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摘要：微流控PCR芯片以其卓越的技术革新和进步，逐步进入产业化和市场化的阶段，但是当前仍然面临成本高昂、产业化程度低等困难，制约着微流控芯片的发展。本文从微流控芯片的发展现状出发，提出产业化发展的技术分析和思考。
一、PCR微流控芯片的技术优势
微流控芯片（Microfluidic Chip）是将分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，以自动完成分析全过程。微流控技术是体外诊断领域具有前景的底层技术平台。
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR是核酸检测检测的核心技术。
以微流控芯片实现PCR反应过程，具有明显的技术优势：
1）分析更高效：在PCR检验领域，微流控芯片的微通道具有非常高的传质和传热效率，能够将诊断检测过程缩短至最低 10-15 分钟;
2）精确度/重现度高：商业化微流控PCR精确度和可重现性理论上媲美业内金标准（RT-PCR）;
3）核酸绝对定量检测：微流体数字PCR产品基于微流控和泊松分布原理，可实现核酸的高通量、绝对定量检测;
4）自动集成化：采用微加工机技术，将所需要的微通道集成到一块基板上面，全部检测过程可在芯片内部完成，实现核酸检测全自动化。
二、微流控芯片专利技术情况
祁恒、王立东、刘瑞东、辛海明、等发表的《PCR微流控芯片技术专利分析》，通过对PCR微流控芯片技术的相关专利申请进行检索与分析，对PCR微流控芯片技术的现状、特点和发展趋势进行研究。该文检索截止时间为2020年4月3日，得到所要分析的国内外专利申请样本，共计353件专利（合并同族后为299项专利）。该文的主要结论是：排名前十位的申请人中，除美国佳能生命科学公司以外，其他主要申请人均为国内申请人，包括排名第一的北京工业大学，排名第二的清华大学等等。主要研发方向集中在包含酶、核酸或微生物的测定或检验方法;其所用的组合物或试纸;这种组合物的制备方法;在微生物学方法或酶学方法中的条件反应控制等。
该文的结论是：由于 PCR 微流控芯片技术具有较高的前沿性，全球专利申请总量并不大，但是近些年专利申请量有增加的趋势。由于我国出台了多项与生物芯片技术密切相关的政策，所以近些年关于PCR 微流控芯片技术的专利申请在中国公开的专利数量最多，我国已经成为PCR 微流控芯片技术研究最活跃的国家，而主要创新主体为高校与科研院所。
由此可见，进一步加强对PCR微流控芯片的技术攻关，开发适用于工业化生产的芯片产品，实现微流控芯片技术的推广应用，培育高价值产业，应该具备很好的技术基础。
三、PCR微流控芯片产业化发展的制约因素
3.1生产成本比较高。传统PCR技术成熟，成本较底。PCR微流控芯片生产过程复杂，需要精密的加工，复杂的生产工艺，而且良品率不高。
3.2专利技术壁垒。微流控芯片研发周期长、研发进度慢、研发成本高等因素，产品线也不够丰富，目前应用较为广泛的是荧光免疫類分析仪，核酸检测领域比较少。一些微流控前沿公司设置的一系列专利布局和壁垒的完善，后来的研发企业如果不对细分专利领域进行严加勘察，便很容易被起诉侵权。
3.3应用场景不清晰。PCR微流控芯片主要应用场景的POCT目前技术还不成熟，而高通量PCR实验室产品，则与传统PCR技术相比，具有效果差，耗材费用高等缺点。
四、PCR微流控芯片的关键技术
PCR微流控芯片的关键技术，在于研制可供量产的微流控芯片，设计和优化微流控芯片的结构、布局以及功能，实现前处理和扩增两个主要的技术需求。芯片加样后全密封，保障使用环境无 PCR 实验室分区要求。从样品加入到结果检出小于30分钟。最终芯片可达到移液误差<5%，温度偏差<0.2℃，温度波动<0.1℃。
4.1区域流道设计
