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【中图分类号】R285.5【文献标识码】A【文章编号】1550-1868（2015）04
【摘要】目的：探讨虎杖苷对HepA肝细胞癌小鼠肿瘤生长的抑制作用及及机制研究。方法：50只健康昆明鼠，随机分为5组，分别为正常对照组、肿瘤阴性对照组；虎杖苷低剂量组；虎杖苷高剂量组；环磷酰胺组；复制昆明种小鼠HepA肝癌皮下移植模型成功后，连续灌胃给药14天，于第15天处死，取出肿瘤组织，计算小鼠肿瘤抑制率，取血清检查AFU、AFP水平，HE染色对肿瘤细胞形态进行观察，以及免疫组化法检测小鼠肿瘤凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达；对TNF-α、IL-2细胞因子以ELISA方法进行检测。结果：结果虎杖苷高剂量组、虎杖苷低剂量组都可以显著的抑制HepA肝细胞瘤小鼠肿瘤的生长。肿瘤抑制率分别为52.36%和42.79%，AFU、AFP检验结果与虎杖苷剂量成反比；虎杖苷可以明显提高小鼠血清中抗肿瘤因子TNF-α和白细胞介素2的含量，提高程度与虎杖苷口服的剂量呈正相关，HE染色结果可见，经过CTX和虎杖苷处理后，肿瘤细胞数目明显的减少，核染色质聚集于核膜边缘。核型不规则，核膜表面粗糙，核碎裂但被核膜包绕，出现凋亡小体，和对照组相比出现更多的凋亡细胞。虎杖苷降低肝癌小鼠肿瘤Bcl-2蛋白的含量，同时显著提高小鼠肝细胞瘤中Bax蛋白含量的表达。结论：1. 虎杖苷对HepA肝癌小鼠肿瘤生长有明显抑制作用。2.可以降低小鼠肝脏HepA肿瘤AFU、AFP水平。3. 虎杖苷诱导小鼠肿瘤细胞凋亡，其主要机制与调节Bcl-2和Bax蛋白表达有关。
虎杖苷（Polydatin，PD）是从蓼科蓼属— — 虎杖（Polygonum Cuspidatum Sieb.et Zucc）经过干燥处理的根茎中提取的第四种单体结晶，所以又被人们称为虎杖结晶四号；还被称为白藜芦醇苷，虎杖苷主要在植物中含量较大，多数植物中都含有虎杖苷，虎杖苷本身具有非常强的生物活性。现代药理学的各种实验研究证明，虎杖苷对人类的血管平滑肌细胞、心肌细胞、抗血小板凝集、改善微血管循环等有明显的作用，另外还能减轻物理因素、化学因素、生物因素等造成的组织器官细胞损伤。
研究应用小鼠肝癌细胞株HepA建立肝细胞癌移植瘤模型，应用免疫组化，HE染色，生物化学指标检测、细胞因子检测等先进的试验方法从肝癌细胞的形态凋亡为出发点，研究虎杖苷诱导肝细胞癌凋亡作用，充分的研究虎杖苷抗肝细胞癌的潜力，为虎杖苷的抗肝癌临床应用提供有力的证据。
1、材料与方法
康昆明种小鼠，60只，为正常对照组、阴性对照组、虎杖苷低剂量组、虎杖苷高剂量、环磷酰胺组。10只小鼠用于制备小鼠肝癌腹水瘤。
10只小鼠腹腔接种HepA肿瘤细胞，制备为HepA腹水瘤小鼠模型。每日观察，待1周后小鼠腹水明显，断颈髓处死小鼠，75%乙醇浸泡消毒，抽取腹腔液5ml，与5ml生理盐水混匀，用适量的生理盐水调节，使细胞达到1×107个/ ml，待用。
小鼠右前肢腋下以5×106个/ ml浓度的HepA细胞悬液接种至皮下，0.2ml/只，共40只，随机分为4组，每组10只，24h后给予不同药物处理，每日称重，观察。
2.动物处理及给药
正常对照组-------- 不接种肿瘤细胞不给于处理
肿瘤阴性对照组 -------- 以生理盐水每日灌胃（0.2ml/天）
