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摘要：【目的】建立和优化固氮链霉菌Streptomyces chartreusi WZS021（简称菌株WZS021，下同）的接合转移体系，以丰富固氮链霉菌基因片段转移技术。【方法】以大肠杆菌Escherichia coli ET12567（pUZ8002）为供体菌，携带整合型质粒pSET152的菌株WZS021为受体菌，进行菌株WZS021接合转移。【结果】选择高氏一号培养基为菌株WZS021接合转移培养基，50 ℃热激10 min，供受比为1∶10，涂布20.0 mg/L安普霉素、接合转移12 h后覆盖抗生素，添加MgCl2终浓度为5.0 mmol/L时接合转移效率最高，达3.24×10-6。【结论】通过确定适用于菌株WZS021接合转移条件建立的菌株WZS021遗传转化体系，有助于今后插入标记基因确定该菌的固氮定殖位点及导入外源基因的操作。
关键词： 固氮链霉菌WZS021；接合转移；优化；pSET152
中圖分类号： Q939.113 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）04-0581-06
Abstract：【Objective】The present study was conducted to establish and optimize transconjugation system of Streptomyces chartreusis WZS021（hereinafter referred to as strain WZS021），in order to enrich strain WZS021 gene fragment transfer technology. 【Method】As donor strain，Escherichia coli ET12567（pUZ8002） contained integrative plasmid pSET152. Strain WZS021 was recipient. Transconjugation was conducted on strain WZS021. 【Result】The optimal conditions were as follows：Gauze’s medium No.1 as the transconjugation medium， heat shock at 50 ℃ for 10 min， donor-recipient ratio 1∶10，20.0 mg/L apramycin coverage 12 h post transconjugation， and adding MgCl2 till final concentration of 5.0 mmol/L. Under these conditions，the transconjugation efficiency was the highest， which was up to 3.24×10-6. 【Conclusion】The suitable transconjugation conditions for strain WZS021 are ascertained， and an effective genetic transformation system for strain WZS021 is established based on it. It is helpful to insert marker genes to detect nitrogen fixation sites of the strain and exogenous gene transfer.
Key words： Streptomyces chartreusi WZS021； transconjugation； optimization； pSET152
0 引言
【研究意义】固氮微生物是近年来生物固氮研究的热点，有效利用固氮微生物可减少化肥使用量，改善土壤和生态环境质量，提高农作物产量和品质，有利于农业结构调整，提高经济效益、生态效益和社会效益（李杨瑞，2010；李剑锋等，2015）。链霉菌是一种放线菌，全世界约2/3的抗生素产自该菌属（莫宏波等，2004），在医学和农业等领域均有突出地位。固氮链霉菌Streptomyces chartreusi WZS021（简称菌株WZS021，下同）是一株具有高固氮能力的链霉菌（Wang et al.，2016），目前对该菌种接合转移研究方面鲜有报道，其接合转移的具体条件尚不清楚。因此，掌握固氮微生物的生物技术，建立并优化固氮链霉菌S. chartreusi WZS021的接合转移体系，对今后开展菌株WZS021在农业上的应用研究具有重要意义。【前人研究进展】链霉菌的遗传转化主要采用原生质体转化法、接合转移法和电转化法等（Veal et al.，1992；Christensen et al.，1996；吴胜和夏焕章，2002）。赫卫清和王以光（2006）研究发现，链霉菌高度分化，遗传背景复杂，不同菌株的接合转移条件不完全相同。王航等（2014）研究表明，接合转移法以其操作程序简单、时间成本小、转化效率可观和能使外源DNA避开胞外核酸酶降解等优点成为链霉菌转化的主要遗传技术。【本研究切入点】前人对链霉菌属的接合转移研究主要集中在抗生素产生菌上，如产雷帕霉素的吸水链霉菌NRRL5491（杨旻和陶美凤，2007）、产放线紫红素的阿维链霉菌NRRL8165（余姣姣和陶美凤，2010）和产达托霉素的玫瑰孢链霉菌NRRL11379（王航等，2014）等，而关于固氮功能型链霉菌遗传转化体系的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】在不同培养基、热激温度、供受比、抗生素使用浓度和时间及Mg+浓度等条件下对菌株WZS021的接合转移系统进行优化，以期获得高效、便捷的接合转移方法，以丰富菌株WZS021的基因片段转移技术。 1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 培养基 LB和高氏一号培养基购自广东环凯生物科技有限公司，MS、M10、YEME和2CM培养基参考Kieser等（2000）的方法使用，2×YT培养基参考Sambrook等（1989）的方法使用。
