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【内容摘要】：在小麦高感品种川麦28、80-8、95-71、铭贤169和慢锈品种北京平原50、川麦107六个品种的4-5叶期接种条锈菌条中32号。通过不同品种接种后接种病叶与未接种叶片氧化物酶同工酶和酯酶酶谱变化分析发现：小麦感染条锈菌后各个品种酯酶同工酶酶谱变化较大，但感锈品种和慢锈品种间酶谱变化规律无明显差异；条锈病菌侵染植株后，感病品种过氧化物酶同工酶酶谱变化不大，仅在谱带深浅上有所差异，慢锈品种中川麦107变化较大，感病后酶活性大大增强，而北京平原50变化较小。从结果可看出慢锈性与酯酶同工酶无特定的相关性，而过氧化物酶同工酶与慢锈性可能具有一定的关系，需进一步的研究来确定它们间是否具有相关性。
【关键词】：小麦条锈病 慢锈 过氧化物酶同工酶 酯酶同工酶 电泳
小麦条锈病是我国许多麦区的重要病害之一。除了化学防治小麦条锈病外，小麦抗病品种的选育和推广是防治条锈病最经济、有效和对环境友善的途径。植物抗病性中一部分呈感病反应，但感病程度较轻，病情发展速度较为迟缓，常常被称为部分抗性。慢锈性属于部分抗性，具有慢锈性的品种，虽然表现为感病反应，但在田间自然情况下能降低锈病流行速度。慢锈性由于其抗锈性稳定和持久，小种专化性弱或无小种专化性，保产效果明显等特点，越来越受到多数研究者的重视。慢锈性的研究成为小麦条锈病防治的重要途径之一，选育慢锈性品种，将为研究抑制病菌群体致病性变异的策略提供依据，具有广泛的应用前景。
同工酶是指催化相同生化反应而与酶蛋白结构不同的一类酶，也可解释为对一个材料进行电泳和组织化学染色后在凝胶上看到的一组带，是催化同一生化反应的、在电场中的运动性质有所不同的酶的多种形式。过氧化物酶和酯酶同工酶广泛存在与植物体内，参与植株的新陈代谢。目前，对于小麦抗病性同工酶的研究主要是小麦低反应型抗性品种感染锈病后同工酶酶活性的变化，而关于同工酶与慢锈的关系国内少有报道。本试验利用聚丙烯酰胺凝胶电泳研究条锈菌侵染后感病品种与慢锈品种叶片内过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶酶谱变化情况，确定同工酶与慢锈性是否具有相关性。
1 材料与方法
1.1供试品种及来源
高感品种川麦28、80-8、95-71、铭贤169和慢锈品种北京平原50、川麦107[11]，其中铭贤169和北京平原50由中国农科院植保所提供，川麦28、80-8、95-71和川麦107由四川省农科院作物所提供。
条锈病菌菌株32号由甘肃省农科院植物保护研究麦病组繁殖、提供。
1.2田间播种、接种与取样
2013年11月5日，将小麦各品种分行小麦播种与播种于攀枝花学院试验基地，行宽2米，间距40公分，每品种重复三次。12月31日，在小麦4-5叶期，将条锈菌条中32号接种于心叶口内。2月15日，接种叶片发病后，取不同品种接种后发病病叶与未接种无病的叶片，于-20℃保存。
1.3样品制备
取叶片0.5g于预冷的研钵中，加入1ml蒸馏水研磨和适量石英砂，磨碎后加2ml 40%蔗糖，1200r/min 离心5min ， 取上清液分装，于-20°C备用。
1.5电泳及染色
1.5.1凝胶配制
分离胶采用凝胶浓度T=10%，交联度C=2.6%的分离胶总体积为45ml 其中：38.9%Acr-1.1%Bis储液：1mol/lTris-HClpH8.8缓冲液：蒸馏水：1%过硫酸铵：TEMED=11.25ml：28.575ml：4.05ml： 1.125ml： 78.75ul。浓缩胶采用凝胶浓度T=4%，交联度C=2.6%的浓缩胶总体积为15ml 其中：30%Acr-0.8%Bis储液：1mol/HCl pH6.8 缓冲液：蒸馏水：1%过硫酸铵：TEMED=1.95ml：1.95ml： 9.6ml：1.5ml：15ul
1.5.2电极缓冲液的配制
甘氨酸 7.05g，Tris-HCl 1.5g，水1L，调pH至8.3。
1.5.3上样及电泳
