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【摘要】 目的：探讨手足口病患儿DLL4/Notch信号通路相关蛋白的表达及意义。方法：选择2018年3月-2019年11月本科收治的手足口病患儿86例，其中轻症患儿76例（普通组），重症患儿10例（重症组），同期选择在本院体检的健康小儿86例作为对照组。比较三组外周血DLL4、Notch1 mRNA表达水平与血清IL-6、IL-8、TNF-α表达水平，并进行相关性分析。结果：重症组住院天数、发热天数均长于普通组，休克、呼吸衰竭、EV71感染发生率均高于普通组，差异均有统计学意义（P<0.05）。重症组与普通组的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于对照组，重症组的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于普通组，差异均有统计学意义（P<0.05）。重症组与普通组外周血DLL4、Notch1 mRNA相對表达水平均高于对照组，重症组外周血DLL4、Notch1 mRNA相对表达水平均高于普通组，差异均有统计学意义（P<0.05）。在手足口病患儿中，Pearson分析显示DLL4、Notch1表达水平与IL-6、IL-8、TNF-α存在相关性（P<0.05）。结论：手足口病患儿伴随着DLL4/Notch信号通路相关蛋白表达的激活，可诱发大量炎症因子的释放，与患者的病情存在相关性。
【关键词】 手足口病 DLL4/Notch信号通路 炎症因子 病情 相关性
Expression and Significance of DLL4/Notch Signaling Pathway Related Proteins in Children with Hand-foot-mouth Disease/GAO Rong， Zulipiya Damula. //Medical Innovation of China， 2021， 18（12）： 0-084
[Abstract] Objective： To investigate the expression and significance of DLL4/Notch signaling pathway related proteins in children with hand-foot-mouth disease （HFMD）. Method： A total of 86 children with HFMD admitted to our hospital from March 2018 to November 2019 were selected， including 76 children with mild disease （normal group） and 10 children with severe disease （severe group）， and 86 healthy children with physical examination in our hospital during the same period were selected as the control group. The mRNA expression levels of DLL4 and Notch1 in peripheral blood of three groups were compared with the expression levels of IL-6， IL-8 and TNF-α in serum， and the correlation analysis was conducted. Result： The hospitalization days and fever days in the severe group were longer than those in the normal group， and the incidence of shock， respiratory failure and EV71 infection were higher than those in the normal group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Serum levels of IL-6， IL-8 and TNF-α in the severe group and normal group were higher than those in the control group， serum levels of IL-6， IL-8 and TNF-α in the severe group were higher than those in the normal group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The mRNA relative expression levels of DLL4 and Notch1 in peripheral blood of the severe group and the normal group were higher than those of the control group， and the mRNA relative expression levels of DLL4 and Notch1 in peripheral blood of the severe group were higher than those of the normal group， the differences were statistically significant （P<0.05）. In children HFMD， Pearson analysis showed that the expression levels of DLL4 and Notch1 were correlated with IL-6， IL-8， TNF-α （P<0.05）. Conclusion： The activation of DLL4/Notch signaling pathway related protein expression in children with hand-foot-mouth disease can induce the release of a large number of inflammatory factors， which is correlated with the patient’s condition. [Key words] Hand-foot-mouth disease DLL4/Notch signaling pathway Inflammatory factors Condition
