目的:评价高效液相串联质谱（Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）法测定人血清中文拉法辛和O-去甲基文拉法辛浓度的不确定度。方法:对可能会引入不确定度的步骤进行分析,包括测量重复性、样品称量、溶液配制、样品处理、仪器允差、基质效应、提取回收、标准曲线拟合等,评估扩展不确定度。结果:文拉法辛低(12 ng·mL^-1)、中(120 ng·mL^-1)、高(300 ng·mL^-1)浓度质控样品的拓展不确定度分别为:U_L =0.847 ng·mL^-1,U_M =7.518 ng·mL^-1,U_H =20.776 ng·mL^-1;O-去甲基文拉法辛低(60 ng·mL^-1)、中(600 ng·mL^-1)、高(1 500 ng·mL^-1)浓度质控样品的拓展不确定度分别为:U_L =11.666 ng·mL^-1,U_M=91.479 ng·mL^-1,U_H=254.523 ng·mL^-1（P=95%,k=2）。结论:LC-MS/MS法测定人血清中文拉法辛和O-去甲基文拉法辛浓度的不确定度主要来源于标准曲线拟合、基质效应和提取回收过程。选择合适的同位素氘代内标浓度能够有效降低标准曲线拟合过程引入的不确定度。