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摘要：利用杆状病毒表达系统进行Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒蛋白水解酶3C基因的表达研究。首先通过PCR方法扩增出3C基因，亚克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1中，获得重组转座载体pFB-3C，随后将该重组质粒转化感受态细胞DH10Bac进行同源重组，经蓝白斑筛选及PCR鉴定后，获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-3C，将其在脂质体介导下转染sf9昆蟲细胞，获得重组杆状病毒rBac-3C，并进行重组蛋白表达的检测。间接免疫荧光结果，鸭抗全病毒阳性血清能够与重组蛋白发生特异性结合。结果表明，DHAV-Ⅰ 3C蛋白在sf9昆虫细胞中获得了成功表达。
关键词：Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒；3C基因；昆虫细胞；表达
中图分类号： S858.32文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）23-0033-02
鸭甲型肝炎病毒（duck hepatitis A virus，DHAV）主要侵害4周龄之内雏鸭，引起一种急性高度接触致死性烈性传染病，以角弓反张和肝脏病变为主要特征，1周龄以内的雏鸭病死率接近100%，严重危害我国养鸭业。DHAV可分为3种血清型，分别为DHAV-Ⅰ（经典的DHV-Ⅰ）[1]、DHAV-Ⅱ（新发现于台湾的血清型）[2]、DHAV-Ⅲ（新发现于中国和韩国的血清型）[3-4]，3个血清型之间存在明显的差异，无交叉免疫性。目前，我国DHAV-Ⅰ流行较普遍，对养鸭业危害最大。
DHAV-Ⅰ为小RNA病毒科的成员，具有小RNA病毒的基本结构，整个基因组分为3个部分：5′非编码区（untranslated region，UTR），1个编码多聚蛋白的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）和3′非编码区（3′UTR），3′UTR之后是poly（A）尾。ORF编码的聚合蛋白分为1个结构蛋白区（P1）和2个非结构蛋白区（P2、P3），结构蛋白P1在病毒自身编码的蛋白酶的作用下可以水解成VP0、VP1、VP3 3种衣壳蛋白；P2区可以裂解为2A1、2A2（2A3）、2B、2C 4种或5种非结构蛋白；P3区又可以裂解为3A、3B、3C、3D 4种非结构蛋白。其中3C蛋白是一种蛋白水解酶，在多聚蛋白的水解以及病毒的复制、形成过程中发挥重要作用[5-6]。本研究利用杆状病毒/昆虫细胞系统表达DHAV-Ⅰ 3C基因，为3C蛋白的开发应用奠定了基础。
1材料与方法
1.1载体、菌株和毒株
DHAV-Ⅰ SH株由中国农业科学院上海兽医研究所惠赠；感受态细胞DH10Bac、DH5α、杆状病毒转移载体pFastBac1、含有目的基因的重组质粒pET-3C均由江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室制备并保存。
1.2工具酶和试剂
转染试剂Cellfectin Ⅱ Reagent购自Invitrogen公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、pfu DNA聚合酶购自Fermentas公司；FITC标记的羊抗鸭IgG购自KPL公司；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素（Amp）、卡那青霉素（Kan）、四环霉素（Tet）、庆大霉素（Gen）购自Sigma公司；昆虫细胞培养基Sf-900 Ⅱ SFM（serum free medium）购自GBICO公司；其他试剂均为国产分析纯级。
1.3引物的合成
根据GenBank中DHAV-1 SH株病毒全基因组序列（登录号FJ157178），设计1对特异性引物以扩增其开放阅读框，并在上下游引物5′端分别引入BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点，3C-F：5′-TATGGATCCATGAGCGGGCGGGTGAATTTCAGAC-3′（BamHⅠ酶切位点），3C-R：5′-CGCCTCGAGTTATTGG TTAAAAACTGGAAAAACC-3′（XhoⅠ酶切位点），通用引物M13序列参照杆状病毒表达系统操作说明书设计。引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。
1.43C基因的扩增
以含有目的基因的重组质粒pET-3C为模板高保真PCR扩增3C基因。50 μL扩增体系：pfu DNA Polymerase 1 μL、10×Buffer 5 μL、Primer F 1 μL、Primer R 1 μL、dNTP（2 mmol/L）5 μL、DNA 1 μL、DDW 36 μL。反应程序为 94 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性 20 s，52 ℃退火20 s，72 ℃延伸 90 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.5重组转座载体pFB-3C的构建