Correlation
First-author’s address： Children’s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830054， China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.12.019
手足口病（hand-foot-mouth disease， HFMD）是由腸道病毒引起婴幼儿常见急性传染病，以疱疹、发热、口腔疼痛为主要临床特征的传染病[1]。其主要的病原体为柯萨奇病毒A组16型（coxsackie virus， CA16）或肠道病毒71型（enterovirus 71， EV71），其中EV71感染具有极强的传染性[2-3]。轻度感染患儿预后良好;重度感染患儿多伴随着神经系统并发症，包括脑干脑炎、无菌性脑膜炎、神经源性肺水肿、急性弛缓性麻痹，多为EV71感染引起，具有一定的致死率[4]。有研究报道显示EV71具有亲神经性，使得手足口病患儿容易出现脑炎，导致疾病恶化。DLL4/Notch信号通路是进化上比较保守的跨膜蛋白家族，主要由配体、受体、结合蛋白、调节分子、效应物等组成[5]。人体共有多种Notch配体（DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1）和多种Notch受体（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）等，其中Notch1属于Ⅰ型跨膜蛋白，当胞外区域与配体结合后，Notch受体被解聚素和金属蛋白酶水解，跨膜区和胞内区由γ-分泌酶复合体催化为Notch胞内区，然后进入胞核后，可水解成组蛋白去乙酰化酶、核受体辅阻遏物2等因子，从而发挥生物学调节作用[6]。当DLL4/Notch信号通路激活后，尤其是DLL4的高表达可促进CD4+ Th1淋巴细胞的分化，可诱发炎症因子的表达，促进Treg淋巴细胞分化，从而导致疾病恶化[7]。本文具体探讨了手足口病患儿DLL4/Notch信号通路相关蛋白表达的差异及意义，以明确手足口病的发生机制。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2018年3月-2019年11月本科收治的手足口病患儿86例，其中轻症患儿76例（普通组），重症患儿10例（重症组），同期选择在本院体检的健康小儿86例作为对照组。纳入标准：普通组与重症组均符合手足口病的诊断标准，即咽拭子或肛拭子EV71-PCR或CA16-PCR检测阳性，都有发热症状;重症组伴随着神经系统并发症;对照组为健康查体的小儿;研究对象年龄1～6岁;临床资料完整。排除标准：无法安静且对镇静剂过敏;合并慢性基础疾病需长期服用糖皮质激素;合并先天性疾病;伴先天性或获得性免疫缺陷病。研究对象家属知情同意本研究，本院伦理委员会批准了此次研究。
1.2 方法 DLL4、Notch1 mRNA检测：采集所有研究对象的外周血2～3 mL，抗凝，分离单个核细胞，抽提总RNA并进行逆转录。采用实时定量PCR方法检测DLL4、Notch1表达水平，采用PCR Mix试剂盒进行PCR反应，总反应体系为20 μL，引物序列如下，DLL4正向引物：5’-CTTGGTGTCACGCTTGCT-3’，反向引物：5’-GGGTCATCCTTGTCCTCAT-3’;Notch1正向引物：5’-AGTTCCAGTGCGATGCCTACA-3’，反向引物：5’-AATGGTTATCGCTGTATCTG-3’，以GAPDH作为内标，做3次重复取平均值。
1.3 观察指标 再次抽取所有患者外周血样本
2～3 mL，不抗凝，静置30 min后，1 000 r/min离心10 min，取上层血清，采用酶联免疫法检测血清IL-6、IL-8、TNF-α等炎症因子表达水平，比较三组血清炎症因子表达水平。比较三组外周血DLL4、Notch1 mRNA相对表达水平。调查所有手足口病患儿的临床资料，包括住院天数、发热天数、临床症状、感染病原体类型等。分析手足口病患儿外周血DLL4、Notch1表达水平与血清炎症因子表达水平的相关性。
1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，多组数据比较采用方差分析;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。相关性分析采用Pearson分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三组一般资料比较 普通组中男38例，女38例;平均年龄（4.21±0.28）岁。重症组中男6例，女4例;平均年龄（4.24±0.33）岁。对照组中男43例，女43例;平均年龄（4.28±0.33）岁。三组的性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
2.2 两组临床相关指标比较 重症组的住院天数、发热天数均长于普通组，休克、呼吸衰竭、EV71感染发生率均高于普通组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.3 三组血清炎症因子表达水平比较 重症组与普通组的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于对照组，重症组的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于普通组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。
2.4 三组外周血DLL4、Notch1 mRNA相对表达水平比较 重症组与普通组的外周血DLL4、Notch1 mRNA相对表达水平均高于对照组，重症组的外周血DLL4、Notch1 mRNA相对表达水平均高于普通组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。 2.5 手足口病患儿外周血DLL4、Notch1表达水平与血清炎症因子表达水平的相关性分析 在手足口病患儿中，Pearson分析显示DLL4、Notch1表达水平与IL-6、IL-8、TNF-α存在相关性（P<0.05），见表4。