1. 1. 2 质粒及菌种 质粒pSET152（Bierman et al.，1992）、大肠杆菌Escherichia coli DH5α、E. coli ET12567（pUZ8002）和固氮链霉菌S. chartreusi WZS021（16S rRNA基因GenBank登录号KX775948）均由亚热带农业生物资源保护和利用国家重点实验室保存提供。
1. 1. 3 试剂及抗生素 所有抗生素均购自北京索莱宝科技有限公司，PCR相关产品购自北京康为世纪生物科技有限公司，其余试剂购自国药集团。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 链霉菌培养及DNA提取 参照刘志恒和姜成林（2004）的方法进行链霉菌培养及总DNA和质粒提取。
1. 2. 2 抗生素最小抑菌浓度测定 制备含0～10.0 mg/L（梯度为1.0 mg/L）安普霉素的高氏一号培养基，将约108个菌株WZS021的孢子均匀涂布在每个培养基上，28 ℃培养10 d，期间每天观察，根据链霉菌的生长情况确定最小抑菌浓度为3.0 mg/L。
1. 2. 3 大肠杆菌与链霉菌属间接合转移 参照Flett等（1997）的方法进行大肠杆菌与链霉菌属间的接合转移。将质粒pSET152转入大肠杆菌ET12567（pUZ8002），得到转化子ET12567（pUZ8002/pSET152），菌株保存于-80 ℃冰箱。使用时将转化子ET12567（pUZ8002/pSET152）取出培养过夜，再将培养物转接至新鲜的100.0 mL LB培养基（含50.0 mg/L卡那霉素、25.0 mg/L氯霉素和50.0 mg/L安普霉素）中，37 ℃培养至OD600为0.4～0.6时收集菌体。用等体积的新鲜LB洗涤菌体两次以去除抗生素，再以10.0 mL LB悬浮备用。取新鲜的链霉菌孢子，使其悬浮于5.0 mL 0.05 mol/L TES（pH=8.0）中，50 ℃水浴热激10 min，冷却至室温后加入等体积2×YT培养基，37 ℃摇床分别培养2～3 h，离心收集孢子并重新悬浮于适量水或TES中，在振荡器上打散孢子后与收集到的转化子ET12567（pUZ8002/pSET152）混合并涂布，于28 ℃培养10～20 h，用适当浓度的安普霉素和萘啶酮酸覆盖，再于28 ℃培养6～8 d可得到接合转移子。受体孢子数采用平板计数法（赵斌和何绍江，2002）计数，接合转移频率为接合子数目除以受体孢子数，取3次平行试验的平均值。
1. 2. 4 接合转移子验证 将1.2.3获得的接合转移子在含安普霉素和萘啶酮酸的培养基上划线，反复几次以验证接合转移子的稳定性，再转接于液体培养基，2～3 d后收集菌体，提取总DNA作为PCR验證的模板。以pSET152质粒DNA为阳性对照模板，野生型菌株WZS021 DNA为阴性对照。扩增引物（杨旻等，2007）为Apr1（5′-CAGTTGACCCAGGGCTGTC-3′）和Apr2（5′-GCAATACGAATGGCGAAAA-3′）。PCR扩增程序：94 ℃预变性，5 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环；72 ℃终延伸10 min，扩增出694 bp安普霉素抗性基因。
2 结果与分析
2. 1 培养基对菌株WZS021接合转移效率的影响
选用MS、2CM、M10、YEME和高氏一号等5种培养基为大肠杆菌与链霉菌接合转移培养基。从图1可看出，高氏一号培养基的接合转移效率为1.69×10-6，高于MS和2CM培养基的接合转移效率，而使用M10和YEME培养基时接合转移效率低至无法计算或得不到接合转移子，因此对固氮放线菌进行接合转移操作时选择高氏一号培养基为接合转移培养基。
2. 2 热激温度对菌株WZS021接合转移效率的影响
在链霉菌的接合转移操作中，热激温度对不同链霉菌的孢子萌发效果不同，对链霉菌接合转移效率也有一定影响（孔会利等，2006）。本研究选取45、50和55 ℃3个热激温度对链霉菌孢子进行热激处理，每处理热激10 min，结果（图2）表明，热激温度为50 ℃时接合转移效率高于45和55 ℃两个处理，因此热激温度为50 ℃时孢子萌发情况更适于接合转移操作要求。
2. 3 供体菌与受体菌比例对菌株WZS021接合转移效率的影响
在大肠杆菌与链霉菌属间的接合转移中，供体菌数量过多会造成供体菌与受体菌同时在培养基上生长，无法进行下一步操作；受体菌数量过多则转化子假阳性的概率会升高。因此，选择适当的供受比是接合转移操作中的重要一步。本研究选择供受比1000∶1、100∶1、10∶1、1∶1、1∶10、1∶100和1∶1000进行比较，结果（图3）表明，供受比为1∶10时，接合转移效率最高，供受比为10∶1、1∶1和1∶100时可长出少量转化子，供受比为1000∶1、100∶1和1∶1000时出现大肠杆菌生长或无转化子现象。
2. 4 抗生素浓度对菌株WZS021接合转移效率的影响
由表1可知，选用20.0和50.0 mg/L两种浓度安普霉素和萘啶酮酸对接合转移子进行抗生素浓度筛选，当培养基上萘啶酮酸浓度为20.0 mg/L时，20.0和50.0 mg/L安普霉素均无法抑制大肠杆菌生长，出现大肠杆菌与转化子同时生长现象；当萘啶酮酸浓度为50.0 mg/L时，20.0 mg/L安普霉素的接合转移效率约为50.0 mg/L安普霉素接合转移效率的3倍，为2.79×10-6。 2. 5 抗生素覆盖时间对菌株WZS021接合转移效率的影响
通常情况下链霉菌接合转移过程中抗生素覆盖时间为16～20 h，覆盖时间过长，大肠杆菌生长出的菌落会与链霉菌混在一起，无法进行下一步试验；时间过短则接合转移不完全，效率低下。本研究分别在涂布大肠杆菌与链霉菌混合菌液10、12、14、16、18和20 h后覆盖抗生素，以涂布混合菌液12 h后覆盖抗生素的接合转移效率最高，涂布混合菌液14 h后覆盖抗生素也能获得可观数量的接合转移子，涂布混合菌液10 和16 h后覆盖抗生素仅获得少量的转移子，而在涂布混合菌液18和20 h后覆盖抗生素无法抑制大肠杆菌生长（图4）。