将回收的PCR产物及杆状病毒载体pFastBac1分别用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后，回收3C基因片段及线性化的载体，T4连接酶连接，连接产物转化感受态细胞E.coli DH5α。挑取单菌落，提取质粒，XhoⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定。重组子命名为pFB-3C。
1.6质粒DNA的转座
参照Invitrogen公司的杆状病毒操作流程说明书，将重组质粒pFB-3C转化感受态细胞DH10Bac，均匀涂布于含有IPTG、X-Gal的LB平板上（含庆大霉素、卡那霉素和四环素），37 ℃培养箱内培养，直至蓝白斑出现。随机挑取数个白色菌落，碱裂法提取质粒DNA，用引物M13进行PCR鉴定。PCR产物用0.7%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.7重组杆状病毒rBac-3C的制备
将提取的重组杆粒rBacmid-3C和野生型Bacmid DNA参照转染试剂说明书转染昆虫细胞sf9。转染后约72 h，待细胞出现明显病变、细胞变大时，收集细胞上清，即为P1代 rBac-3C，4 ℃避光保存备用。参照Invitrogen公司的杆状病毒操作流程说明书，将P1代重组杆状病毒在sf9昆虫细胞上进行扩增，直至P3代，并利用空斑试验测定P3代rBac-3C的病毒滴度。 1.8表达产物的间接免疫荧光鉴定
将P3代rBac-3C按MOI为5感染24孔板中处于对数生长期的sf9细胞，72 h后，弃去上清，用预冷的冷丙酮固定20 min，PBS洗涤3次，用5% BSA室温封闭1 h，加入鸭抗全病毒血清（1 ∶100），37 ℃孵育2 h后，PBST洗涤3次后，加入FITC标记的羊抗鸭IgG（1 ∶100），37 ℃孵育30 min，PBST洗涤3次后，在荧光倒置显微镜下观察特异性荧光。
2结果与分析
2.1目的基因的克隆
高保真PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，可见1条大小约为580 bp的目的条带（图1），与预期值一致。
2.2重组转座载体pFB-3C的构建与鉴定
3C基因经XhoⅠ和BamHⅠ酶切后插入经同样酶切的pFastBac1，XhoⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定，结果出现约580 bp和4 800 bp的2条条带（图2），与预期结果相符。
2.3重组Bacmid的筛选与鉴定
用M13引物对重组Bacmid进行PCR鉴定，结果rBacmid-3C的扩增条带大小约为2 900 bp，与预期片段大小相符（图3），说明3C基因转座成功。
2.4表达产物的间接免疫荧光检测
以鸭抗全病毒血清为一抗对昆虫细胞内的表达产物进行间接免疫荧光检测，从图4可以看出，rBac-3C感染的昆虫细胞胞浆内有大量特异性荧光出现，而野生型杆状病毒感染的细胞内则未观察到。
3讨论
鸭甲型肝炎病毒属于小RNA病毒科禽肝炎病毒属。3C蛋白是小RNA病毒的自身蛋白水解酶之一，能够正确水解多种前体蛋白，从而保证了衣壳的形成。3C蛋白酶不但能够水解自身的前体多聚蛋白，还能水解宿主细胞内的蛋白，包括一些细胞的骨架蛋白、翻译因子、固有免疫信号分子等，从而抑制宿主蛋白的功能发挥，保证了病毒蛋白有效逃避固有免疫的监控，在病毒颗粒的穿入和释放中发挥重要的作用[7]。
Bac-to-Bac系统作为杆状病毒表达系统己被广泛使用，且己被商业化。Bac-to-Bac系统主要利用Luckow等研发的基因转座技术而形成[8]。该系统优点是可以高效获得重组杆状病毒，效率可达100%，避免了以前采用同源重组机制获得重组杆状病毒效率较低的问题。与原核表达系统相比，该系统具有蛋白质翻译后修饰所必需的酶系统，能对外源蛋白进行糖基化、磷酸化和信号肽切除等翻译后加工修饰，从而保留表达蛋白的生物学活性[9]。
本研究利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统成功制备了表达3C蛋白的重组杆状病毒，间接免疫荧光结果显示，阳性鸭抗全病毒血清能与重组蛋白3C发生特异性结合，说明重组蛋白3C具有良好的反应原性，由于是首次利用该系统表达3C蛋白，后续将从优化密码子角度出发提高重组蛋白的表達量，为3C功能的进一步研究奠定基础。
参考文献：
[1]Wang L，Pan M，Fu Y，et al. Classification of duck hepatitis virus into threegenotypesbased on molecular evolutionary analysis[J]. Virus
Genes，2008，37（1）：52-59.
