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摘要[目的]采用高效液相色谱-串联质谱仪（LCMS/MS），在多反应监测（MRM）模式下建立了四大南药中黄曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）含量的测定方法。[方法]试样中的黄曲霉毒素经甲醇/水（70/30）提取，黄曲霉毒素免疫亲和柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。[结果]该方法的检出限（LOD）为0.2～0.5 μg/kg，线性范围为0～50 μg/L，相关系数R2均大于0.999；在2～50 μg/kg的添加水平上，4种霉菌毒素平均回收率为78.6%～92.1%，相对标准偏差RSD为0.8%～8.4%。[结论]该方法前处理简单、快速，灵敏度、准确度和精密度高。
关键词高效液相色谱-串联质谱；黄曲霉毒素；四大南药；含量
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2014）36-12901-03
Abstract[Objective] The research aimed to develop the determination method of aflatoxin （AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）content in four south medicines in the multiple reaction monitoring （MRM） mode by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （LCMS/MS）. [Method]The drugs were extracted with methanol/water（70/30，V/V），and cleaned up by using beacon aflatoxin column，dissolved in methanol and analysised by LCMS/MS.[Result]The limits of detection（LOD） were 0.2-0.5 μg/kg.The calibration curves were linear between 0 to 50 μg/L，and the correlation coefficient was more than 0.999.The average recoveries ranged from 78.6%-92.1% and RSD was 0.8%-8.4% by addition of 2-50 μg/kg avermectin standards to four south medicines as matrixes. [Conclusion] The proposed method was fast， simple， sensitive and accurate.
Key wordsUPLCMS/MS；Aflatoxin；Four south medicines；Contaminants
槟榔、益智、砂仁、巴戟天为海南盛产的我国四大南药，槟榔用于驱虫清积、引气利尿，益智能温脾暖胃、固本涩精，砂仁是引气和中、开胃消食、止痛安胎之良药，巴戟天则能补气益精、强筋壮骨、祛风除湿。目前，四大南药在临床上应用十分广泛[1]。然而，药材在生产、加工、贮藏、运输的过程中，由于条件和技术简陋，很容易发生霉变而产生黄曲霉毒素（AFT）。
黄曲霉毒素发现于1960 年，毒性为氰化钾的10 倍，砒霜的68 倍。AFT可引起肝脏的急慢性损害，同时还对肾脏等其他多种组织器官造成严重损害，且具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致” 作用[2]。韩国食品医药品安全厅（KFDA）发布了有关中药材中黄曲霉毒素B1限量标准和试验方法的公告，要求甘草、决明子、桃仁等9味中药材黄曲霉毒素B1低于10 μg/kg[3] 。泰国允许黄曲霉毒素B1的限量20 μg/kg[4]，我国原外经贸部WM2-2001《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》[5]中AFT 限量标准为小于5 μg/kg。《中国药典》2010版一部仅对桃仁、胖大海、陈皮等几味药材规定AFB1最高限量5 μg/kg，AF（B1+B2+G1+G2）最高限量为10 μg/kg。目前，黄曲霉毒素的测定方法主要有薄层色谱法（TLC）[6]、高效液相色谱法（HPLC）[7]、酶联免疫吸附分析法（ELISA）[8]以及生物传感器法等。但由于无法对样品进行准确的定性和定量分析，且容易出现假阳性等问题，不能作为最终的确证方法。笔者采用超高效液相色谱串联质谱法测定四大南药中黄曲霉毒素含量，不仅简化了前处理步骤，且大大提高了方法的检出限。
1材料与方法
1.1仪器
Waters ACQUITY UPLCTMTQD MS/MS系统（美国waters）；旋转蒸发仪R205（瑞士BUCHI公司）；超声波清洗器（德国ELMA公司）；涡旋混合器（德国IKA公司）；MilliQ纯水系统（美国Millipore公司）。
1.2试剂乙腈（色谱纯）；甲醇（分析纯）；甲酸（色谱纯）；乙酸（色谱纯）；乙酸铵（色谱纯）；乙酸乙酯（分析纯）；水为二次蒸馏水；黄曲霉毒素免疫亲和柱（柱容量约300 ng 黄曲霉毒素，3 ml）；黄曲霉毒素标准品。
