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摘 要：禽流感（avian influenza， AI）是由A型禽流感病毒（avian influenza virus， AIV）引起的一种禽类的感染疾病综合征。本文通过对禽流感病毒的结构和分子生物学特征等的描述，为H5N1禽流感病毒致病机理的认识及临床诊断提供帮助。
关键词：H5N1；禽流感病毒
1997年之前，尽管人和其他灵长类动物可人工感染禽流感病毒，但在这些宿主体内禽流感病毒的复制受到很大限制，使人们一直认为禽流感病毒在自然界不能跨越种间屏障直接感染人类，自1997年首次发现禽流感病毒感染人后，禽流感的公共卫生意义发生了质的改变，禽流感成为一种能引起人类感染的新型传染病，其传播对人类健康造成巨大威胁[1]。
A型流感病毒的致病性与毒株和宿主均有很大关系，不同毒株对同一宿主或同一毒株对不同宿主的致病性差异很大，根据毒力强弱将禽流感病毒划分为无致病性、低致病性禽流感 （low pathogenic avian influenza， LPAI）和高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza， HPAI）。低致病性禽流感病毒病原体从禽类等宿主传播给鸡和鸭等易感家禽后，再经若干次循环感染，就可能发生一系列突变而转变为具有严重致死性的高致病性禽流感病毒，至今高致病性禽流感病毒包括H7和H5亚型中的部分毒株，由于其传染性极强，可引起家禽全身性感染，造成多个组织器官严重病理损伤，致死率可达100%[2]。
1 禽流感病毒分类
禽流感病毒在病毒分类学上属单股负链RNA病毒目（mononegviralles）正黏病毒科（othomyxoviridae）A型流感病毒属（influenza virus A）。根据核蛋白（NP）和基质蛋白（MP）差异，将流感病毒共分为3个型，即A、B和C型，每个型内的毒株都有基本相同的NP和MP，也就是说NP和MP具有特异性。A型病毒感染人、猪、马、海豹、水貂、鲸及所有禽类；B型病毒仅感染人类；C型病毒只感染人和猪。A型和B型流感病毒基因包括8条RNA片段，而C型流感病毒包括7条RNA片段。A型流感病毒是唯一感染禽类的病毒型。
根据流感病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）差异，可将A型流感病毒分为不同亚型。迄今为止，HA已发现16种，NA有9种，分别以H1～H16、N1～N9表示。它们之间可发生随机组合，从而形成许多不同亚型。目前已经发现的流感病毒亚型至少有80余种，其中高致病性亚型主要是H5和H7。
2 禽流感病毒的形态和结构
禽流感病毒的形态和结构具有多形性，典型的禽流感病毒粒子在电镜下呈长丝状或球形，而感染人的H5N1病毒主要呈球形，长丝状少见。禽流感病毒多形性是一种遗传特征，经鸡胚或MDCK细胞培养物连续传代后多呈球形，直径为80～120nm，平均为100nm。禽流感病毒由囊膜和核衣壳构成，在囊膜表面有许多放射状排列的纤突，通过负染技术在电子显微镜下可明显看到表面纤突分为两类，一类呈棒状，由血凝素分子的三聚体构成；另一类呈蘑菇状，由神经氨酸酶分子的四聚体构成。两种纤突在囊膜上的比例为75∶20。病毒粒子的中心有一直径为40～60 nm的电子密度高的锥状核心。基质蛋白是病毒粒子内的主要蛋白成分，其形成的基质膜紧贴在类脂双层内面，包围着核衣壳，是维持病毒形态的结构蛋白。禽流感病毒的核衣壳呈螺旋对称，核酸为单股负链RNA，分为不同的8个片段。在核酸外面包被着螺旋排列的壳粒，主要由NP构成[3]。
3 禽流感病毒的分子生物学特征
