,开发新型疫苗以及抗病毒药物被认为是有效预防与控制手足口病的方法。考虑到EV71的重要公共卫生意义,一些亚洲国家及地区开始进行EV71相关疫苗的研发。中国大陆地区三家疫苗生产公司完成了三期临床试验,另外的两家来自于中国台湾地区及新加坡的两家公司完成了一期临床试验。本研究基于北京微谷生物医药有限公司研发的EV71全病毒灭活疫苗开展Ⅲ期疫苗临床试验,并对受试者采取总计两年的随访研究,并获得长时间段的随访数据。EV71全病毒灭活疫苗在临床试验中显示出对与EV71相关疾病的显着功效,并提出1:16-1:32的中和抗体滴度作为疫苗的相关性保护。本文旨探索更适合的确定免疫学替代终点的方法以进一步评价灭活EV71疫苗的免疫替代终点。研究内容和方法免疫学替代终点是介导疫苗接种后产生保护效应因果链上的免疫学反应指标,该免疫学反应指标与研究的临床终点事件相关,且可以预测疫苗的保护效力。同时,免疫学替代终点在临床试验中的应用可有效降低样本量,缩短随访时间,从而降低研究成本。EV71全病毒灭活疫苗Ⅲ期临床试验采用随机,双盲,安慰剂对照方法于2012年1月正式启动,受试者分别来自于4地区6至35月龄的儿童。随访阶段可疑病例均由各研究中心的实验室通过实时定量荧光PCR(RT-PCR)以及病毒RNA诊断试剂盒测定。本研究基于EV71 Ⅲ期临床试验一年期(12个月)、二年期(24个月)的随访数据分别进行数据分析并分别采用非线性混合效应模型以及绝对S型曲线函数对EV71疫苗免疫学替代终点指标进行评估。受样本量以及低发病率影响,采用Bootstrap方法扩增样木不同倍数后进行200次不确定性分析,分析数据模拟方法的不确定性,获得保护性曲线的95%置信区间。研究结果(1)本研究数据均符合PRENTICE准则可进一步开展免疫学替代终点研究。(2)Logistic回归结果显示,第56天中和抗体滴度与疾病发生呈高度相关(P<0.0001),免前(接种疫苗前)中和抗体滴度水平分组符合Logistic回归纳入标准,其它自变量均排除出回归模型。(3)基于一年期随访数据的非线性混合效应模型结果显示:免前中和抗体滴度呈阴性的人群,中和抗体滴度达到26.6U/ml约等于1:30时,1年期保护概率可达50%。与之相比的免前中和抗体滴度呈阳性的人群只需要2.2U/ml(仅局限于统计学模型)即可达到50%保护概率,同时对于该人群,假设第56天中和抗体水平达到26.6U/ml时,一年期保护概率可达到80%以上。(4)基于两年期随访数据的绝对S型曲线结果显示:当免后56天中和抗体达到36.2U/ml约等于中和抗体滴度1:42时,两年期保护概率可达到50%。(5)Bootstrap不确定分析结果显示,当样本扩增倍数为20～40倍时,模拟数据逐渐趋于稳定。由于样本的扩增,模型的95%区间曲线收敛效果更好,但是样本量的大小只会影响模型曲线的95%区间范围,而不影响模型的稳定性。研究结论本研究致力于建立免疫替代终点与EV71所致相关疾病之间的关系。在研究过程中,我们发现EV71疫苗免疫学替代终点的估计不仅受疫苗接种前中和抗体水平影响,还受疫苗保护时间影响。对于中和抗体基线水平小于1:8的儿童,我们建议的EV71免疫学替代终点值为26.6U/ml(1:30),一年期保护概率可达到50%,对于中和抗体基线水平大于等于1:8的儿童,这一免疫学替代终点值所提供的一年期保护概率可超过80%。同时,免后第56天中和抗体滴度水平1:16-1:32作为免疫学替代终点可能不足以提供长期保护。