虎杖苷低剂量组--------虎杖苷50mg/kg体重每日灌胃0.2ml
虎杖苷高剂量组--------虎杖苷150mg/kg体重每日灌胃0.2ml
环磷酰胺对照组--------10mg /kg体重每日灌胃0.2ml
3.指标检测
（1）肿瘤抑制率：取肿瘤组织，称重，按公式计算肿瘤抑制率
（2） AFU、AFP检测：药物处理第15天后，取小鼠外周血。分离血清，检测AFU、AFP水平，按照试剂盒说明书操作。
（3） HE染色对肿瘤细胞形态的观察
统计学方法：
试验数据以均数±标准差表示，应用SPSS12.0软件进行统计学处理，组间差异的显著性先进行完全随机设计的方差分析，不同组间的均数用Duncan’s 多范围检验，p<0.05被认为有统计学意义。
结果
讨论：表1中我们可以看出虽然环磷酰胺抑制肿瘤效果虽强于高剂量虎杖苷组和低剂量虎杖苷组，但喂养环磷酰胺药物组的小鼠体重和生活质量明显低于其他各组小鼠的生活质量，毛色亮度与光滑程度均差于其他各组，说明环磷酰胺对肝细胞肿瘤有一定的治疗同时也对其他脏器组织有不同程度的伤害，但虎杖苷组的小鼠体重无明显变化。说明中药组对肿瘤的抑制作用与环磷酰胺用药组对肝细胞肿瘤的抑制作用相同。虎杖苷高剂量组和虎杖苷低剂量的小鼠肿瘤重量、小鼠肿瘤抑制率、肿瘤细胞死亡率、小鼠体重进行比较统计学上具有统计学上的差异（p<0.05），说明在一定范围内虎杖苷的剂量对小鼠肿瘤的抑制成正比。但虎杖苷高剂量组与虎杖苷低剂量组的各项抑制肿瘤指标与环磷酰胺组存在差异。
为了证明虎杖苷对肝细胞肿瘤的抑制杀伤作用，我们还选取的常用的检验指标AFP AFU，这两项指标是诊断原发性肝细胞癌的指标，AFP、AFU是目前医疗界最常用的诊断和观察原发性肝癌治疗疗效的指标，特别是AFP的浓度可以直接反映肝细胞癌的大小和严重程度及治疗效果，通过实验我们可以得出，虎杖苷高剂量组、虎杖苷低剂量组、环磷酰胺用药组对小鼠肝细胞模型对照组比较P<0.01。小鼠肝细胞肿瘤的检测指标AFU、AFP 均有较大的差异，说明虎杖苷、环磷酰胺均可以有效的降低小鼠肝细胞癌的诊断指标，达到对小鼠肝细胞瘤的抑制作用。
肿瘤坏死因子与白细胞介素-2对肿瘤具有抑制作用，通过结果我们可以看出虎杖苷可以诱导细胞产生肿瘤坏死因子与白细胞介素2，通过统计分析虎杖苷高剂量组与阴性对照组比较肿瘤坏死因子与白细胞介素2明显增高，具有统计学意义。这说明虎杖苷可以通过诱导体内肿瘤坏死因子-α和白细胞介素2的产生来抑制肿瘤细胞的生长，在一定剂量内虎杖苷与肿瘤坏死因子-α和白细胞介素2的产生成正相关性。而环磷酰胺与肿瘤模型对照组比较P>0.05无统计学意义，说明环磷酰胺不是通过诱导小鼠体内产生瘤坏死因子-α和白细胞介素2而发挥抗肿瘤作用。
HE染色结果表明，肿瘤细胞数目明显的减少，核染色质聚集于核膜边缘。核型不规则，核膜表面粗糙，核碎裂但被核膜包绕，出现凋亡小体，和对照组相比出现更多的凋亡细胞，证明虎杖苷能诱导肝癌细胞的凋亡。
通过试验结果，我们可以看出，虎杖苷高剂量组、虎杖苷低剂量组相对于肿瘤对照组有明显的抑制肝细胞肿瘤作用，Bcl-2与Bax的比值排序为：生理盐水组大于环磷酰胺组大于虎杖苷低剂量组大于虎杖苷高剂量组。说明虎杖苷具有明显通过抑制肿瘤内Bcl-2的含量和增加肿瘤瘤内Bax的含量的抑制肝肿瘤的作用。
结 论
1 虎杖苷对HepA肝癌小鼠肿瘤生长有明显抑制作用
2 虎杖苷可以降低小鼠肝脏HepA肿瘤AFU、AFP水平。