禽流感病毒属于正黏病毒科，A型流感病毒，是有囊膜，多形态的单股负链 RNA病毒。基因组分为8个节段，由大到小依次为PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS，基因组序列长度如图1，每个RNA片段的5’末端均有13个高度保守的核苷酸，即3’-GGAACAAAGAUGAppp-5’，3’末端有12个保守核苷酸，即 3’-OHUCGUUUUCGUCC-5’。在这些共有序列中，可部分互补，形成锅柄环状结构，该结构是病毒RNA聚合酶结合所必需的核苷酸识别位点。A型流感病毒共编码11种病毒蛋白，其中8种是病毒的组成成分（HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA），另外长度最小的NS基因编码是两个非结构蛋白NS1和NS2，还有病毒粒子外的脂质囊膜伸出许多纤突，包括HA和NA两种糖蛋白，也是病毒主要的表面抗原[2]。
HA是构成病毒囊膜纤突的主要成分之一，是典型的I型糖蛋白，以二聚体形式存在于囊膜表面，其一级结构有4个结构域，分别为信号肽（又叫前导序列）、胞浆域、跨膜区和胞外域。HA蛋白在病毒吸附和穿膜过程中起关键作用，被蛋白酶水解为HA1和HA2后，带有高度保守融合序列的HA2与细胞质膜发生融合，引发病毒复制（杨志刚等，2005）。HA 蛋白也是AIV中最重要的保护性抗原，可诱导机体产生保护性抗体（Sturm et al.，2004； 陈化兰等，2004），目前HA的4～5个抗原表位已经被确认，且大多都集中在HA1上（Wiley， et al.，1981； Kaverin et al.，2002）。另外，HA在病毒吸附及穿膜过程中以及决定病毒致病力方面均起关键作用，它能否被裂解为HA1和HA2是病毒感染细胞的先决条件，也是决定病毒致病力高低的重要因素，如HA易于被切割，则毒株有较强致病力，反之则较低。此外，HA在决定病毒宿主特异性方面也起重要作用，这与病毒粒子HA受体结合位点的结构有关[3]。
NA是镶嵌在病毒双层类脂膜上的另一种表面糖蛋白，是病毒重要的表面抗原。其主要作用是水解呼吸道细胞表面特异性糖蛋白末端的唾液酸残基，将病毒颗粒从细胞受体上释放出来，帮助子代病毒离开细胞进一步扩散传播。此外NA对其周围HA的切割能力也有影响，从而在一定程度上影响病毒的致病性（曹梅，2005）。有研究表明（Hideo et al.， 1998），NA还可通过连接和隔离纤维蛋白酶原，提高该泛在性蛋白酶前体的局部浓度，从而提高裂解性，增强病毒的侵袭力[3]。 NP是构成AIV核衣壳的主要成分，具有型特异性，主要决定宿主范围（Swayne et al.， 1998），还在病毒基因组的转录和复制中起重要作用，是一种单体磷酸化的多肽，也是构成病毒核衣壳的主要成分，与基因组RNA一起构成核酸核质体（RNP），然后与RNA聚合酶共同构成病毒的核心部分。该蛋白具有型特异性，是流感病毒划分为A、B、C型的主要基础。同时其具有多种功能，除了形成病毒核衣壳外，在病毒基因组的转录和复制以及决定病毒的宿主特异性方面均有重要作用。NP还是细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的识别靶位（Lee et al.， 2004），成为诱导机体免疫保护性的一个研究目标，但用体外合成的NP免疫动物，却只能产生微弱的抗病毒感染能力[3]。
基质蛋白（M）可分为Ml和M2，属非糖基化蛋白。其中Ml位于病毒囊膜的类脂双层内侧、核衣壳的外侧，是维持病毒形态的结构蛋白，具有特异性，能够参与调控病毒的转录和被感染细胞的胞核与胞浆间的物质转运。在病毒感染宿主细胞后期，能抑制转录酶活性，减少mRNA的合成，使聚合酶复合物的生物活性几乎完全转向基因组RNA的合成。M2是一种跨膜蛋白，以四聚体形式存在于感染细胞的细胞膜上，其在HA合成过程中作为质子通道控制高尔基体内pH，在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境[3]。
非结构蛋白（NS）分为NS1和NS2，是A型流感病毒的两种非结构蛋白，它们大量存在于被感染细胞的胞核和胞浆内，而不属于病毒粒子的蛋白成分。序列分析发现，NS1和NS2有70个氨基酸的重叠，并且在氨基端有9个氨基酸是相同的。NS1蛋白为结合蛋白，具有抑制带有poly（A）结构的mRNA从细胞核内向外运输的功能（Sekellick et al.， 2000），并与宿主细胞核内的蛋白质相互作用，执行核内RNA向外运输的功能。NS2主要在晚期感染的胞浆中[3]。