3 讨论
手足口病多发生于5岁以下小儿，在春夏季高发，多表现为发热和手足、口腔等部位的皮疹。该病的发生与发展呈现多个阶段，第一阶段为常规期，第二阶段为神经系统受累期，第三阶段为心肺功能衰竭期，第四阶段为恢复期。引发手足口病的肠道病毒比较多，其中CoxA 16和EV71最为常见。两者都属微小核糖核酸病毒科、人肠道病毒属，EV71具有明显嗜神经性，更易引起中枢神经系统感染，而CoxA 16可能为单纯的手足口病患儿[8]。研究表明手足口病可分为轻症和重症病例，其中轻症相当于第一阶段，重症相当于第二及其以后阶段，神经系统损害是手足口病恶化的早期表现，合并病毒性脑炎也属于第二阶段[9]。轻症患儿多只表现为口痛拒食、发热、皮疹等症状，重症患儿还伴随有神经系统受累表现。本研究也显示重症组的住院天数、发热天数均长于普通组，休克、呼吸衰竭、EV71感染发生率均高于普通组，差异均有统计学意义（P<0.05），表明手足口病患儿的病情可能与肠道病毒EV71感染相关。
手足口病侵犯中枢神经系统可分为病毒直接侵犯所致的炎症和机体免疫功能异常所致的急性脱髓鞘改变。炎症改变包括神经元变性、坏死和嗜神经细胞作用，血管周围主要单核细胞浸润形成袖套样改变，其病理改变主要是在脑干及脊髓，尤其灰质区可见弥漫性炎症[10]。本研究显示重症组与普通组的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于对照组，重症组的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于普通组，差异均有统计学意义（P<0.05）。从机制上分析，IL-6是一种重要的促炎性细胞因子，除对血管内皮细胞及炎性细胞具有直接激活和毒性作用外，其大量释放也可导致机体出现功能损害与多器官细胞代谢障碍[11]。IL-8也被称为前炎症细胞因子，是启动抗炎症反应的关键细胞因子，可激发机体产生众多继发性炎症介质。而EV71感染可以刺激机体大量释放TNF-α，激活靶基因转录，引起细胞因子合成和释放，诱发机体产生级联“瀑布式”炎症反应[12-13]。
在DLL4/Notch信号通路中，Notch1为一种单次跨膜蛋白，可参与调节机体的胚胎发育、血管形成、细胞增殖、细胞分化等，Notch1与DLL4相结合，从而将活化的Notch区域释放出来，再将释放出来的活化的Notch转移至细胞核，从而对下游基因起到调控作用[14-15]。有研究显示Notch1与DLL4在机体中存在动态平衡，可参与细胞内多种生物学活动，也可通过影响免疫细胞的数量和状态从而影响疾病的预后[16-18]。本研究显示重症组与普通组的外周血DLL4、Notch1 mRNA相对表达水平均高于对照组，重症组的外周血DLL4、Notch1 mRNA相对表达水平均高于普通组，差异均有统计学意义（P<0.05），表明手足口病疾病发生多伴随有DLL4/Notch信号通路激活。本研究Pearson分析显示手足口病患儿的DLL4、Notch1与IL-6、IL-8、TNF-α存在相关性（P<0.05）。从机制上分析，随着手足口病患儿病情的恶化，可刺激DC细胞成熟以刺激T细胞对抗病毒，可激活DLL4/Notch信号通路，从而增强炎性细胞因子表达，导致机体出现神经系统改变，使患儿病情恶化[19-21]。不过本研究也存在一定的不足，没有进行影响因素分析，调查的小儿数量比较少，将在后续研究中进行探讨。
综上所述，手足口病患儿伴随着DLL4/Notch信号通路相关蛋白表达的激活，可诱发大量炎症因子的释放，与患儿的病情存在相关性。
参考文献
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（收稿日期：2021-03-03） （本文編辑：姬思雨）
【关键词】 手足口病 DLL4/Notch信号通路 炎症因子 病情 相关性
Expression and Significance of DLL4/Notch Signaling Pathway Related Proteins in Children with Hand-foot-mouth Disease/GAO Rong， Zulipiya Damula. //Medical Innovation of China， 2021， 18（12）： 0-084
[Abstract] Objective： To investigate the expression and significance of DLL4/Notch signaling pathway related proteins in children with hand-foot-mouth disease （HFMD）. Method： A total of 86 children with HFMD admitted to our hospital from March 2018 to November 2019 were selected， including 76 children with mild disease （normal group） and 10 children with severe disease （severe group）， and 86 healthy children with physical examination in our hospital during the same period were selected as the control group. The mRNA expression levels of DLL4 and Notch1 in peripheral blood of three groups were compared with the expression levels of IL-6， IL-8 and TNF-α in serum， and the correlation analysis was conducted. Result： The hospitalization days and fever days in the severe group were longer than those in the normal group， and