[2]Tseng C H，Knowles N J，Tsai H J. Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1 indicates that it should be assigned to a new genus[J]. Virus Research，2007，123（2）：190-203.
[3]Kim M C，Kwon Y K，Joh S J，et al. Recent korean isolates of duck hepatitis virus reveal the presence of a new geno- and serotype when compared to duck hepatitis virus type 1 type strains[J]. Archives of Virology，2007，152（11）：2059-2072.
[4]Kim M C，Kwon Y K，Joh S J，et al. Differential diagnosis between type-specific duck hepatitis virus type 1 （DHV-1） and recent Korean DHV-1-like isolates using a multiplex polymerase chain reaction[J]. Avian Pathology，2008，37（2）：171-177.
[5]Ding C Y，Zhang D B. Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1[J]. Virology，2007，361（1）：9-17.
[6]张艳芳，罗薇，刘内生，等. 鸭肝炎病毒的研究进展[J]. 中国畜牧兽医，2011，38（7）：171-175.
[7]刘艳，李冰清，孟红. 小RNA病毒3C蛋白酶及其裂解底物[J]. 生物技术通报，2014（8）：46-51.
[8]Luckow V A，Lee S C，Barry G F，et al. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli[J]. Journal of Virology，1993，67（8）：4566-4579.
[9]Altmann F，Staudacher E，Wilson I B，et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins[J]. Glycoconjugate Journal，1999，16（2）：109-123.江苏农业科学2017年第45卷第23期王兰萍，崔悦，马蕊，等. 滩羊群体产羔性状相关基因位点的遗传变异分析[J]. 江苏农业科学，2017，45（23）：35-37.
关键词：Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒；3C基因；昆虫细胞；表达
中图分类号： S858.32文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）23-0033-02
鸭甲型肝炎病毒（duck hepatitis A virus，DHAV）主要侵害4周龄之内雏鸭，引起一种急性高度接触致死性烈性传染病，以角弓反张和肝脏病变为主要特征，1周龄以内的雏鸭病死率接近100%，严重危害我国养鸭业。DHAV可分为3种血清型，分别为DHAV-Ⅰ（经典的DHV-Ⅰ）[1]、DHAV-Ⅱ（新发现于台湾的血清型）[2]、DHAV-Ⅲ（新发现于中国和韩国的血清型）[3-4]，3个血清型之间存在明显的差异，无交叉免疫性。目前，我国DHAV-Ⅰ流行较普遍，对养鸭业危害最大。
DHAV-Ⅰ为小RNA病毒科的成员，具有小RNA病毒的基本结构，整个基因组分为3个部分：5′非编码区（untranslated region，UTR），1个编码多聚蛋白的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）和3′非编码区（3′UTR），3′UTR之后是poly（A）尾。ORF编码的聚合蛋白分为1个结构蛋白区（P1）和2个非结构蛋白区（P2、P3），结构蛋白P1在病毒自身编码的蛋白酶的作用下可以水解成VP0、VP1、VP3 3种衣壳蛋白；P2区可以裂解为2A1、2A2（2A3）、2B、2C 4种或5种非结构蛋白；P3区又可以裂解为3A、3B、3C、3D 4种非结构蛋白。其中3C蛋白是一种蛋白水解酶，在多聚蛋白的水解以及病毒的复制、形成过程中发挥重要作用[5-6]。本研究利用杆状病毒/昆虫细胞系统表达DHAV-Ⅰ 3C基因，为3C蛋白的开发应用奠定了基础。