2. 6 MgCl2浓度对菌株WZS021接合转移效率的影响
在接合转移培养基中加入适量的MgCl2可提高接合转移效率。为确定接合转移的最佳MgCl2浓度，本研究选取终浓度为0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0和50.0 mmol/L的培养基以观察接合转移子生长情况。观察结果（图5）表明，在终浓度为0～30.0 mmol/L的培养基上均可产生数量可观的接合转移子，终浓度为50.0 mmol/L的培养基上未产生接合转移子。其中，终浓度为5.0、10.0和20.0 mmol/L培养基上产生转化子的数量明显多于其他浓度。
2. 7 甘氨酸对菌株WZS021接合转移效率的影响
在培养基中加入MgCl2使其终浓度为5.0 mmol/L的前提下，添加甘氨酸使培养基甘氨酸终浓度分别为0、1%、2%、3%、4%、5%和6%，以检测甘氨酸对菌株WZS021接合转移效率的影响。检测结果（图6）显示，甘氨酸终浓度为0～3%时，接合转移效率变化无明显差异，其中添加1%甘氨酸接合转移效率最高（3.24×10-6），甘氨酸浓度大于3%时接合转移效率降低，说明不添加甘氨酸对接合转移效率无影响。
2. 8 接合转移子的稳定性及PCR验证
将1.2.3获得的接合转移子转接至无抗性的高氏一号培养基上，生长出菌落后再接种于含50.0 mg/L萘啶酮酸和20.0 mg/L安普霉素的高氏一号培养基上，传代培养6～8次，随机挑选4株单菌落分别置于YEME液体培养基中以提取DNA，进行PCR扩增均获得大小约700 bp的条带（图7），表明质粒pSET152已转入链霉菌中并在链霉菌中遗传稳定，而以野生型菌株WZS021的DNA为阴性对照未扩增出条带。将PCR产物胶回收送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序，获得的测序结果在NCBI上进行比对分析，证实其为目的基因片段。
3 讨论
pSET152是一种基因整合型质粒，只有整合到染色体上才能稳定存在于受体菌中（朱云霞等，2012）。不同链霉菌种导入外源基因的方法不同，接合转移效率差异也很明显（刘雪娇等，2012）。本研究结果表明，菌株WZS021可在M10和YEME培养基上生长，但在接合转移系统中无接合子出现，其具体机制尚不清楚，不排除其他培养基更适合该菌接合转移操作的可能性，下一步研究应选取更多培养基进行检测；选用的3个热激温度中，55 ℃促进孢子预萌发的效率明显低于45和50 ℃处理，与一般接合转移操作（Kieser et al.，2000）中热激温度处理结果相同。王芬等（2012）研究发现，供受比为10∶1时最适合Streptomyces griseochromogenes的接合转移操作；杨卓等（2016）报道供受比为100∶1对肉色吸水链霉菌 SH121的接合转移效率更高。在本研究中，菌株WZS021的接合转移操作更适合在供受比1∶10条件下完成，说明不同链霉菌种在接合转移操作中与大肠杆菌的竞争情况存在差异。在对安普霉素最小抑菌浓度的测定中发现，3.0 mg/L抗生素足以抑制链霉菌生长，但为了避免接合子出现菌落连成一片不利于验证的情况，本研究选择50.0 mg/L萘啶酮酸和20.0 mg/L安普霉素进行抗生素浓度筛选。抗生素覆盖时间对接合转移影响的研究结果表明，链霉菌在接合转移操作中最佳抗生素覆盖时间为12 h，抗生素覆盖时间偏长会导致大肠杆菌出现，推测菌株WZS021的次生代谢产物中较少或没有抑制大肠杆菌生长的物质，有别于王航等（2014）对玫瑰孢链霉菌NRRL11379接合转移系统研究中抗生素覆蓋时间最佳为20 h的结果。Mg2+是酶活中心的组成部分，大量研究（杨卓等，2016；张万垚等，2012；朱云霞等，2012）表明，在一定范围内Mg2+浓度的增加能提高接合转移效率。本研究中加入5.0～20.0 mmol/L MgCl2后可较大幅度提高接合转移效率，但MgCl2浓度大于20.0 mmol/L后接合转移效率并未随之升高，推测与高氏一号培养基本身含有少量MgSO4有关，Mg2+浓度过高反而会影响孢子形成。有报道称适量的甘氨酸可提高S. griseochromogenes（刘雪娇等，2012）和S. pulveraceus（王芬等，2012）的接合转移效率，本研究结果与其存在差异，0～3%甘氨酸未影响菌株WZS021的接合转移效率，甘氨酸浓度大于3%时反而会降低接合转移效率。
4 结论
本研究确定了适用于固氮链霉菌S. chartreusi WZS021的接合转移条件，建立了一套行之有效的固氮链霉菌S. chartreusi WZS021遗传转化体系，有助于今后插入标记基因确定该菌株的固氮定殖位点及导入外源基因的操作。
参考文献：
赫卫清，王以光. 2006. 吸水链霉菌17997 格尔德霉素部分生物合成基因簇的克隆和分析[J]. 生物工程学报，22（6）：902-906.
He W Q，Wang Y G. 2006. Cloning and analysis of geldanamycin partial biosynthetic gene cluster of Streptomyces hygrosco- picus 17997[J]. Chinese Journal of Biotechnology，22（6）：902-906.
孔会利，王超，肖亮，李文成. 2007. 高G+C含量模板进行扩增的高效缓冲液体系的建立[J]. 华中农业大学学报，25（2）：106-109.
Kong H L，Wang C，Xiao L，Li W C. 2007. Establishment of efficient buffer of PCR for template with high G+C content[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，25（2）：106-109.