the incidence of shock， respiratory failure and EV71 infection were higher than those in the normal group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Serum levels of IL-6， IL-8 and TNF-α in the severe group and normal group were higher than those in the control group， serum levels of IL-6， IL-8 and TNF-α in the severe group were higher than those in the normal group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The mRNA relative expression levels of DLL4 and Notch1 in peripheral blood of the severe group and the normal group were higher than those of the control group， and the mRNA relative expression levels of DLL4 and Notch1 in peripheral blood of the severe group were higher than those of the normal group， the differences were statistically significant （P<0.05）. In children HFMD， Pearson analysis showed that the expression levels of DLL4 and Notch1 were correlated with IL-6， IL-8， TNF-α （P<0.05）. Conclusion： The activation of DLL4/Notch signaling pathway related protein expression in children with hand-foot-mouth disease can induce the release of a large number of inflammatory factors， which is correlated with the patient’s condition. [Key words] Hand-foot-mouth disease DLL4/Notch signaling pathway Inflammatory factors Condition
Correlation
First-author’s address： Children’s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830054， China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.12.019
手足口病（hand-foot-mouth disease， HFMD）是由腸道病毒引起婴幼儿常见急性传染病，以疱疹、发热、口腔疼痛为主要临床特征的传染病[1]。其主要的病原体为柯萨奇病毒A组16型（coxsackie virus， CA16）或肠道病毒71型（enterovirus 71， EV71），其中EV71感染具有极强的传染性[2-3]。轻度感染患儿预后良好;重度感染患儿多伴随着神经系统并发症，包括脑干脑炎、无菌性脑膜炎、神经源性肺水肿、急性弛缓性麻痹，多为EV71感染引起，具有一定的致死率[4]。有研究报道显示EV71具有亲神经性，使得手足口病患儿容易出现脑炎，导致疾病恶化。DLL4/Notch信号通路是进化上比较保守的跨膜蛋白家族，主要由配体、受体、结合蛋白、调节分子、效应物等组成[5]。人体共有多种Notch配体（DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1）和多种Notch受体（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）等，其中Notch1属于Ⅰ型跨膜蛋白，当胞外区域与配体结合后，Notch受体被解聚素和金属蛋白酶水解，跨膜区和胞内区由γ-分泌酶复合体催化为Notch胞内区，然后进入胞核后，可水解成组蛋白去乙酰化酶、核受体辅阻遏物2等因子，从而发挥生物学调节作用[6]。当DLL4/Notch信号通路激活后，尤其是DLL4的高表达可促进CD4+ Th1淋巴细胞的分化，可诱发炎症因子的表达，促进Treg淋巴细胞分化，从而导致疾病恶化[7]。本文具体探讨了手足口病患儿DLL4/Notch信号通路相关蛋白表达的差异及意义，以明确手足口病的发生机制。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2018年3月-2019年11月本科收治的手足口病患儿86例，其中轻症患儿76例（普通组），重症患儿10例（重症组），同期选择在本院体检的健康小儿86例作为对照组。纳入标准：普通组与重症组均符合手足口病的诊断标准，即咽拭子或肛拭子EV71-PCR或CA16-PCR检测阳性，都有发热症状;重症组伴随着神经系统并发症;对照组为健康查体的小儿;研究对象年龄1～6岁;临床资料完整。排除标准：无法安静且对镇静剂过敏;合并慢性基础疾病需长期服用糖皮质激素;合并先天性疾病;伴先天性或获得性免疫缺陷病。研究对象家属知情同意本研究，本院伦理委员会批准了此次研究。
1.2 方法 DLL4、Notch1 mRNA检测：采集所有研究对象的外周血2～3 mL，抗凝，分离单个核细胞，抽提总RNA并进行逆转录。采用实时定量PCR方法检测DLL4、Notch1表达水平，采用PCR Mix试剂盒进行PCR反应，总反应体系为20 μL，引物序列如下，DLL4正向引物：5’-CTTGGTGTCACGCTTGCT-3’，反向引物：5’-GGGTCATCCTTGTCCTCAT-3’;Notch1正向引物：5’-AGTTCCAGTGCGATGCCTACA-3’，反向引物：5’-AATGGTTATCGCTGTATCTG-3’，以GAPDH作为内标，做3次重复取平均值。