1材料与方法
1.1载体、菌株和毒株
DHAV-Ⅰ SH株由中国农业科学院上海兽医研究所惠赠；感受态细胞DH10Bac、DH5α、杆状病毒转移载体pFastBac1、含有目的基因的重组质粒pET-3C均由江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室制备并保存。
1.2工具酶和试剂
转染试剂Cellfectin Ⅱ Reagent购自Invitrogen公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、pfu DNA聚合酶购自Fermentas公司；FITC标记的羊抗鸭IgG购自KPL公司；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素（Amp）、卡那青霉素（Kan）、四环霉素（Tet）、庆大霉素（Gen）购自Sigma公司；昆虫细胞培养基Sf-900 Ⅱ SFM（serum free medium）购自GBICO公司；其他试剂均为国产分析纯级。
1.3引物的合成
根据GenBank中DHAV-1 SH株病毒全基因组序列（登录号FJ157178），设计1对特异性引物以扩增其开放阅读框，并在上下游引物5′端分别引入BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点，3C-F：5′-TATGGATCCATGAGCGGGCGGGTGAATTTCAGAC-3′（BamHⅠ酶切位点），3C-R：5′-CGCCTCGAGTTATTGG TTAAAAACTGGAAAAACC-3′（XhoⅠ酶切位点），通用引物M13序列参照杆状病毒表达系统操作说明书设计。引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。
1.43C基因的扩增
以含有目的基因的重组质粒pET-3C为模板高保真PCR扩增3C基因。50 μL扩增体系：pfu DNA Polymerase 1 μL、10×Buffer 5 μL、Primer F 1 μL、Primer R 1 μL、dNTP（2 mmol/L）5 μL、DNA 1 μL、DDW 36 μL。反应程序为 94 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性 20 s，52 ℃退火20 s，72 ℃延伸 90 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.5重组转座载体pFB-3C的构建
将回收的PCR产物及杆状病毒载体pFastBac1分别用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后，回收3C基因片段及线性化的载体，T4连接酶连接，连接产物转化感受态细胞E.coli DH5α。挑取单菌落，提取质粒，XhoⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定。重组子命名为pFB-3C。
1.6质粒DNA的转座
参照Invitrogen公司的杆状病毒操作流程说明书，将重组质粒pFB-3C转化感受态细胞DH10Bac，均匀涂布于含有IPTG、X-Gal的LB平板上（含庆大霉素、卡那霉素和四环素），37 ℃培养箱内培养，直至蓝白斑出现。随机挑取数个白色菌落，碱裂法提取质粒DNA，用引物M13进行PCR鉴定。PCR产物用0.7%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.7重组杆状病毒rBac-3C的制备
将提取的重组杆粒rBacmid-3C和野生型Bacmid DNA参照转染试剂说明书转染昆虫细胞sf9。转染后约72 h，待细胞出现明显病变、细胞变大时，收集细胞上清，即为P1代 rBac-3C，4 ℃避光保存备用。参照Invitrogen公司的杆状病毒操作流程说明书，将P1代重组杆状病毒在sf9昆虫细胞上进行扩增，直至P3代，并利用空斑试验测定P3代rBac-3C的病毒滴度。 1.8表达产物的间接免疫荧光鉴定