3 虎杖苷诱导小鼠肿瘤细胞凋亡，其主要机制与调节Bcl-2和Bax蛋白表达有关。
【摘要】目的：探讨虎杖苷对HepA肝细胞癌小鼠肿瘤生长的抑制作用及及机制研究。方法：50只健康昆明鼠，随机分为5组，分别为正常对照组、肿瘤阴性对照组；虎杖苷低剂量组；虎杖苷高剂量组；环磷酰胺组；复制昆明种小鼠HepA肝癌皮下移植模型成功后，连续灌胃给药14天，于第15天处死，取出肿瘤组织，计算小鼠肿瘤抑制率，取血清检查AFU、AFP水平，HE染色对肿瘤细胞形态进行观察，以及免疫组化法检测小鼠肿瘤凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达；对TNF-α、IL-2细胞因子以ELISA方法进行检测。结果：结果虎杖苷高剂量组、虎杖苷低剂量组都可以显著的抑制HepA肝细胞瘤小鼠肿瘤的生长。肿瘤抑制率分别为52.36%和42.79%，AFU、AFP检验结果与虎杖苷剂量成反比；虎杖苷可以明显提高小鼠血清中抗肿瘤因子TNF-α和白细胞介素2的含量，提高程度与虎杖苷口服的剂量呈正相关，HE染色结果可见，经过CTX和虎杖苷处理后，肿瘤细胞数目明显的减少，核染色质聚集于核膜边缘。核型不规则，核膜表面粗糙，核碎裂但被核膜包绕，出现凋亡小体，和对照组相比出现更多的凋亡细胞。虎杖苷降低肝癌小鼠肿瘤Bcl-2蛋白的含量，同时显著提高小鼠肝细胞瘤中Bax蛋白含量的表达。结论：1. 虎杖苷对HepA肝癌小鼠肿瘤生长有明显抑制作用。2.可以降低小鼠肝脏HepA肿瘤AFU、AFP水平。3. 虎杖苷诱导小鼠肿瘤细胞凋亡，其主要机制与调节Bcl-2和Bax蛋白表达有关。
虎杖苷（Polydatin，PD）是从蓼科蓼属— — 虎杖（Polygonum Cuspidatum Sieb.et Zucc）经过干燥处理的根茎中提取的第四种单体结晶，所以又被人们称为虎杖结晶四号；还被称为白藜芦醇苷，虎杖苷主要在植物中含量较大，多数植物中都含有虎杖苷，虎杖苷本身具有非常强的生物活性。现代药理学的各种实验研究证明，虎杖苷对人类的血管平滑肌细胞、心肌细胞、抗血小板凝集、改善微血管循环等有明显的作用，另外还能减轻物理因素、化学因素、生物因素等造成的组织器官细胞损伤。
研究应用小鼠肝癌细胞株HepA建立肝细胞癌移植瘤模型，应用免疫组化，HE染色，生物化学指标检测、细胞因子检测等先进的试验方法从肝癌细胞的形态凋亡为出发点，研究虎杖苷诱导肝细胞癌凋亡作用，充分的研究虎杖苷抗肝细胞癌的潜力，为虎杖苷的抗肝癌临床应用提供有力的证据。
1、材料与方法
康昆明种小鼠，60只，为正常对照组、阴性对照组、虎杖苷低剂量组、虎杖苷高剂量、环磷酰胺组。10只小鼠用于制备小鼠肝癌腹水瘤。
10只小鼠腹腔接种HepA肿瘤细胞，制备为HepA腹水瘤小鼠模型。每日观察，待1周后小鼠腹水明显，断颈髓处死小鼠，75%乙醇浸泡消毒，抽取腹腔液5ml，与5ml生理盐水混匀，用适量的生理盐水调节，使细胞达到1×107个/ ml，待用。
小鼠右前肢腋下以5×106个/ ml浓度的HepA细胞悬液接种至皮下，0.2ml/只，共40只，随机分为4组，每组10只，24h后给予不同药物处理，每日称重，观察。
2.动物处理及给药
正常对照组-------- 不接种肿瘤细胞不给于处理
肿瘤阴性对照组 -------- 以生理盐水每日灌胃（0.2ml/天）
虎杖苷低剂量组--------虎杖苷50mg/kg体重每日灌胃0.2ml