多聚蛋白酶蛋白（PB1、PB2和PA）在氨基酸序列上有着共同特点，即都具有一个特异的亲核序列区，其作用是使这几种蛋白质在胞浆合成后能顺利进入细胞核。这3种聚合酶在功能上各有分工，其中PA是构成RNA聚合酶复合体，并参与RNA复制；PB1是在病毒 mRNA 合成起始后使之逐渐延长；PB2是在病毒mRNA转录的起始阶段发挥作用，识别并结合在5'端I型帽状结构上（Davis et al.，1993），同时还有限制内切酶活性，参与宿主mRNA 帽状结构的切割（Naffakh et al.，2000；Shinya et al.， 2004）。通过对1997年香港H5N1型AIV（Hatta et al.， 2001）和2003年荷兰人源 H7N7 型AIV（Fouchier et al.， 2004）PB2蛋白的分析发现，这些毒株的627位氨基酸与它们对哺乳动物的亲嗜性有关[3]。
AIV可引起大多数家禽、野禽及水禽的感染，其中以鸡和火鸡最为易感，水禽则为流感病毒的自然宿主。禽流感病毒亚型众多，不同亚型病毒之间可通过交换某些基因片段发生基因重排，出现具有新的生物学特征的病毒，而且其抗原变异极为频繁，主要包括由点突变引起的抗原漂移（antigenic drift）和不同亚型毒株同源重组产生新亚型所引起的抗原转变（antigenic shift），这为禽流感的有效防制带来了极大的困难和挑战。因此病原学的研究对于发现禽流感病毒的致病机理与诊断有重要意义[3]。
（编辑：郭远）
参考文献：
[1] 索永兵. H5N1亚型禽流感病毒DKFJ/01/02株分子生物学特性研究及反向遗传操作系统的建立[G]. 内蒙古农业大学硕士论文. 2008.
[2] 陈威. H5N1流感病毒感染雏鸭免疫器官TGF-β1mRNA表达与免疫功能抑制[G]. 东北农业大学硕士论文. 2008.
[3] 颜焰. 鹅H5亚型禽流感病毒HA1-iELISA抗体检测技术研究[G]. 新疆农业大学硕士论文. 2007.
关键词：H5N1；禽流感病毒
1997年之前，尽管人和其他灵长类动物可人工感染禽流感病毒，但在这些宿主体内禽流感病毒的复制受到很大限制，使人们一直认为禽流感病毒在自然界不能跨越种间屏障直接感染人类，自1997年首次发现禽流感病毒感染人后，禽流感的公共卫生意义发生了质的改变，禽流感成为一种能引起人类感染的新型传染病，其传播对人类健康造成巨大威胁[1]。
A型流感病毒的致病性与毒株和宿主均有很大关系，不同毒株对同一宿主或同一毒株对不同宿主的致病性差异很大，根据毒力强弱将禽流感病毒划分为无致病性、低致病性禽流感 （low pathogenic avian influenza， LPAI）和高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza， HPAI）。低致病性禽流感病毒病原体从禽类等宿主传播给鸡和鸭等易感家禽后，再经若干次循环感染，就可能发生一系列突变而转变为具有严重致死性的高致病性禽流感病毒，至今高致病性禽流感病毒包括H7和H5亚型中的部分毒株，由于其传染性极强，可引起家禽全身性感染，造成多个组织器官严重病理损伤，致死率可达100%[2]。
1 禽流感病毒分类
禽流感病毒在病毒分类学上属单股负链RNA病毒目（mononegviralles）正黏病毒科（othomyxoviridae）A型流感病毒属（influenza virus A）。根据核蛋白（NP）和基质蛋白（MP）差异，将流感病毒共分为3个型，即A、B和C型，每个型内的毒株都有基本相同的NP和MP，也就是说NP和MP具有特异性。A型病毒感染人、猪、马、海豹、水貂、鲸及所有禽类；B型病毒仅感染人类；C型病毒只感染人和猪。A型和B型流感病毒基因包括8条RNA片段，而C型流感病毒包括7条RNA片段。A型流感病毒是唯一感染禽类的病毒型。