将P3代rBac-3C按MOI为5感染24孔板中处于对数生长期的sf9细胞，72 h后，弃去上清，用预冷的冷丙酮固定20 min，PBS洗涤3次，用5% BSA室温封闭1 h，加入鸭抗全病毒血清（1 ∶100），37 ℃孵育2 h后，PBST洗涤3次后，加入FITC标记的羊抗鸭IgG（1 ∶100），37 ℃孵育30 min，PBST洗涤3次后，在荧光倒置显微镜下观察特异性荧光。
2结果与分析
2.1目的基因的克隆
高保真PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，可见1条大小约为580 bp的目的条带（图1），与预期值一致。
2.2重组转座载体pFB-3C的构建与鉴定
3C基因经XhoⅠ和BamHⅠ酶切后插入经同样酶切的pFastBac1，XhoⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定，结果出现约580 bp和4 800 bp的2条条带（图2），与预期结果相符。
2.3重组Bacmid的筛选与鉴定
用M13引物对重组Bacmid进行PCR鉴定，结果rBacmid-3C的扩增条带大小约为2 900 bp，与预期片段大小相符（图3），说明3C基因转座成功。
2.4表达产物的间接免疫荧光检测
以鸭抗全病毒血清为一抗对昆虫细胞内的表达产物进行间接免疫荧光检测，从图4可以看出，rBac-3C感染的昆虫细胞胞浆内有大量特异性荧光出现，而野生型杆状病毒感染的细胞内则未观察到。
3讨论
鸭甲型肝炎病毒属于小RNA病毒科禽肝炎病毒属。3C蛋白是小RNA病毒的自身蛋白水解酶之一，能够正确水解多种前体蛋白，从而保证了衣壳的形成。3C蛋白酶不但能够水解自身的前体多聚蛋白，还能水解宿主细胞内的蛋白，包括一些细胞的骨架蛋白、翻译因子、固有免疫信号分子等，从而抑制宿主蛋白的功能发挥，保证了病毒蛋白有效逃避固有免疫的监控，在病毒颗粒的穿入和释放中发挥重要的作用[7]。
Bac-to-Bac系统作为杆状病毒表达系统己被广泛使用，且己被商业化。Bac-to-Bac系统主要利用Luckow等研发的基因转座技术而形成[8]。该系统优点是可以高效获得重组杆状病毒，效率可达100%，避免了以前采用同源重组机制获得重组杆状病毒效率较低的问题。与原核表达系统相比，该系统具有蛋白质翻译后修饰所必需的酶系统，能对外源蛋白进行糖基化、磷酸化和信号肽切除等翻译后加工修饰，从而保留表达蛋白的生物学活性[9]。
本研究利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统成功制备了表达3C蛋白的重组杆状病毒，间接免疫荧光结果显示，阳性鸭抗全病毒血清能与重组蛋白3C发生特异性结合，说明重组蛋白3C具有良好的反应原性，由于是首次利用该系统表达3C蛋白，后续将从优化密码子角度出发提高重组蛋白的表達量，为3C功能的进一步研究奠定基础。
参考文献：
[1]Wang L，Pan M，Fu Y，et al. Classification of duck hepatitis virus into threegenotypesbased on molecular evolutionary analysis[J]. Virus
Genes，2008，37（1）：52-59.
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[6]张艳芳，罗薇，刘内生，等. 鸭肝炎病毒的研究进展[J]. 中国畜牧兽医，2011，38（7）：171-175.
[7]刘艳，李冰清，孟红. 小RNA病毒3C蛋白酶及其裂解底物[J]. 生物技术通报，2014（8）：46-51.
[8]Luckow V A，Lee S C，Barry G F，et al. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli[J]. Journal of Virology，1993，67（8）：4566-4579.
[9]Altmann F，Staudacher E，Wilson I B，et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins[J]. Glycoconjugate Journal，1999，16（2）：109-123.江苏农业科学2017年第45卷第23期王兰萍，崔悦，马蕊，等. 滩羊群体产羔性状相关基因位点的遗传变异分析[J]. 江苏农业科学，2017，45（23）：35-37.