1.3标准溶液的配置称取适量黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准品，分别用甲醇溶解于25 ml容量瓶中，配成100 μg/ml的标准储备液，使用时根据需要以流动相稀释成标准工作液。
分别吸取适量储备溶液（标准溶液）于同一容量瓶中，用甲醇配制成1.0 μg/ml的混合标准中间液，于4 ℃保存。吸取适量上述混合标准中间液，用乙腈配制成不同浓度的标准系列工作液。
1.4黄曲霉毒素的提取
称取5.0 g样品于50 ml 离心管中，加入1 g氯化钠及50 ml 甲醇-水（70∶30，V/V）高速匀浆1 min，用玻璃纤维滤纸过滤，取20 ml上滤液加入10 ml水，摇匀，备用。 1.5提取物的净化
精密吸取滤液15 ml，通过免疫亲合柱（1～2滴/秒），弃去流出液，用10 ml水分2次洗脱，弃去洗脱液，抽干，再用2.0 ml甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液。过0.2 μm滤膜，供LCMS/MS测定。
1.6色谱质谱条件
色谱柱为UPLC ACQUITY BEH，50×2.1 mm，1.7 μm；流动相为乙腈（A）/ 0.1甲酸水溶液（V/V）。梯度洗脱程序为0～1 min，90%A；1.0～2.2 min，90%～50%A；2.2～3.0 min，50%～90%A；3～4 min，90%A保持1 min。流速为0.2 ml/min；柱温40 ℃；进样量10 μl。离子源为ESI，正离子模式；毛细管电压4.0 kV；离子源温度110 ℃；脱溶剂气温度350 ℃；脱溶剂气流量800 L/ hr；锥孔反吹气流量50 L/hr；锥孔电压40 V；扫描方式为多反应监测（MRM）。用于定性、定量的离子对和相关质谱参数如表1所示。
2结果与分析
2.1提取溶剂的选择
在试验过程中，提溶剂的选择直接影响方法的准确度。黄曲霉毒素易溶于甲醇和乙腈，该试验分别选用甲醇、乙腈、水、甲醇/水和乙腈/水作为萃取溶剂。试验证明，用甲醇/水体系比其他溶剂的提取回收率高，比较了甲醇/水在70/30、80/20和90/10时的添加回收率，当甲醇/水为70/30时，4种黄曲霉毒素的回收率最高。所以选取了70/30甲醇/水作为提取溶剂。
2.2液相色谱及质谱条件的选择
用乙腈作为有机相，在流动相中分别加入了0.1%甲酸、0.1%乙酸和10 mM乙酸铵，结果表明乙腈和0.1%甲酸水溶液作梯度洗脱时，能够获得最强的离子丰度，所以最终确定乙腈和0.1%甲酸为流动相。试验中尝试了分别采用正、负2种离子模式，发现正离子模式下的离子化效率明显高于负离子模式。通过全离子扫描（ Full scan）确定4种黄曲霉毒素的选择离子，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合标准溶液的总离子流图如图1所示。
2.4实际样品的检测
从市场采购了槟榔、益智、砂仁、巴戟天4种南药，每种采购3 批，然后按照上述方法测定样品中黄曲霉毒素的含量。结果表明，益智中的黄曲霉毒素含量最高，且所有益智样品中4种黄曲霉毒素的阳性率均为100%，其中AFB1含量最高的为0.81 μg/kg，远低于《中国药典》2010版一部仅对桃仁、胖大海、陈皮等几味药材规定AFB1 最高限量5 μg/kg，而4种黄曲霉毒素总量最高的为10.3 μg/kg，稍高于《中国药典》2010版一部仅对桃仁、胖大海、陈皮等几味药材规定AF（B1+B2+G1+G2）最高限量10 μg/kg。槟榔样品中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的阳性率分别为80%、60%、20%和20%，其中AFB1和AFB2含量最高的分别为1.83和1.44 μg/kg，4种黄曲霉毒素总量最高达856 μg/kg。巴戟天中样品AFB1和AFB2的阳性率均为20%，总量最高为2.01 μg/kg。砂仁样品中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的阳性率均为20%，总量最高为0.56 μg/kg。
3结论
药材在生产、加工、贮藏、运输的过程中，容易发生霉变而产生黄曲霉毒素。我国对外贸易合作部发布的药用植物及制剂进出口绿色行业标准（2001年第4号文）规定部分药材中黄曲霉毒素AFB1≤5 μg/kg；香港特区政府卫生署公布的中药材参考标准中规定黄曲霉毒素AFB1≤5 μg/kg，总量≤10 μg/kg；欧洲药典（EP 6.2）规定黄曲霉毒素AFB1≤2 μg/kg，总量≤4 μg/kg。按照韩国新的许可标准，中药材中黄曲霉毒素AFB1的含量必须低于10 μg/kg。该项目所建立的四大南药中黄曲霉毒素分析方法，该方法的检出限（LOD）为0.2～0.5 μg/kg，完全满足各国规定的药材中黄曲霉毒素的限量要求；线性范围为0～50 μg/L，相关系数R2均大于0999。在2～50 μg/kg的添加水平上，4种霉菌毒素平均回收率为78.6%～92.1%，相对标准偏差RSD为0.8%～84%。利用该方法对四大南药样品进行了分析，样品中黄曲霉毒素AFB1均未超标，但部分药材中黄曲霉毒素总量有超出欧洲药典的限量标准。建议有关部门尽快制定我国药材中黄曲霉毒素AFB1以及总量的限量标准，以加强对药材的管理。
参考文献
[1] 罗盛旭，胡广林，李平.4种南药中微量元素溶出率的研究[J].微量元素与健康研究，2007，24（3）：3-40.