李劍峰，杨鑫，张淑卿，杜建雄，刘健. 2015. 2种植物内生固氮菌对燕麦种子萌发及幼苗生长的效果[J]. 西南农业学报，28（6）：2465-2468.
Li J F，Yang X，Zhang S Q，Du J X，Liu J. 2015. Effects of two endophytic diazotrophs（Klepsiella oxytoca Msp2c and Pseudomonas fluorescence LM531） on seed germination and seedling growth in avena sativa[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，28（6）：2465-2468.
李杨瑞. 2010. 现代甘蔗学[M]. 北京：中国农业出版社.
Li Y R. 2010. Modern Sugarcane Science[M]. Beijing：China Agriculture Press.
刘雪娇，牛铭山，邱荣国，唐莉. 2012. Fostriecin产生菌Streptomyces pulveraceus遗传转化体系的建立与优化[J]. 微生物学通报，39（3）：371-377.
Liu X J，Niu M S，Qiu R G，Tang L. 2012. Establishment and optimization of the conjugal transfer system of fostriecin producer Streptomyces pulveraceus[J]. Microbiology China，39（3）：371-377.
刘志恒，姜成林. 2004. 放线菌现代生物学与生物技术[M]. 北京：科学出版社.
Liu Z H，Jiang C L. 2004. Actinobacteria in Modern Biology and Biotechnology[M]. Beijing：Science Press.
莫宏波，白林泉，王胜兰，杨克. 2004. 大肠杆菌—链霉菌高效接合载体的构建及其应用[J]. 生物工程学报，20（5）：662-666.
Mo H B，Bai L Q，Wang S L，Yang K. 2004. Construction of effi-
cient conjugal plasmids between Escherichia coli and streptomycetes[J]. Chinese Journal of Biotechnology，20（5）：662-666.
王芬，邱荣国，唐莉. 2012. 变构菌素产生菌S. griseochromogenes接合转移体系建立与优化[J]. 大连理工大学学报，53（3）：338-342.
Wang F，Qiu R G，Tang L. 2012. Establishment and optimization for conjugal transfer system of tautomycetin-producing strain S. griseochromogenes[J]. Journal of Dalian University of Technology，53（3）：338-342.
王航，王文轶，吴旻，彭冉，王旻. 2014. 达托霉素产生菌玫瑰孢链霉菌NRRL11379接合转移系统的建立与优化[J]. 药物生物技术，21（3）：194-198.
Wang H，Wang W Y，Wu M，Peng R，Wang M. 2014. Establishment and optimization of a conjugation system for the daptomycin producer Streptomyces roseosporus NRRL11379[J]. Pharmaceutical Biotechnology，21（3）：194-198.
吴胜，夏焕章. 2002. 链霉菌基因转移的方法[J]. 生物工程进展，22（1）：91-95.
Wu S，Xia H Z. 2002. The methods of gene transfer in Streptomyces[J]. China Biotechnology，22（1）：91-95.
杨旻，陶美凤. 2007. 雷帕霉素产生菌吸水链霉菌NRRL5491 接合转移系统的建立[J]. 华中农业大学学报，26（5）：637-641.
Yang M，Tao M F. 2007. Establishment of a conjugation system for the rapamycin producer Streptomyces hygroscopicus NRRL5491[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，26（5）：637-641. 杨卓，李佳丽，肖乐，何璟. 2016. 肉色吸水链霉菌SH121接合转移系统的建立[J]. 华中农业大学学报，35（4）：49-55.
Yang Z，Li J L，Xiao L，He J. 2016. Establishing intergeneric conjugation system in Streptomyces carneohygroscopicus SH121[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，35（4）：49-55.
余姣姣，陶美凤. 2010. 无机盐对阿维链霉菌接合转移及异源表达放线紫红素的影响[J]. 微生物学报，50（11）：1556-1561.
Yu J J，Tao M F. 2010. Effect of inorganic salts on the conjugation and heterologous expression of actinorhodin in Streptomyces avermitilis[J]. Acta Microbiologica Sinica，50（11）：1556-1561.
张万垚，鲁慧囡，何璟. 2012. 酪蛋白水解物对雷帕霉素产生菌Streptomyces hygroscopicus ATCC29253接合转移效率的影响[J]. 微生物学报，52（2）：198-205.
Zhang W Y，Lu H N，He J. 2012. Effect of casamino acid on intergeneric conjugation in rapamycin-producing Streptomyces hygroscopicus ATCC29253[J]. Acta Microbiologica Sinica，52（2）：198-205.
赵斌，何绍江. 2002. 微生物学实验[M]. 北京：科学出版社.
Zhao B，He S J. 2002. Microbiology Experiment[M]. Beijing：Science Press.
朱云霞，廖思懿，叶江，张惠展. 2012. 抗生素Bagremycin生产菌Streptomyces sp. Tü 4128 接合转移系统的建立[J]. 华东理工大学学报（自然科学版），38（2）：160-164.
Zhu Y X，Liao S Y，Ye J，Zhang H Z. 2012. Development of an intergeneric conjugal transfer system for Streptomyces sp. Tü 4128，a producer of bagremycins[J]. Journal of East China University of Science and Technology（Natural Science Edition），38（2）：160-164.
Bierman M，Logan R，O’Brien K，Seno E T，Rao R N，Schoner B E. 1992. Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomycess spp.[J]. Gene，116（1）：43-49.
Christensen B B，Sternberg C，Molin S. 1996. Bacterial plasmid conjugation on semi-solid surfaces monitored with the green fluorescent protein（GFP） from Aequoreavictoria as a mar-
ker[J]. Gene，173（1）：59-65.
