【摘 要】
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目的:建立并优化SYBR GreenⅠ实时RT-PCR体系,定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA.方法:用TRIzol分别提取人、小鼠成熟精子中的总RNA,逆转录后用SYBR Green Ⅰ实时PC
【机 构】
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华中科技大学同济医学院计划生育研究所
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目的:建立并优化SYBR GreenⅠ实时RT-PCR体系,定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA.方法:用TRIzol分别提取人、小鼠成熟精子中的总RNA,逆转录后用SYBR Green Ⅰ实时PCR定量检测CatSper1 mRNA.SYBR Green Ⅰ实时PCR采用普通PCR试剂,加入SYBR Green Ⅰ染料,优化退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例,并在PCR循环时采用四步法以消除引物二聚体的影响.优化完成后用不同浓度的精子cDNA为模板做标准曲线,以检测SYBR GreenⅠ实时PCR的扩增效率.结果:定量检测CatSper1 mRNA的SYBR GreenⅠ实时PCR体系适宜退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例分别为63℃、3.0 mmol/L和1∶1,四步法中采集荧光的温度为88℃.优化后用人和小鼠精子cDNA为模板做标准曲线分别为Y=-3.402log(X)+25.99和Y=-3.409log(X)+24.09,扩增效率分别为96.8%和96.5%,可定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA.结论:用普通的逆转录及PCR系统和试剂,建立了一种方便、廉价、可靠的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR系统,可用于人、小鼠精子中CatSper1 mRNA定量检测.
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