上样20ul，在电泳槽里加5ml溴酚兰，在0-4℃进行电泳。浓缩胶时电压为70V，进入分离胶，电压调整为140V，指示剂到达底部时结束电泳。
1.5.4染色
POD采用改良联苯胺法。EST采用醋酸萘酯-坚牢蓝RR法。
2 结果与分析
2.1 POD同工酶图谱
从电泳结果的图谱看，小麦同工酶酶谱可以分为3个区，即慢带区（A），中带区（B）和快带区（C）。慢带区数量多，颜色深，中带区数量少，带窄，颜色浅，快带区间于二者之间。感病品种发病叶片和未发病叶片谱带基本一致，只在酶活性上有所差异。川麦28发病和未发病酶一致，均为10条。80-8发病和未发病酶谱一致，均为9条。95-71发病和未发病谱带一致均为10条。铭贤169发病和未发病谱带均为9条，发病叶片谱带慢带区的3条和第5条颜色较未发病浅。而两个慢锈品种有所差异。北京平原50酶谱均为9条，发病品种慢带区第五条带颜色变浅。川麦107酶谱差异大，发病叶片慢带区有四条谱带，比未发病叶片多一条，中带区有一条，而未发病叶片中带区无酶带。
不同供试品种酶带存在差异。慢带区川麦28酶带最多有6条，川麦107和80-8为4条，其它均为5条。中带区除川麦107有一条，其它均为2条。快带区川麦107、80-8、95-71有3条酶带，其余为2条。
以上结果表明，条锈病菌侵染植株后，感病品种POD同工酶变化不大，而慢锈品种有所变化。
图1不同品种POD同工酶酶谱和模式图。1-12分别为发病川麦28，未发病川麦28，发病北京平原50，未发病北京平原50，发病川麦107，未发病川麦107，发病80-8，未发病80-8，发病95-71，未发病95-71，发病铭贤169，未发病铭贤169 2 2EST同工酶酶谱
从图2可看出，EST同工酶酶带均为4-6条，不同品种发病和未发病叶片酶谱均有差异。川麦28、川麦107、95-71三个品种发病叶片比未发病多一条酶谱，北京平原50发病比未发病少一条酶带，80-8和铭贤169发病叶片和未发病叶片虽酶带总数一样，但酶带位置不同。不仅酶带数有差异，颜色深浅也存在差异。80-8发病叶速度最快的带为浅色，而未发病的为深色，铭贤169发病叶片第二条带颜色深，未发病叶缺少此带但在速度最快处又多了一条颜色较深的带。与感锈品种相比，北京平原50酶谱区别不大，而川麦107酶谱有明显区别，它第一和第二条带色极浅，其它品种第一和第二条带色都深，它速度最快的带色也浅。
该结果表明，小麦感染条锈菌后EST酶谱变化较大，感锈品种和慢锈品种间酶谱变化规律无明显差异。
图2不同品种EST同工酶酶谱。1-12分别为发病川麦28，未发病川麦28，发病北京平原50，未发病北京平原50，发病川麦107，未发病川麦107，发病80-8，未发病80-8，发病95-71，未发病95-71，发病铭贤169，未发病铭贤169
3 结论与讨论
POD普遍存在于植物体内，是植物次生防御酶系的重要酶之一。它可以使O2、H2O2等转化为活性较低的物质，消除植物体内生物氧化产生的有毒物质，使植物组织及细胞得到保护。有研究表明，植物体内过氧化物及其同工酶与植物的抗病性有关。病菌侵染植物组织后刺激植株内部产生一些特殊的代谢变化，导致其POD同工酶谱产生相应变化。于孝如等（1993）研究发现小麦抗条锈品种POD同工酶活性高于感病品种。本次的试验结果表明，在条锈菌侵染小麦后，感病品种POD同工酶酶谱变化不大，仅在颜色上有所差异；慢条锈品种中，北京平原50感病与对照的POD同工酶差别不大，但在小川麦107中差别明显，发病后酶活性大大增强。这在一定程度上说明用POD同工酶与抗锈性可能具有一定的相关性。小麦与病原互作是连续的动态变化的过程；本次试验只在某一时间点，病斑出现后的病斑扩展和产孢时期，对小麦抗病性进行分析；本次实验在小麦4～5叶期进行，只能反映不同小麦品种某一特定阶段代谢方面的差异，而慢条锈性在小麦成株期表现更为显著，因此有必要对不同抗性小麦品种成株期的同工酶进行研究。同时，此次实验只用了两个慢锈品种，今后因注意选用更多品种，以扩大其代表性。因此，过氧化物酶同工酶电泳中酶带的变化是否与小麦的慢条锈性有关，有待进一步的研究。可进一步测序转化成DNA、RNA指标，或着用血清学方法检验。