[2] PERAICA M，RAD IC B，LUCIC A，et al.Toxic effects of mycotoxins in humans[J].World Health Organ，1999，77（9）：7541.
[3] 辽宁出入境检验检疫局网站.关于韩国制订中药材中二氧化硫和黄曲霉毒素相关标准事宜的通知[EB/OL].（2008-04-16）[2010-04-01].http：/www.lnciq.gov.cn/ywpd/zwjy/ywbl/czjy/200804 / t20080416_4539.Htm.
[4] 关立忠，陈建民，张宝旭，等.WM2-2001药用植物及制剂进出口绿色行业标准[S/OL].http：//www.doc88.com/p97938168978.html.
[5] TASSANEEYAKUL W，RAZZAZIFAZEL I E，PORASAPHATANA S，et al.Cont aminat ion of af latoxin in herbal medicinal product s in Thailand [J] .Mycopathdogia，2004，158（2）：239-244.
[6] 杨焱，宓晓黎，成恒嵩，等. 薄层扫描法测定饲料中黄曲霉毒素B1的含量[J].饲料工业，1996，17（10）：36-37.
[7] 高志杰.HPLC法同时测定食品中的4种黄曲霉毒素[J].中国卫生检验杂志，2007，17（10）：1803-1804.
[8] 胡德江，赵忠，王清平，等.酶联免疫法检测饲料中黄曲霉毒素[J].新疆畜牧业，2007（3）：19-22.
关键词高效液相色谱-串联质谱；黄曲霉毒素；四大南药；含量
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2014）36-12901-03
Abstract[Objective] The research aimed to develop the determination method of aflatoxin （AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）content in four south medicines in the multiple reaction monitoring （MRM） mode by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （LCMS/MS）. [Method]The drugs were extracted with methanol/water（70/30，V/V），and cleaned up by using beacon aflatoxin column，dissolved in methanol and analysised by LCMS/MS.[Result]The limits of detection（LOD） were 0.2-0.5 μg/kg.The calibration curves were linear between 0 to 50 μg/L，and the correlation coefficient was more than 0.999.The average recoveries ranged from 78.6%-92.1% and RSD was 0.8%-8.4% by addition of 2-50 μg/kg avermectin standards to four south medicines as matrixes. [Conclusion] The proposed method was fast， simple， sensitive and accurate.