根据流感病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）差异，可将A型流感病毒分为不同亚型。迄今为止，HA已发现16种，NA有9种，分别以H1～H16、N1～N9表示。它们之间可发生随机组合，从而形成许多不同亚型。目前已经发现的流感病毒亚型至少有80余种，其中高致病性亚型主要是H5和H7。
2 禽流感病毒的形态和结构
禽流感病毒的形态和结构具有多形性，典型的禽流感病毒粒子在电镜下呈长丝状或球形，而感染人的H5N1病毒主要呈球形，长丝状少见。禽流感病毒多形性是一种遗传特征，经鸡胚或MDCK细胞培养物连续传代后多呈球形，直径为80～120nm，平均为100nm。禽流感病毒由囊膜和核衣壳构成，在囊膜表面有许多放射状排列的纤突，通过负染技术在电子显微镜下可明显看到表面纤突分为两类，一类呈棒状，由血凝素分子的三聚体构成；另一类呈蘑菇状，由神经氨酸酶分子的四聚体构成。两种纤突在囊膜上的比例为75∶20。病毒粒子的中心有一直径为40～60 nm的电子密度高的锥状核心。基质蛋白是病毒粒子内的主要蛋白成分，其形成的基质膜紧贴在类脂双层内面，包围着核衣壳，是维持病毒形态的结构蛋白。禽流感病毒的核衣壳呈螺旋对称，核酸为单股负链RNA，分为不同的8个片段。在核酸外面包被着螺旋排列的壳粒，主要由NP构成[3]。
3 禽流感病毒的分子生物学特征
禽流感病毒属于正黏病毒科，A型流感病毒，是有囊膜，多形态的单股负链 RNA病毒。基因组分为8个节段，由大到小依次为PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS，基因组序列长度如图1，每个RNA片段的5’末端均有13个高度保守的核苷酸，即3’-GGAACAAAGAUGAppp-5’，3’末端有12个保守核苷酸，即 3’-OHUCGUUUUCGUCC-5’。在这些共有序列中，可部分互补，形成锅柄环状结构，该结构是病毒RNA聚合酶结合所必需的核苷酸识别位点。A型流感病毒共编码11种病毒蛋白，其中8种是病毒的组成成分（HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA），另外长度最小的NS基因编码是两个非结构蛋白NS1和NS2，还有病毒粒子外的脂质囊膜伸出许多纤突，包括HA和NA两种糖蛋白，也是病毒主要的表面抗原[2]。
HA是构成病毒囊膜纤突的主要成分之一，是典型的I型糖蛋白，以二聚体形式存在于囊膜表面，其一级结构有4个结构域，分别为信号肽（又叫前导序列）、胞浆域、跨膜区和胞外域。HA蛋白在病毒吸附和穿膜过程中起关键作用，被蛋白酶水解为HA1和HA2后，带有高度保守融合序列的HA2与细胞质膜发生融合，引发病毒复制（杨志刚等，2005）。HA 蛋白也是AIV中最重要的保护性抗原，可诱导机体产生保护性抗体（Sturm et al.，2004； 陈化兰等，2004），目前HA的4～5个抗原表位已经被确认，且大多都集中在HA1上（Wiley， et al.，1981； Kaverin et al.，2002）。另外，HA在病毒吸附及穿膜过程中以及决定病毒致病力方面均起关键作用，它能否被裂解为HA1和HA2是病毒感染细胞的先决条件，也是决定病毒致病力高低的重要因素，如HA易于被切割，则毒株有较强致病力，反之则较低。此外，HA在决定病毒宿主特异性方面也起重要作用，这与病毒粒子HA受体结合位点的结构有关[3]。