Flett F，Mersinias V，Smith C P. 1997. High efficiency intergeneric conjugal transfer of plasmid DNA from Escherichia coli to methyl DNA restricting Streptomyces[J]. FEMS Microbiology Letters，155：223-229.
Kieser T，Bibb M J，Buttner M J，Chater K F，Hopwood D A. 2000. Practical Streptomyces Genetics[M]. Norwich：The John Innes Foundation，UK.
Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T. 1989. Molecular Cloning：A Laboratory Manual[M]. New York：Cold Spring Harbor Labo-
ratory Press.
Veal D A，Stokes H W，Daggard G. 1992. Genetic exchange in natural microbial communities[J]. Advances in Microbial Ecology，12：383-430.
Wang Z，Solanki M K，Pang F，Singh R K，Yang L T，Li Y R，Li H B，Zhu K，Xing Y X. 2016. Identification and efficiency of a nitrogen-fixing endophytic actinobacterial strain from sugarcane[J]. Sugar Technology，doi：10.1007/s12355-016-0498-y.
（責任编辑 思利华）
关键词： 固氮链霉菌WZS021；接合转移；优化；pSET152
中圖分类号： Q939.113 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）04-0581-06
Abstract：【Objective】The present study was conducted to establish and optimize transconjugation system of Streptomyces chartreusis WZS021（hereinafter referred to as strain WZS021），in order to enrich strain WZS021 gene fragment transfer technology. 【Method】As donor strain，Escherichia coli ET12567（pUZ8002） contained integrative plasmid pSET152. Strain WZS021 was recipient. Transconjugation was conducted on strain WZS021. 【Result】The optimal conditions were as follows：Gauze’s medium No.1 as the transconjugation medium， heat shock at 50 ℃ for 10 min， donor-recipient ratio 1∶10，20.0 mg/L apramycin coverage 12 h post transconjugation， and adding MgCl2 till final concentration of 5.0 mmol/L. Under these conditions，the transconjugation efficiency was the highest， which was up to 3.24×10-6. 【Conclusion】The suitable transconjugation conditions for strain WZS021 are ascertained， and an effective genetic transformation system for strain WZS021 is established based on it. It is helpful to insert marker genes to detect nitrogen fixation sites of the strain and exogenous gene transfer.
Key words： Streptomyces chartreusi WZS021； transconjugation； optimization； pSET152
0 引言
【研究意义】固氮微生物是近年来生物固氮研究的热点，有效利用固氮微生物可减少化肥使用量，改善土壤和生态环境质量，提高农作物产量和品质，有利于农业结构调整，提高经济效益、生态效益和社会效益（李杨瑞，2010；李剑锋等，2015）。链霉菌是一种放线菌，全世界约2/3的抗生素产自该菌属（莫宏波等，2004），在医学和农业等领域均有突出地位。固氮链霉菌Streptomyces chartreusi WZS021（简称菌株WZS021，下同）是一株具有高固氮能力的链霉菌（Wang et al.，2016），目前对该菌种接合转移研究方面鲜有报道，其接合转移的具体条件尚不清楚。因此，掌握固氮微生物的生物技术，建立并优化固氮链霉菌S. chartreusi WZS021的接合转移体系，对今后开展菌株WZS021在农业上的应用研究具有重要意义。【前人研究进展】链霉菌的遗传转化主要采用原生质体转化法、接合转移法和电转化法等（Veal et al.，1992；Christensen et al.，1996；吴胜和夏焕章，2002）。赫卫清和王以光（2006）研究发现，链霉菌高度分化，遗传背景复杂，不同菌株的接合转移条件不完全相同。王航等（2014）研究表明，接合转移法以其操作程序简单、时间成本小、转化效率可观和能使外源DNA避开胞外核酸酶降解等优点成为链霉菌转化的主要遗传技术。【本研究切入点】前人对链霉菌属的接合转移研究主要集中在抗生素产生菌上，如产雷帕霉素的吸水链霉菌NRRL5491（杨旻和陶美凤，2007）、产放线紫红素的阿维链霉菌NRRL8165（余姣姣和陶美凤，2010）和产达托霉素的玫瑰孢链霉菌NRRL11379（王航等，2014）等，而关于固氮功能型链霉菌遗传转化体系的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】在不同培养基、热激温度、供受比、抗生素使用浓度和时间及Mg+浓度等条件下对菌株WZS021的接合转移系统进行优化，以期获得高效、便捷的接合转移方法，以丰富菌株WZS021的基因片段转移技术。 1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 培养基 LB和高氏一号培养基购自广东环凯生物科技有限公司，MS、M10、YEME和2CM培养基参考Kieser等（2000）的方法使用，2×YT培养基参考Sambrook等（1989）的方法使用。