Key wordsUPLCMS/MS；Aflatoxin；Four south medicines；Contaminants
槟榔、益智、砂仁、巴戟天为海南盛产的我国四大南药，槟榔用于驱虫清积、引气利尿，益智能温脾暖胃、固本涩精，砂仁是引气和中、开胃消食、止痛安胎之良药，巴戟天则能补气益精、强筋壮骨、祛风除湿。目前，四大南药在临床上应用十分广泛[1]。然而，药材在生产、加工、贮藏、运输的过程中，由于条件和技术简陋，很容易发生霉变而产生黄曲霉毒素（AFT）。
黄曲霉毒素发现于1960 年，毒性为氰化钾的10 倍，砒霜的68 倍。AFT可引起肝脏的急慢性损害，同时还对肾脏等其他多种组织器官造成严重损害，且具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致” 作用[2]。韩国食品医药品安全厅（KFDA）发布了有关中药材中黄曲霉毒素B1限量标准和试验方法的公告，要求甘草、决明子、桃仁等9味中药材黄曲霉毒素B1低于10 μg/kg[3] 。泰国允许黄曲霉毒素B1的限量20 μg/kg[4]，我国原外经贸部WM2-2001《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》[5]中AFT 限量标准为小于5 μg/kg。《中国药典》2010版一部仅对桃仁、胖大海、陈皮等几味药材规定AFB1最高限量5 μg/kg，AF（B1+B2+G1+G2）最高限量为10 μg/kg。目前，黄曲霉毒素的测定方法主要有薄层色谱法（TLC）[6]、高效液相色谱法（HPLC）[7]、酶联免疫吸附分析法（ELISA）[8]以及生物传感器法等。但由于无法对样品进行准确的定性和定量分析，且容易出现假阳性等问题，不能作为最终的确证方法。笔者采用超高效液相色谱串联质谱法测定四大南药中黄曲霉毒素含量，不仅简化了前处理步骤，且大大提高了方法的检出限。
1材料与方法
1.1仪器
Waters ACQUITY UPLCTMTQD MS/MS系统（美国waters）；旋转蒸发仪R205（瑞士BUCHI公司）；超声波清洗器（德国ELMA公司）；涡旋混合器（德国IKA公司）；MilliQ纯水系统（美国Millipore公司）。
1.2试剂乙腈（色谱纯）；甲醇（分析纯）；甲酸（色谱纯）；乙酸（色谱纯）；乙酸铵（色谱纯）；乙酸乙酯（分析纯）；水为二次蒸馏水；黄曲霉毒素免疫亲和柱（柱容量约300 ng 黄曲霉毒素，3 ml）；黄曲霉毒素标准品。
1.3标准溶液的配置称取适量黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准品，分别用甲醇溶解于25 ml容量瓶中，配成100 μg/ml的标准储备液，使用时根据需要以流动相稀释成标准工作液。
分别吸取适量储备溶液（标准溶液）于同一容量瓶中，用甲醇配制成1.0 μg/ml的混合标准中间液，于4 ℃保存。吸取适量上述混合标准中间液，用乙腈配制成不同浓度的标准系列工作液。
1.4黄曲霉毒素的提取
称取5.0 g样品于50 ml 离心管中，加入1 g氯化钠及50 ml 甲醇-水（70∶30，V/V）高速匀浆1 min，用玻璃纤维滤纸过滤，取20 ml上滤液加入10 ml水，摇匀，备用。 1.5提取物的净化
精密吸取滤液15 ml，通过免疫亲合柱（1～2滴/秒），弃去流出液，用10 ml水分2次洗脱，弃去洗脱液，抽干，再用2.0 ml甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液。过0.2 μm滤膜，供LCMS/MS测定。
1.6色谱质谱条件
色谱柱为UPLC ACQUITY BEH，50×2.1 mm，1.7 μm；流动相为乙腈（A）/ 0.1甲酸水溶液（V/V）。梯度洗脱程序为0～1 min，90%A；1.0～2.2 min，90%～50%A；2.2～3.0 min，50%～90%A；3～4 min，90%A保持1 min。流速为0.2 ml/min；柱温40 ℃；进样量10 μl。离子源为ESI，正离子模式；毛细管电压4.0 kV；离子源温度110 ℃；脱溶剂气温度350 ℃；脱溶剂气流量800 L/ hr；锥孔反吹气流量50 L/hr；锥孔电压40 V；扫描方式为多反应监测（MRM）。用于定性、定量的离子对和相关质谱参数如表1所示。
2结果与分析
2.1提取溶剂的选择
在试验过程中，提溶剂的选择直接影响方法的准确度。黄曲霉毒素易溶于甲醇和乙腈，该试验分别选用甲醇、乙腈、水、甲醇/水和乙腈/水作为萃取溶剂。试验证明，用甲醇/水体系比其他溶剂的提取回收率高，比较了甲醇/水在70/30、80/20和90/10时的添加回收率，当甲醇/水为70/30时，4种黄曲霉毒素的回收率最高。所以选取了70/30甲醇/水作为提取溶剂。
2.2液相色谱及质谱条件的选择