虎杖苷高剂量组--------虎杖苷150mg/kg体重每日灌胃0.2ml
环磷酰胺对照组--------10mg /kg体重每日灌胃0.2ml
3.指标检测
（1）肿瘤抑制率：取肿瘤组织，称重，按公式计算肿瘤抑制率
（2） AFU、AFP检测：药物处理第15天后，取小鼠外周血。分离血清，检测AFU、AFP水平，按照试剂盒说明书操作。
（3） HE染色对肿瘤细胞形态的观察
统计学方法：
试验数据以均数±标准差表示，应用SPSS12.0软件进行统计学处理，组间差异的显著性先进行完全随机设计的方差分析，不同组间的均数用Duncan’s 多范围检验，p<0.05被认为有统计学意义。
结果
讨论：表1中我们可以看出虽然环磷酰胺抑制肿瘤效果虽强于高剂量虎杖苷组和低剂量虎杖苷组，但喂养环磷酰胺药物组的小鼠体重和生活质量明显低于其他各组小鼠的生活质量，毛色亮度与光滑程度均差于其他各组，说明环磷酰胺对肝细胞肿瘤有一定的治疗同时也对其他脏器组织有不同程度的伤害，但虎杖苷组的小鼠体重无明显变化。说明中药组对肿瘤的抑制作用与环磷酰胺用药组对肝细胞肿瘤的抑制作用相同。虎杖苷高剂量组和虎杖苷低剂量的小鼠肿瘤重量、小鼠肿瘤抑制率、肿瘤细胞死亡率、小鼠体重进行比较统计学上具有统计学上的差异（p<0.05），说明在一定范围内虎杖苷的剂量对小鼠肿瘤的抑制成正比。但虎杖苷高剂量组与虎杖苷低剂量组的各项抑制肿瘤指标与环磷酰胺组存在差异。
为了证明虎杖苷对肝细胞肿瘤的抑制杀伤作用，我们还选取的常用的检验指标AFP AFU，这两项指标是诊断原发性肝细胞癌的指标，AFP、AFU是目前医疗界最常用的诊断和观察原发性肝癌治疗疗效的指标，特别是AFP的浓度可以直接反映肝细胞癌的大小和严重程度及治疗效果，通过实验我们可以得出，虎杖苷高剂量组、虎杖苷低剂量组、环磷酰胺用药组对小鼠肝细胞模型对照组比较P<0.01。小鼠肝细胞肿瘤的检测指标AFU、AFP 均有较大的差异，说明虎杖苷、环磷酰胺均可以有效的降低小鼠肝细胞癌的诊断指标，达到对小鼠肝细胞瘤的抑制作用。
肿瘤坏死因子与白细胞介素-2对肿瘤具有抑制作用，通过结果我们可以看出虎杖苷可以诱导细胞产生肿瘤坏死因子与白细胞介素2，通过统计分析虎杖苷高剂量组与阴性对照组比较肿瘤坏死因子与白细胞介素2明显增高，具有统计学意义。这说明虎杖苷可以通过诱导体内肿瘤坏死因子-α和白细胞介素2的产生来抑制肿瘤细胞的生长，在一定剂量内虎杖苷与肿瘤坏死因子-α和白细胞介素2的产生成正相关性。而环磷酰胺与肿瘤模型对照组比较P>0.05无统计学意义，说明环磷酰胺不是通过诱导小鼠体内产生瘤坏死因子-α和白细胞介素2而发挥抗肿瘤作用。
HE染色结果表明，肿瘤细胞数目明显的减少，核染色质聚集于核膜边缘。核型不规则，核膜表面粗糙，核碎裂但被核膜包绕，出现凋亡小体，和对照组相比出现更多的凋亡细胞，证明虎杖苷能诱导肝癌细胞的凋亡。
通过试验结果，我们可以看出，虎杖苷高剂量组、虎杖苷低剂量组相对于肿瘤对照组有明显的抑制肝细胞肿瘤作用，Bcl-2与Bax的比值排序为：生理盐水组大于环磷酰胺组大于虎杖苷低剂量组大于虎杖苷高剂量组。说明虎杖苷具有明显通过抑制肿瘤内Bcl-2的含量和增加肿瘤瘤内Bax的含量的抑制肝肿瘤的作用。
结 论
1 虎杖苷对HepA肝癌小鼠肿瘤生长有明显抑制作用
2 虎杖苷可以降低小鼠肝脏HepA肿瘤AFU、AFP水平。
3 虎杖苷诱导小鼠肿瘤细胞凋亡，其主要机制与调节Bcl-2和Bax蛋白表达有关。