1. 1. 2 质粒及菌种 质粒pSET152（Bierman et al.，1992）、大肠杆菌Escherichia coli DH5α、E. coli ET12567（pUZ8002）和固氮链霉菌S. chartreusi WZS021（16S rRNA基因GenBank登录号KX775948）均由亚热带农业生物资源保护和利用国家重点实验室保存提供。
1. 1. 3 试剂及抗生素 所有抗生素均购自北京索莱宝科技有限公司，PCR相关产品购自北京康为世纪生物科技有限公司，其余试剂购自国药集团。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 链霉菌培养及DNA提取 参照刘志恒和姜成林（2004）的方法进行链霉菌培养及总DNA和质粒提取。
1. 2. 2 抗生素最小抑菌浓度测定 制备含0～10.0 mg/L（梯度为1.0 mg/L）安普霉素的高氏一号培养基，将约108个菌株WZS021的孢子均匀涂布在每个培养基上，28 ℃培养10 d，期间每天观察，根据链霉菌的生长情况确定最小抑菌浓度为3.0 mg/L。
1. 2. 3 大肠杆菌与链霉菌属间接合转移 参照Flett等（1997）的方法进行大肠杆菌与链霉菌属间的接合转移。将质粒pSET152转入大肠杆菌ET12567（pUZ8002），得到转化子ET12567（pUZ8002/pSET152），菌株保存于-80 ℃冰箱。使用时将转化子ET12567（pUZ8002/pSET152）取出培养过夜，再将培养物转接至新鲜的100.0 mL LB培养基（含50.0 mg/L卡那霉素、25.0 mg/L氯霉素和50.0 mg/L安普霉素）中，37 ℃培养至OD600为0.4～0.6时收集菌体。用等体积的新鲜LB洗涤菌体两次以去除抗生素，再以10.0 mL LB悬浮备用。取新鲜的链霉菌孢子，使其悬浮于5.0 mL 0.05 mol/L TES（pH=8.0）中，50 ℃水浴热激10 min，冷却至室温后加入等体积2×YT培养基，37 ℃摇床分别培养2～3 h，离心收集孢子并重新悬浮于适量水或TES中，在振荡器上打散孢子后与收集到的转化子ET12567（pUZ8002/pSET152）混合并涂布，于28 ℃培养10～20 h，用适当浓度的安普霉素和萘啶酮酸覆盖，再于28 ℃培养6～8 d可得到接合转移子。受体孢子数采用平板计数法（赵斌和何绍江，2002）计数，接合转移频率为接合子数目除以受体孢子数，取3次平行试验的平均值。
1. 2. 4 接合转移子验证 将1.2.3获得的接合转移子在含安普霉素和萘啶酮酸的培养基上划线，反复几次以验证接合转移子的稳定性，再转接于液体培养基，2～3 d后收集菌体，提取总DNA作为PCR验證的模板。以pSET152质粒DNA为阳性对照模板，野生型菌株WZS021 DNA为阴性对照。扩增引物（杨旻等，2007）为Apr1（5′-CAGTTGACCCAGGGCTGTC-3′）和Apr2（5′-GCAATACGAATGGCGAAAA-3′）。PCR扩增程序：94 ℃预变性，5 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环；72 ℃终延伸10 min，扩增出694 bp安普霉素抗性基因。
2 结果与分析
2. 1 培养基对菌株WZS021接合转移效率的影响
选用MS、2CM、M10、YEME和高氏一号等5种培养基为大肠杆菌与链霉菌接合转移培养基。从图1可看出，高氏一号培养基的接合转移效率为1.69×10-6，高于MS和2CM培养基的接合转移效率，而使用M10和YEME培养基时接合转移效率低至无法计算或得不到接合转移子，因此对固氮放线菌进行接合转移操作时选择高氏一号培养基为接合转移培养基。
2. 2 热激温度对菌株WZS021接合转移效率的影响
在链霉菌的接合转移操作中，热激温度对不同链霉菌的孢子萌发效果不同，对链霉菌接合转移效率也有一定影响（孔会利等，2006）。本研究选取45、50和55 ℃3个热激温度对链霉菌孢子进行热激处理，每处理热激10 min，结果（图2）表明，热激温度为50 ℃时接合转移效率高于45和55 ℃两个处理，因此热激温度为50 ℃时孢子萌发情况更适于接合转移操作要求。
2. 3 供体菌与受体菌比例对菌株WZS021接合转移效率的影响
在大肠杆菌与链霉菌属间的接合转移中，供体菌数量过多会造成供体菌与受体菌同时在培养基上生长，无法进行下一步操作；受体菌数量过多则转化子假阳性的概率会升高。因此，选择适当的供受比是接合转移操作中的重要一步。本研究选择供受比1000∶1、100∶1、10∶1、1∶1、1∶10、1∶100和1∶1000进行比较，结果（图3）表明，供受比为1∶10时，接合转移效率最高，供受比为10∶1、1∶1和1∶100时可长出少量转化子，供受比为1000∶1、100∶1和1∶1000时出现大肠杆菌生长或无转化子现象。
2. 4 抗生素浓度对菌株WZS021接合转移效率的影响
由表1可知，选用20.0和50.0 mg/L两种浓度安普霉素和萘啶酮酸对接合转移子进行抗生素浓度筛选，当培养基上萘啶酮酸浓度为20.0 mg/L时，20.0和50.0 mg/L安普霉素均无法抑制大肠杆菌生长，出现大肠杆菌与转化子同时生长现象；当萘啶酮酸浓度为50.0 mg/L时，20.0 mg/L安普霉素的接合转移效率约为50.0 mg/L安普霉素接合转移效率的3倍，为2.79×10-6。 2. 5 抗生素覆盖时间对菌株WZS021接合转移效率的影响