设计前处理结构件，包含可封闭的开口用加样、混匀的结构。设计磁珠富集方案，防止内部物质流出污染环境。芯片包含试剂释放区、核酸提取区、液体混合区、预扩增区、检测区及液滴流道，做到控制各种试剂间互不干扰，按程序进入各区域工作。优化芯片运行过程中各步骤的移液准确度、速度等相关参数。
4.2温控系统设计
根据各区域的工作温度需求独立设计芯片的温控模块，计算各部分需要的热容量、导热系数并推导出维持设定温度所需输入的功率，以确保温控的准确度，且不同温区独立控制互不影响。
4.3试剂预存方法
设计各组分试剂的尺寸结构，及相应的条件通透密封结构，使内部试剂可按程序释放至指定区域，建立可在微小结构中预存、冻干、固定化试剂的方法及工艺。
4.4双温区快速PCR反应
在芯片中通过双温区设计实现快速PCR反应。具体是，设置2～3个温区，独立自主控温，恒温期间功率低，无需额外散热，并且可以自主控制液滴移动，让反应液在指定温区中来回运动以实现1～2秒内完成高低温转变，从而大幅缩短反应升降温时间，实现超快速PCR反应。同时减轻了设备重量和功率，各芯片可独立运行，提高了灵活性。
五、PCR微流控芯片的设计和加工
设计和加工微流控芯片是研究的基础所在。根据具体的研究以及实验所需要分析的目的，微流控芯片的结构迥异。主体结构分为上下两层片基，由 PMMA、PDMS、玻璃等材料所制成，其中包括了微通道，微结构、进样口，检测窗等结构单元构成。外围设备有蠕动泵、微量注射泵、温控系统、以及紫外、荧光、电化学、色谱等检测部件。
PCR微流控芯片固定扩增式、连续流动式、热对流驱动式等方式。液滴在芯片中形成不同的温度梯度，从而达到扩增的目的。解决传统PCR加热体积大，热循环速度慢的缺点，具有更快的温度传导速度、易于集成。
总结：PCR和微流控芯片相结合，相比于传统的PCR定量扩增方法，灵敏度更高，定量更准确，是最有发展前景的PCR技术。随着微流控制作工艺的提升，并且在微阀、微泵、微反应器等功能元器件的组合下，功能将越来越丰富，应用前景广阔。
参考文献：
[1]祁恒、王立东、刘瑞东、辛海明、等。PCR微流控芯片技术专利分析。中国发明与专利.2020，17（11）
一、PCR微流控芯片的技术优势
微流控芯片（Microfluidic Chip）是将分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，以自动完成分析全过程。微流控技术是体外诊断领域具有前景的底层技术平台。
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR是核酸检测检测的核心技术。
以微流控芯片实现PCR反应过程，具有明显的技术优势：
1）分析更高效：在PCR检验领域，微流控芯片的微通道具有非常高的传质和传热效率，能够将诊断检测过程缩短至最低 10-15 分钟;
2）精确度/重现度高：商业化微流控PCR精确度和可重现性理论上媲美业内金标准（RT-PCR）;
3）核酸绝对定量检测：微流体数字PCR产品基于微流控和泊松分布原理，可实现核酸的高通量、绝对定量检测;
4）自动集成化：采用微加工机技术，将所需要的微通道集成到一块基板上面，全部检测过程可在芯片内部完成，实现核酸检测全自动化。
二、微流控芯片专利技术情况
祁恒、王立东、刘瑞东、辛海明、等发表的《PCR微流控芯片技术专利分析》，通过对PCR微流控芯片技术的相关专利申请进行检索与分析，对PCR微流控芯片技术的现状、特点和发展趋势进行研究。该文检索截止时间为2020年4月3日，得到所要分析的国内外专利申请样本，共计353件专利（合并同族后为299项专利）。该文的主要结论是：排名前十位的申请人中，除美国佳能生命科学公司以外，其他主要申请人均为国内申请人，包括排名第一的北京工业大学，排名第二的清华大学等等。主要研发方向集中在包含酶、核酸或微生物的测定或检验方法;其所用的组合物或试纸;这种组合物的制备方法;在微生物学方法或酶学方法中的条件反应控制等。