EST同工酶是催化酯类化合物水解酶的酶系。它催化羧酸酯类的酯键的水解或合成，EST存在于植物各部位和不同发育时期的细胞中，主要分布在细胞质的球粒内，对于酯代谢和生物膜的结构与功能具有一定作用。由于它们能水解大量非生理存在的酯类化合物，包括一些药物，因此认为有去毒作用，可能与抗性有关。从本试验结果看，条锈菌侵入小麦后，EST变化较大，但慢锈品种不具特异性，不能作为慢锈性鉴定的指标。
【参考文献】；
[1]万安民.小麦条锈病的发生状况和研究现状.世界农业，2000（5）：39～40
[2]姚革，蒋滨，田承权等.四川省小麦条锈病持续流行原因及防治对策.西南农业学报，2004，17（2）：253～256
[3]李振岐，曾士迈.中国小麦条锈病.北京：中国农业出版社，2002
[4]曾士迈，王沛有，张万义等.小麦对条锈病的水平抗病性研究初报.植物保护学报，1979，6（1）：1～10
[5]胡能书，万贤国.同工酶技术及其应用. 湖南：湖南科学技术出版社，1986
[6]康振生，李振岐，刘松洁.洛夫林10抗条锈性与过氧化物酶活性关系初探.西北农业大学学报，1987，15（1）：19～23
[7]王凤乐.小麦条锈菌同工酶分析与受侵小麦酚类代谢关键酶病理变化研究.陕西：西北农业大学植保系，1990
[8]杨祖俐，罗明诚，颜济.四川小麦地方品种的酯酶与过氧化物酶同工酶研究.四川农业大学学报，1992，10（1）：105-112
[9]王智炘，汪宜萱.在叶锈菌侵染过程中小麦过氧化物酶同工酶的变化.植物保护学报，1989，15（2）：73—76
[10]于孝如，袁文焕，金欣藻等.条锈病菌侵染小麦不同时期过氧化物酶同工酶的变化.西北农业学报，1993，2（2）：27～30
[11]姬红丽.四川省主要小麦品种田间抗条锈性反应及“川麦107”受条锈病菌侵入后蛋白质的变化.重庆市：西南农业大学植物保护学院，2004
[12]孙正海，李跃建，宋明等.南瓜属三个种种质的遗传多样性多样.西南农业学报，2004，17（1）：71～73
[13]徐根娣，刘鹏，钱丽.毛茛属两种植物的过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶的研究.浙江师范大学学报（自然科学版）.2002，25（1）：62～65
【关键词】：小麦条锈病 慢锈 过氧化物酶同工酶 酯酶同工酶 电泳
小麦条锈病是我国许多麦区的重要病害之一。除了化学防治小麦条锈病外，小麦抗病品种的选育和推广是防治条锈病最经济、有效和对环境友善的途径。植物抗病性中一部分呈感病反应，但感病程度较轻，病情发展速度较为迟缓，常常被称为部分抗性。慢锈性属于部分抗性，具有慢锈性的品种，虽然表现为感病反应，但在田间自然情况下能降低锈病流行速度。慢锈性由于其抗锈性稳定和持久，小种专化性弱或无小种专化性，保产效果明显等特点，越来越受到多数研究者的重视。慢锈性的研究成为小麦条锈病防治的重要途径之一，选育慢锈性品种，将为研究抑制病菌群体致病性变异的策略提供依据，具有广泛的应用前景。
同工酶是指催化相同生化反应而与酶蛋白结构不同的一类酶，也可解释为对一个材料进行电泳和组织化学染色后在凝胶上看到的一组带，是催化同一生化反应的、在电场中的运动性质有所不同的酶的多种形式。过氧化物酶和酯酶同工酶广泛存在与植物体内，参与植株的新陈代谢。目前，对于小麦抗病性同工酶的研究主要是小麦低反应型抗性品种感染锈病后同工酶酶活性的变化，而关于同工酶与慢锈的关系国内少有报道。本试验利用聚丙烯酰胺凝胶电泳研究条锈菌侵染后感病品种与慢锈品种叶片内过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶酶谱变化情况，确定同工酶与慢锈性是否具有相关性。
1 材料与方法
1.1供试品种及来源