用乙腈作为有机相，在流动相中分别加入了0.1%甲酸、0.1%乙酸和10 mM乙酸铵，结果表明乙腈和0.1%甲酸水溶液作梯度洗脱时，能够获得最强的离子丰度，所以最终确定乙腈和0.1%甲酸为流动相。试验中尝试了分别采用正、负2种离子模式，发现正离子模式下的离子化效率明显高于负离子模式。通过全离子扫描（ Full scan）确定4种黄曲霉毒素的选择离子，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合标准溶液的总离子流图如图1所示。
2.4实际样品的检测
从市场采购了槟榔、益智、砂仁、巴戟天4种南药，每种采购3 批，然后按照上述方法测定样品中黄曲霉毒素的含量。结果表明，益智中的黄曲霉毒素含量最高，且所有益智样品中4种黄曲霉毒素的阳性率均为100%，其中AFB1含量最高的为0.81 μg/kg，远低于《中国药典》2010版一部仅对桃仁、胖大海、陈皮等几味药材规定AFB1 最高限量5 μg/kg，而4种黄曲霉毒素总量最高的为10.3 μg/kg，稍高于《中国药典》2010版一部仅对桃仁、胖大海、陈皮等几味药材规定AF（B1+B2+G1+G2）最高限量10 μg/kg。槟榔样品中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的阳性率分别为80%、60%、20%和20%，其中AFB1和AFB2含量最高的分别为1.83和1.44 μg/kg，4种黄曲霉毒素总量最高达856 μg/kg。巴戟天中样品AFB1和AFB2的阳性率均为20%，总量最高为2.01 μg/kg。砂仁样品中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的阳性率均为20%，总量最高为0.56 μg/kg。
3结论
药材在生产、加工、贮藏、运输的过程中，容易发生霉变而产生黄曲霉毒素。我国对外贸易合作部发布的药用植物及制剂进出口绿色行业标准（2001年第4号文）规定部分药材中黄曲霉毒素AFB1≤5 μg/kg；香港特区政府卫生署公布的中药材参考标准中规定黄曲霉毒素AFB1≤5 μg/kg，总量≤10 μg/kg；欧洲药典（EP 6.2）规定黄曲霉毒素AFB1≤2 μg/kg，总量≤4 μg/kg。按照韩国新的许可标准，中药材中黄曲霉毒素AFB1的含量必须低于10 μg/kg。该项目所建立的四大南药中黄曲霉毒素分析方法，该方法的检出限（LOD）为0.2～0.5 μg/kg，完全满足各国规定的药材中黄曲霉毒素的限量要求；线性范围为0～50 μg/L，相关系数R2均大于0999。在2～50 μg/kg的添加水平上，4种霉菌毒素平均回收率为78.6%～92.1%，相对标准偏差RSD为0.8%～84%。利用该方法对四大南药样品进行了分析，样品中黄曲霉毒素AFB1均未超标，但部分药材中黄曲霉毒素总量有超出欧洲药典的限量标准。建议有关部门尽快制定我国药材中黄曲霉毒素AFB1以及总量的限量标准，以加强对药材的管理。
参考文献
[1] 罗盛旭，胡广林，李平.4种南药中微量元素溶出率的研究[J].微量元素与健康研究，2007，24（3）：3-40.
[2] PERAICA M，RAD IC B，LUCIC A，et al.Toxic effects of mycotoxins in humans[J].World Health Organ，1999，77（9）：7541.
[3] 辽宁出入境检验检疫局网站.关于韩国制订中药材中二氧化硫和黄曲霉毒素相关标准事宜的通知[EB/OL].（2008-04-16）[2010-04-01].http：/www.lnciq.gov.cn/ywpd/zwjy/ywbl/czjy/200804 / t20080416_4539.Htm.
[4] 关立忠，陈建民，张宝旭，等.WM2-2001药用植物及制剂进出口绿色行业标准[S/OL].http：//www.doc88.com/p97938168978.html.
[5] TASSANEEYAKUL W，RAZZAZIFAZEL I E，PORASAPHATANA S，et al.Cont aminat ion of af latoxin in herbal medicinal product s in Thailand [J] .Mycopathdogia，2004，158（2）：239-244.
[6] 杨焱，宓晓黎，成恒嵩，等. 薄层扫描法测定饲料中黄曲霉毒素B1的含量[J].饲料工业，1996，17（10）：36-37.
[7] 高志杰.HPLC法同时测定食品中的4种黄曲霉毒素[J].中国卫生检验杂志，2007，17（10）：1803-1804.
[8] 胡德江，赵忠，王清平，等.酶联免疫法检测饲料中黄曲霉毒素[J].新疆畜牧业，2007（3）：19-22.