该文的结论是：由于 PCR 微流控芯片技术具有较高的前沿性，全球专利申请总量并不大，但是近些年专利申请量有增加的趋势。由于我国出台了多项与生物芯片技术密切相关的政策，所以近些年关于PCR 微流控芯片技术的专利申请在中国公开的专利数量最多，我国已经成为PCR 微流控芯片技术研究最活跃的国家，而主要创新主体为高校与科研院所。
由此可见，进一步加强对PCR微流控芯片的技术攻关，开发适用于工业化生产的芯片产品，实现微流控芯片技术的推广应用，培育高价值产业，应该具备很好的技术基础。
三、PCR微流控芯片产业化发展的制约因素
3.1生产成本比较高。传统PCR技术成熟，成本较底。PCR微流控芯片生产过程复杂，需要精密的加工，复杂的生产工艺，而且良品率不高。
3.2专利技术壁垒。微流控芯片研发周期长、研发进度慢、研发成本高等因素，产品线也不够丰富，目前应用较为广泛的是荧光免疫類分析仪，核酸检测领域比较少。一些微流控前沿公司设置的一系列专利布局和壁垒的完善，后来的研发企业如果不对细分专利领域进行严加勘察，便很容易被起诉侵权。
3.3应用场景不清晰。PCR微流控芯片主要应用场景的POCT目前技术还不成熟，而高通量PCR实验室产品，则与传统PCR技术相比，具有效果差，耗材费用高等缺点。
四、PCR微流控芯片的关键技术
PCR微流控芯片的关键技术，在于研制可供量产的微流控芯片，设计和优化微流控芯片的结构、布局以及功能，实现前处理和扩增两个主要的技术需求。芯片加样后全密封，保障使用环境无 PCR 实验室分区要求。从样品加入到结果检出小于30分钟。最终芯片可达到移液误差<5%，温度偏差<0.2℃，温度波动<0.1℃。
4.1区域流道设计
设计前处理结构件，包含可封闭的开口用加样、混匀的结构。设计磁珠富集方案，防止内部物质流出污染环境。芯片包含试剂释放区、核酸提取区、液体混合区、预扩增区、检测区及液滴流道，做到控制各种试剂间互不干扰，按程序进入各区域工作。优化芯片运行过程中各步骤的移液准确度、速度等相关参数。
4.2温控系统设计
根据各区域的工作温度需求独立设计芯片的温控模块，计算各部分需要的热容量、导热系数并推导出维持设定温度所需输入的功率，以确保温控的准确度，且不同温区独立控制互不影响。
4.3试剂预存方法
设计各组分试剂的尺寸结构，及相应的条件通透密封结构，使内部试剂可按程序释放至指定区域，建立可在微小结构中预存、冻干、固定化试剂的方法及工艺。
4.4双温区快速PCR反应
在芯片中通过双温区设计实现快速PCR反应。具体是，设置2～3个温区，独立自主控温，恒温期间功率低，无需额外散热，并且可以自主控制液滴移动，让反应液在指定温区中来回运动以实现1～2秒内完成高低温转变，从而大幅缩短反应升降温时间，实现超快速PCR反应。同时减轻了设备重量和功率，各芯片可独立运行，提高了灵活性。
五、PCR微流控芯片的设计和加工
设计和加工微流控芯片是研究的基础所在。根据具体的研究以及实验所需要分析的目的，微流控芯片的结构迥异。主体结构分为上下两层片基，由 PMMA、PDMS、玻璃等材料所制成，其中包括了微通道，微结构、进样口，检测窗等结构单元构成。外围设备有蠕动泵、微量注射泵、温控系统、以及紫外、荧光、电化学、色谱等检测部件。
PCR微流控芯片固定扩增式、连续流动式、热对流驱动式等方式。液滴在芯片中形成不同的温度梯度，从而达到扩增的目的。解决传统PCR加热体积大，热循环速度慢的缺点，具有更快的温度传导速度、易于集成。
总结：PCR和微流控芯片相结合，相比于传统的PCR定量扩增方法，灵敏度更高，定量更准确，是最有发展前景的PCR技术。随着微流控制作工艺的提升，并且在微阀、微泵、微反应器等功能元器件的组合下，功能将越来越丰富，应用前景广阔。
参考文献：
[1]祁恒、王立东、刘瑞东、辛海明、等。PCR微流控芯片技术专利分析。中国发明与专利.2020，17（11）