高感品种川麦28、80-8、95-71、铭贤169和慢锈品种北京平原50、川麦107[11]，其中铭贤169和北京平原50由中国农科院植保所提供，川麦28、80-8、95-71和川麦107由四川省农科院作物所提供。
条锈病菌菌株32号由甘肃省农科院植物保护研究麦病组繁殖、提供。
1.2田间播种、接种与取样
2013年11月5日，将小麦各品种分行小麦播种与播种于攀枝花学院试验基地，行宽2米，间距40公分，每品种重复三次。12月31日，在小麦4-5叶期，将条锈菌条中32号接种于心叶口内。2月15日，接种叶片发病后，取不同品种接种后发病病叶与未接种无病的叶片，于-20℃保存。
1.3样品制备
取叶片0.5g于预冷的研钵中，加入1ml蒸馏水研磨和适量石英砂，磨碎后加2ml 40%蔗糖，1200r/min 离心5min ， 取上清液分装，于-20°C备用。
1.5电泳及染色
1.5.1凝胶配制
分离胶采用凝胶浓度T=10%，交联度C=2.6%的分离胶总体积为45ml 其中：38.9%Acr-1.1%Bis储液：1mol/lTris-HClpH8.8缓冲液：蒸馏水：1%过硫酸铵：TEMED=11.25ml：28.575ml：4.05ml： 1.125ml： 78.75ul。浓缩胶采用凝胶浓度T=4%，交联度C=2.6%的浓缩胶总体积为15ml 其中：30%Acr-0.8%Bis储液：1mol/HCl pH6.8 缓冲液：蒸馏水：1%过硫酸铵：TEMED=1.95ml：1.95ml： 9.6ml：1.5ml：15ul
1.5.2电极缓冲液的配制
甘氨酸 7.05g，Tris-HCl 1.5g，水1L，调pH至8.3。
1.5.3上样及电泳
上样20ul，在电泳槽里加5ml溴酚兰，在0-4℃进行电泳。浓缩胶时电压为70V，进入分离胶，电压调整为140V，指示剂到达底部时结束电泳。
1.5.4染色
POD采用改良联苯胺法。EST采用醋酸萘酯-坚牢蓝RR法。
2 结果与分析
2.1 POD同工酶图谱
从电泳结果的图谱看，小麦同工酶酶谱可以分为3个区，即慢带区（A），中带区（B）和快带区（C）。慢带区数量多，颜色深，中带区数量少，带窄，颜色浅，快带区间于二者之间。感病品种发病叶片和未发病叶片谱带基本一致，只在酶活性上有所差异。川麦28发病和未发病酶一致，均为10条。80-8发病和未发病酶谱一致，均为9条。95-71发病和未发病谱带一致均为10条。铭贤169发病和未发病谱带均为9条，发病叶片谱带慢带区的3条和第5条颜色较未发病浅。而两个慢锈品种有所差异。北京平原50酶谱均为9条，发病品种慢带区第五条带颜色变浅。川麦107酶谱差异大，发病叶片慢带区有四条谱带，比未发病叶片多一条，中带区有一条，而未发病叶片中带区无酶带。
不同供试品种酶带存在差异。慢带区川麦28酶带最多有6条，川麦107和80-8为4条，其它均为5条。中带区除川麦107有一条，其它均为2条。快带区川麦107、80-8、95-71有3条酶带，其余为2条。
以上结果表明，条锈病菌侵染植株后，感病品种POD同工酶变化不大，而慢锈品种有所变化。
图1不同品种POD同工酶酶谱和模式图。1-12分别为发病川麦28，未发病川麦28，发病北京平原50，未发病北京平原50，发病川麦107，未发病川麦107，发病80-8，未发病80-8，发病95-71，未发病95-71，发病铭贤169，未发病铭贤169 2 2EST同工酶酶谱
从图2可看出，EST同工酶酶带均为4-6条，不同品种发病和未发病叶片酶谱均有差异。川麦28、川麦107、95-71三个品种发病叶片比未发病多一条酶谱，北京平原50发病比未发病少一条酶带，80-8和铭贤169发病叶片和未发病叶片虽酶带总数一样，但酶带位置不同。不仅酶带数有差异，颜色深浅也存在差异。80-8发病叶速度最快的带为浅色，而未发病的为深色，铭贤169发病叶片第二条带颜色深，未发病叶缺少此带但在速度最快处又多了一条颜色较深的带。与感锈品种相比，北京平原50酶谱区别不大，而川麦107酶谱有明显区别，它第一和第二条带色极浅，其它品种第一和第二条带色都深，它速度最快的带色也浅。