NA是镶嵌在病毒双层类脂膜上的另一种表面糖蛋白，是病毒重要的表面抗原。其主要作用是水解呼吸道细胞表面特异性糖蛋白末端的唾液酸残基，将病毒颗粒从细胞受体上释放出来，帮助子代病毒离开细胞进一步扩散传播。此外NA对其周围HA的切割能力也有影响，从而在一定程度上影响病毒的致病性（曹梅，2005）。有研究表明（Hideo et al.， 1998），NA还可通过连接和隔离纤维蛋白酶原，提高该泛在性蛋白酶前体的局部浓度，从而提高裂解性，增强病毒的侵袭力[3]。 NP是构成AIV核衣壳的主要成分，具有型特异性，主要决定宿主范围（Swayne et al.， 1998），还在病毒基因组的转录和复制中起重要作用，是一种单体磷酸化的多肽，也是构成病毒核衣壳的主要成分，与基因组RNA一起构成核酸核质体（RNP），然后与RNA聚合酶共同构成病毒的核心部分。该蛋白具有型特异性，是流感病毒划分为A、B、C型的主要基础。同时其具有多种功能，除了形成病毒核衣壳外，在病毒基因组的转录和复制以及决定病毒的宿主特异性方面均有重要作用。NP还是细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的识别靶位（Lee et al.， 2004），成为诱导机体免疫保护性的一个研究目标，但用体外合成的NP免疫动物，却只能产生微弱的抗病毒感染能力[3]。
基质蛋白（M）可分为Ml和M2，属非糖基化蛋白。其中Ml位于病毒囊膜的类脂双层内侧、核衣壳的外侧，是维持病毒形态的结构蛋白，具有特异性，能够参与调控病毒的转录和被感染细胞的胞核与胞浆间的物质转运。在病毒感染宿主细胞后期，能抑制转录酶活性，减少mRNA的合成，使聚合酶复合物的生物活性几乎完全转向基因组RNA的合成。M2是一种跨膜蛋白，以四聚体形式存在于感染细胞的细胞膜上，其在HA合成过程中作为质子通道控制高尔基体内pH，在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境[3]。
非结构蛋白（NS）分为NS1和NS2，是A型流感病毒的两种非结构蛋白，它们大量存在于被感染细胞的胞核和胞浆内，而不属于病毒粒子的蛋白成分。序列分析发现，NS1和NS2有70个氨基酸的重叠，并且在氨基端有9个氨基酸是相同的。NS1蛋白为结合蛋白，具有抑制带有poly（A）结构的mRNA从细胞核内向外运输的功能（Sekellick et al.， 2000），并与宿主细胞核内的蛋白质相互作用，执行核内RNA向外运输的功能。NS2主要在晚期感染的胞浆中[3]。
多聚蛋白酶蛋白（PB1、PB2和PA）在氨基酸序列上有着共同特点，即都具有一个特异的亲核序列区，其作用是使这几种蛋白质在胞浆合成后能顺利进入细胞核。这3种聚合酶在功能上各有分工，其中PA是构成RNA聚合酶复合体，并参与RNA复制；PB1是在病毒 mRNA 合成起始后使之逐渐延长；PB2是在病毒mRNA转录的起始阶段发挥作用，识别并结合在5'端I型帽状结构上（Davis et al.，1993），同时还有限制内切酶活性，参与宿主mRNA 帽状结构的切割（Naffakh et al.，2000；Shinya et al.， 2004）。通过对1997年香港H5N1型AIV（Hatta et al.， 2001）和2003年荷兰人源 H7N7 型AIV（Fouchier et al.， 2004）PB2蛋白的分析发现，这些毒株的627位氨基酸与它们对哺乳动物的亲嗜性有关[3]。
AIV可引起大多数家禽、野禽及水禽的感染，其中以鸡和火鸡最为易感，水禽则为流感病毒的自然宿主。禽流感病毒亚型众多，不同亚型病毒之间可通过交换某些基因片段发生基因重排，出现具有新的生物学特征的病毒，而且其抗原变异极为频繁，主要包括由点突变引起的抗原漂移（antigenic drift）和不同亚型毒株同源重组产生新亚型所引起的抗原转变（antigenic shift），这为禽流感的有效防制带来了极大的困难和挑战。因此病原学的研究对于发现禽流感病毒的致病机理与诊断有重要意义[3]。
（编辑：郭远）
参考文献：
[1] 索永兵. H5N1亚型禽流感病毒DKFJ/01/02株分子生物学特性研究及反向遗传操作系统的建立[G]. 内蒙古农业大学硕士论文. 2008.
[2] 陈威. H5N1流感病毒感染雏鸭免疫器官TGF-β1mRNA表达与免疫功能抑制[G]. 东北农业大学硕士论文. 2008.
[3] 颜焰. 鹅H5亚型禽流感病毒HA1-iELISA抗体检测技术研究[G]. 新疆农业大学硕士论文. 2007.