1.3 观察指标 再次抽取所有患者外周血样本
2～3 mL，不抗凝，静置30 min后，1 000 r/min离心10 min，取上层血清，采用酶联免疫法检测血清IL-6、IL-8、TNF-α等炎症因子表达水平，比较三组血清炎症因子表达水平。比较三组外周血DLL4、Notch1 mRNA相对表达水平。调查所有手足口病患儿的临床资料，包括住院天数、发热天数、临床症状、感染病原体类型等。分析手足口病患儿外周血DLL4、Notch1表达水平与血清炎症因子表达水平的相关性。
1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，多组数据比较采用方差分析;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。相关性分析采用Pearson分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三组一般资料比较 普通组中男38例，女38例;平均年龄（4.21±0.28）岁。重症组中男6例，女4例;平均年龄（4.24±0.33）岁。对照组中男43例，女43例;平均年龄（4.28±0.33）岁。三组的性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
2.2 两组临床相关指标比较 重症组的住院天数、发热天数均长于普通组，休克、呼吸衰竭、EV71感染发生率均高于普通组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.3 三组血清炎症因子表达水平比较 重症组与普通组的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于对照组，重症组的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于普通组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。
2.4 三组外周血DLL4、Notch1 mRNA相对表达水平比较 重症组与普通组的外周血DLL4、Notch1 mRNA相对表达水平均高于对照组，重症组的外周血DLL4、Notch1 mRNA相对表达水平均高于普通组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。 2.5 手足口病患儿外周血DLL4、Notch1表达水平与血清炎症因子表达水平的相关性分析 在手足口病患儿中，Pearson分析显示DLL4、Notch1表达水平与IL-6、IL-8、TNF-α存在相关性（P<0.05），见表4。
3 讨论
手足口病多发生于5岁以下小儿，在春夏季高发，多表现为发热和手足、口腔等部位的皮疹。该病的发生与发展呈现多个阶段，第一阶段为常规期，第二阶段为神经系统受累期，第三阶段为心肺功能衰竭期，第四阶段为恢复期。引发手足口病的肠道病毒比较多，其中CoxA 16和EV71最为常见。两者都属微小核糖核酸病毒科、人肠道病毒属，EV71具有明显嗜神经性，更易引起中枢神经系统感染，而CoxA 16可能为单纯的手足口病患儿[8]。研究表明手足口病可分为轻症和重症病例，其中轻症相当于第一阶段，重症相当于第二及其以后阶段，神经系统损害是手足口病恶化的早期表现，合并病毒性脑炎也属于第二阶段[9]。轻症患儿多只表现为口痛拒食、发热、皮疹等症状，重症患儿还伴随有神经系统受累表现。本研究也显示重症组的住院天数、发热天数均长于普通组，休克、呼吸衰竭、EV71感染发生率均高于普通组，差异均有统计学意义（P<0.05），表明手足口病患儿的病情可能与肠道病毒EV71感染相关。
手足口病侵犯中枢神经系统可分为病毒直接侵犯所致的炎症和机体免疫功能异常所致的急性脱髓鞘改变。炎症改变包括神经元变性、坏死和嗜神经细胞作用，血管周围主要单核细胞浸润形成袖套样改变，其病理改变主要是在脑干及脊髓，尤其灰质区可见弥漫性炎症[10]。本研究显示重症组与普通组的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于对照组，重症组的血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于普通组，差异均有统计学意义（P<0.05）。从机制上分析，IL-6是一种重要的促炎性细胞因子，除对血管内皮细胞及炎性细胞具有直接激活和毒性作用外，其大量释放也可导致机体出现功能损害与多器官细胞代谢障碍[11]。IL-8也被称为前炎症细胞因子，是启动抗炎症反应的关键细胞因子，可激发机体产生众多继发性炎症介质。而EV71感染可以刺激机体大量释放TNF-α，激活靶基因转录，引起细胞因子合成和释放，诱发机体产生级联“瀑布式”炎症反应[12-13]。
在DLL4/Notch信号通路中，Notch1为一种单次跨膜蛋白，可参与调节机体的胚胎发育、血管形成、细胞增殖、细胞分化等，Notch1与DLL4相结合，从而将活化的Notch区域释放出来，再将释放出来的活化的Notch转移至细胞核，从而对下游基因起到调控作用[14-15]。有研究显示Notch1与DLL4在机体中存在动态平衡，可参与细胞内多种生物学活动，也可通过影响免疫细胞的数量和状态从而影响疾病的预后[16-18]。本研究显示重症组与普通组的外周血DLL4、Notch1 mRNA相对表达水平均高于对照组，重症组的外周血DLL4、Notch1 mRNA相对表达水平均高于普通组，差异均有统计学意义（P<0.05），表明手足口病疾病发生多伴随有DLL4/Notch信号通路激活。本研究Pearson分析显示手足口病患儿的DLL4、Notch1与IL-6、IL-8、TNF-α存在相关性（P<0.05）。从机制上分析，随着手足口病患儿病情的恶化，可刺激DC细胞成熟以刺激T细胞对抗病毒，可激活DLL4/Notch信号通路，从而增强炎性细胞因子表达，导致机体出现神经系统改变，使患儿病情恶化[19-21]。不过本研究也存在一定的不足，没有进行影响因素分析，调查的小儿数量比较少，将在后续研究中进行探讨。
综上所述，手足口病患儿伴随着DLL4/Notch信号通路相关蛋白表达的激活，可诱发大量炎症因子的释放，与患儿的病情存在相关性。
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（收稿日期：2021-03-03） （本文編辑：姬思雨）