该结果表明，小麦感染条锈菌后EST酶谱变化较大，感锈品种和慢锈品种间酶谱变化规律无明显差异。
图2不同品种EST同工酶酶谱。1-12分别为发病川麦28，未发病川麦28，发病北京平原50，未发病北京平原50，发病川麦107，未发病川麦107，发病80-8，未发病80-8，发病95-71，未发病95-71，发病铭贤169，未发病铭贤169
3 结论与讨论
POD普遍存在于植物体内，是植物次生防御酶系的重要酶之一。它可以使O2、H2O2等转化为活性较低的物质，消除植物体内生物氧化产生的有毒物质，使植物组织及细胞得到保护。有研究表明，植物体内过氧化物及其同工酶与植物的抗病性有关。病菌侵染植物组织后刺激植株内部产生一些特殊的代谢变化，导致其POD同工酶谱产生相应变化。于孝如等（1993）研究发现小麦抗条锈品种POD同工酶活性高于感病品种。本次的试验结果表明，在条锈菌侵染小麦后，感病品种POD同工酶酶谱变化不大，仅在颜色上有所差异；慢条锈品种中，北京平原50感病与对照的POD同工酶差别不大，但在小川麦107中差别明显，发病后酶活性大大增强。这在一定程度上说明用POD同工酶与抗锈性可能具有一定的相关性。小麦与病原互作是连续的动态变化的过程；本次试验只在某一时间点，病斑出现后的病斑扩展和产孢时期，对小麦抗病性进行分析；本次实验在小麦4～5叶期进行，只能反映不同小麦品种某一特定阶段代谢方面的差异，而慢条锈性在小麦成株期表现更为显著，因此有必要对不同抗性小麦品种成株期的同工酶进行研究。同时，此次实验只用了两个慢锈品种，今后因注意选用更多品种，以扩大其代表性。因此，过氧化物酶同工酶电泳中酶带的变化是否与小麦的慢条锈性有关，有待进一步的研究。可进一步测序转化成DNA、RNA指标，或着用血清学方法检验。
EST同工酶是催化酯类化合物水解酶的酶系。它催化羧酸酯类的酯键的水解或合成，EST存在于植物各部位和不同发育时期的细胞中，主要分布在细胞质的球粒内，对于酯代谢和生物膜的结构与功能具有一定作用。由于它们能水解大量非生理存在的酯类化合物，包括一些药物，因此认为有去毒作用，可能与抗性有关。从本试验结果看，条锈菌侵入小麦后，EST变化较大，但慢锈品种不具特异性，不能作为慢锈性鉴定的指标。
【参考文献】；
[1]万安民.小麦条锈病的发生状况和研究现状.世界农业，2000（5）：39～40
[2]姚革，蒋滨，田承权等.四川省小麦条锈病持续流行原因及防治对策.西南农业学报，2004，17（2）：253～256
[3]李振岐，曾士迈.中国小麦条锈病.北京：中国农业出版社，2002
[4]曾士迈，王沛有，张万义等.小麦对条锈病的水平抗病性研究初报.植物保护学报，1979，6（1）：1～10
[5]胡能书，万贤国.同工酶技术及其应用. 湖南：湖南科学技术出版社，1986
[6]康振生，李振岐，刘松洁.洛夫林10抗条锈性与过氧化物酶活性关系初探.西北农业大学学报，1987，15（1）：19～23
[7]王凤乐.小麦条锈菌同工酶分析与受侵小麦酚类代谢关键酶病理变化研究.陕西：西北农业大学植保系，1990
[8]杨祖俐，罗明诚，颜济.四川小麦地方品种的酯酶与过氧化物酶同工酶研究.四川农业大学学报，1992，10（1）：105-112
[9]王智炘，汪宜萱.在叶锈菌侵染过程中小麦过氧化物酶同工酶的变化.植物保护学报，1989，15（2）：73—76
[10]于孝如，袁文焕，金欣藻等.条锈病菌侵染小麦不同时期过氧化物酶同工酶的变化.西北农业学报，1993，2（2）：27～30
[11]姬红丽.四川省主要小麦品种田间抗条锈性反应及“川麦107”受条锈病菌侵入后蛋白质的变化.重庆市：西南农业大学植物保护学院，2004
[12]孙正海，李跃建，宋明等.南瓜属三个种种质的遗传多样性多样.西南农业学报，2004，17（1）：71～73
[13]徐根娣，刘鹏，钱丽.毛茛属两种植物的过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶的研究.浙江师范大学学报（自然科学版）.2002，25（1）：62～65