通常情况下链霉菌接合转移过程中抗生素覆盖时间为16～20 h，覆盖时间过长，大肠杆菌生长出的菌落会与链霉菌混在一起，无法进行下一步试验；时间过短则接合转移不完全，效率低下。本研究分别在涂布大肠杆菌与链霉菌混合菌液10、12、14、16、18和20 h后覆盖抗生素，以涂布混合菌液12 h后覆盖抗生素的接合转移效率最高，涂布混合菌液14 h后覆盖抗生素也能获得可观数量的接合转移子，涂布混合菌液10 和16 h后覆盖抗生素仅获得少量的转移子，而在涂布混合菌液18和20 h后覆盖抗生素无法抑制大肠杆菌生长（图4）。
2. 6 MgCl2浓度对菌株WZS021接合转移效率的影响
在接合转移培养基中加入适量的MgCl2可提高接合转移效率。为确定接合转移的最佳MgCl2浓度，本研究选取终浓度为0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0和50.0 mmol/L的培养基以观察接合转移子生长情况。观察结果（图5）表明，在终浓度为0～30.0 mmol/L的培养基上均可产生数量可观的接合转移子，终浓度为50.0 mmol/L的培养基上未产生接合转移子。其中，终浓度为5.0、10.0和20.0 mmol/L培养基上产生转化子的数量明显多于其他浓度。
2. 7 甘氨酸对菌株WZS021接合转移效率的影响
在培养基中加入MgCl2使其终浓度为5.0 mmol/L的前提下，添加甘氨酸使培养基甘氨酸终浓度分别为0、1%、2%、3%、4%、5%和6%，以检测甘氨酸对菌株WZS021接合转移效率的影响。检测结果（图6）显示，甘氨酸终浓度为0～3%时，接合转移效率变化无明显差异，其中添加1%甘氨酸接合转移效率最高（3.24×10-6），甘氨酸浓度大于3%时接合转移效率降低，说明不添加甘氨酸对接合转移效率无影响。
2. 8 接合转移子的稳定性及PCR验证
将1.2.3获得的接合转移子转接至无抗性的高氏一号培养基上，生长出菌落后再接种于含50.0 mg/L萘啶酮酸和20.0 mg/L安普霉素的高氏一号培养基上，传代培养6～8次，随机挑选4株单菌落分别置于YEME液体培养基中以提取DNA，进行PCR扩增均获得大小约700 bp的条带（图7），表明质粒pSET152已转入链霉菌中并在链霉菌中遗传稳定，而以野生型菌株WZS021的DNA为阴性对照未扩增出条带。将PCR产物胶回收送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序，获得的测序结果在NCBI上进行比对分析，证实其为目的基因片段。
3 讨论
pSET152是一种基因整合型质粒，只有整合到染色体上才能稳定存在于受体菌中（朱云霞等，2012）。不同链霉菌种导入外源基因的方法不同，接合转移效率差异也很明显（刘雪娇等，2012）。本研究结果表明，菌株WZS021可在M10和YEME培养基上生长，但在接合转移系统中无接合子出现，其具体机制尚不清楚，不排除其他培养基更适合该菌接合转移操作的可能性，下一步研究应选取更多培养基进行检测；选用的3个热激温度中，55 ℃促进孢子预萌发的效率明显低于45和50 ℃处理，与一般接合转移操作（Kieser et al.，2000）中热激温度处理结果相同。王芬等（2012）研究发现，供受比为10∶1时最适合Streptomyces griseochromogenes的接合转移操作；杨卓等（2016）报道供受比为100∶1对肉色吸水链霉菌 SH121的接合转移效率更高。在本研究中，菌株WZS021的接合转移操作更适合在供受比1∶10条件下完成，说明不同链霉菌种在接合转移操作中与大肠杆菌的竞争情况存在差异。在对安普霉素最小抑菌浓度的测定中发现，3.0 mg/L抗生素足以抑制链霉菌生长，但为了避免接合子出现菌落连成一片不利于验证的情况，本研究选择50.0 mg/L萘啶酮酸和20.0 mg/L安普霉素进行抗生素浓度筛选。抗生素覆盖时间对接合转移影响的研究结果表明，链霉菌在接合转移操作中最佳抗生素覆盖时间为12 h，抗生素覆盖时间偏长会导致大肠杆菌出现，推测菌株WZS021的次生代谢产物中较少或没有抑制大肠杆菌生长的物质，有别于王航等（2014）对玫瑰孢链霉菌NRRL11379接合转移系统研究中抗生素覆蓋时间最佳为20 h的结果。Mg2+是酶活中心的组成部分，大量研究（杨卓等，2016；张万垚等，2012；朱云霞等，2012）表明，在一定范围内Mg2+浓度的增加能提高接合转移效率。本研究中加入5.0～20.0 mmol/L MgCl2后可较大幅度提高接合转移效率，但MgCl2浓度大于20.0 mmol/L后接合转移效率并未随之升高，推测与高氏一号培养基本身含有少量MgSO4有关，Mg2+浓度过高反而会影响孢子形成。有报道称适量的甘氨酸可提高S. griseochromogenes（刘雪娇等，2012）和S. pulveraceus（王芬等，2012）的接合转移效率，本研究结果与其存在差异，0～3%甘氨酸未影响菌株WZS021的接合转移效率，甘氨酸浓度大于3%时反而会降低接合转移效率。
4 结论
本研究确定了适用于固氮链霉菌S. chartreusi WZS021的接合转移条件，建立了一套行之有效的固氮链霉菌S. chartreusi WZS021遗传转化体系，有助于今后插入标记基因确定该菌株的固氮定殖位点及导入外源基因的操作。
参考文献：
赫卫清，王以光. 2006. 吸水链霉菌17997 格尔德霉素部分生物合成基因簇的克隆和分析[J]. 生物工程学报，22（6）：902-906.
He W Q，Wang Y G. 2006. Cloning and analysis of geldanamycin partial biosynthetic gene cluster of Streptomyces hygrosco- picus 17997[J]. Chinese Journal of Biotechnology，22（6）：902-906.
孔会利，王超，肖亮，李文成. 2007. 高G+C含量模板进行扩增的高效缓冲液体系的建立[J]. 华中农业大学学报，25（2）：106-109.
Kong H L，Wang C，Xiao L，Li W C. 2007. Establishment of efficient buffer of PCR for template with high G+C content[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，25（2）：106-109.
李劍峰，杨鑫，张淑卿，杜建雄，刘健. 2015. 2种植物内生固氮菌对燕麦种子萌发及幼苗生长的效果[J]. 西南农业学报，28（6）：2465-2468.
Li J F，Yang X，Zhang S Q，Du J X，Liu J. 2015. Effects of two endophytic diazotrophs（Klepsiella oxytoca Msp2c and Pseudomonas fluorescence LM531） on seed germination and seedling growth in avena sativa[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，28（6）：2465-2468.
李杨瑞. 2010. 现代甘蔗学[M]. 北京：中国农业出版社.
Li Y R. 2010. Modern Sugarcane Science[M]. Beijing：China Agriculture Press.
刘雪娇，牛铭山，邱荣国，唐莉. 2012. Fostriecin产生菌Streptomyces pulveraceus遗传转化体系的建立与优化[J]. 微生物学通报，39（3）：371-377.
Liu X J，Niu M S，Qiu R G，Tang L. 2012. Establishment and optimization of the conjugal transfer system of fostriecin producer Streptomyces pulveraceus[J]. Microbiology China，39（3）：371-377.
刘志恒，姜成林. 2004. 放线菌现代生物学与生物技术[M]. 北京：科学出版社.
Liu Z H，Jiang C L. 2004. Actinobacteria in Modern Biology and Biotechnology[M]. Beijing：Science Press.
莫宏波，白林泉，王胜兰，杨克. 2004. 大肠杆菌—链霉菌高效接合载体的构建及其应用[J]. 生物工程学报，20（5）：662-666.
Mo H B，Bai L Q，Wang S L，Yang K. 2004. Construction of effi-
cient conjugal plasmids between Escherichia coli and streptomycetes[J]. Chinese Journal of Biotechnology，20（5）：662-666.
王芬，邱荣国，唐莉. 2012. 变构菌素产生菌S. griseochromogenes接合转移体系建立与优化[J]. 大连理工大学学报，53（3）：338-342.
Wang F，Qiu R G，Tang L. 2012. Establishment and optimization for conjugal transfer system of tautomycetin-producing strain S. griseochromogenes[J]. Journal of Dalian University of Technology，53（3）：338-342.
王航，王文轶，吴旻，彭冉，王旻. 2014. 达托霉素产生菌玫瑰孢链霉菌NRRL11379接合转移系统的建立与优化[J]. 药物生物技术，21（3）：194-198.
Wang H，Wang W Y，Wu M，Peng R，Wang M. 2014. Establishment and optimization of a conjugation system for the daptomycin producer Streptomyces roseosporus NRRL11379[J]. Pharmaceutical Biotechnology，21（3）：194-198.
吴胜，夏焕章. 2002. 链霉菌基因转移的方法[J]. 生物工程进展，22（1）：91-95.
Wu S，Xia H Z. 2002. The methods of gene transfer in Streptomyces[J]. China Biotechnology，22（1）：91-95.
杨旻，陶美凤. 2007. 雷帕霉素产生菌吸水链霉菌NRRL5491 接合转移系统的建立[J]. 华中农业大学学报，26（5）：637-641.
Yang M，Tao M F. 2007. Establishment of a conjugation system for the rapamycin producer Streptomyces hygroscopicus NRRL5491[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，26（5）：637-641. 杨卓，李佳丽，肖乐，何璟. 2016. 肉色吸水链霉菌SH121接合转移系统的建立[J]. 华中农业大学学报，35（4）：49-55.
Yang Z，Li J L，Xiao L，He J. 2016. Establishing intergeneric conjugation system in Streptomyces carneohygroscopicus SH121[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，35（4）：49-55.
余姣姣，陶美凤. 2010. 无机盐对阿维链霉菌接合转移及异源表达放线紫红素的影响[J]. 微生物学报，50（11）：1556-1561.
Yu J J，Tao M F. 2010. Effect of inorganic salts on the conjugation and heterologous expression of actinorhodin in Streptomyces avermitilis[J]. Acta Microbiologica Sinica，50（11）：1556-1561.
张万垚，鲁慧囡，何璟. 2012. 酪蛋白水解物对雷帕霉素产生菌Streptomyces hygroscopicus ATCC29253接合转移效率的影响[J]. 微生物学报，52（2）：198-205.
Zhang W Y，Lu H N，He J. 2012. Effect of casamino acid on intergeneric conjugation in rapamycin-producing Streptomyces hygroscopicus ATCC29253[J]. Acta Microbiologica Sinica，52（2）：198-205.
赵斌，何绍江. 2002. 微生物学实验[M]. 北京：科学出版社.
Zhao B，He S J. 2002. Microbiology Experiment[M]. Beijing：Science Press.
朱云霞，廖思懿，叶江，张惠展. 2012. 抗生素Bagremycin生产菌Streptomyces sp. Tü 4128 接合转移系统的建立[J]. 华东理工大学学报（自然科学版），38（2）：160-164.
Zhu Y X，Liao S Y，Ye J，Zhang H Z. 2012. Development of an intergeneric conjugal transfer system for Streptomyces sp. Tü 4128，a producer of bagremycins[J]. Journal of East China University of Science and Technology（Natural Science Edition），38（2）：160-164.
Bierman M，Logan R，O’Brien K，Seno E T，Rao R N，Schoner B E. 1992. Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomycess spp.[J]. Gene，116（1）：43-49.
Christensen B B，Sternberg C，Molin S. 1996. Bacterial plasmid conjugation on semi-solid surfaces monitored with the green fluorescent protein（GFP） from Aequoreavictoria as a mar-
ker[J]. Gene，173（1）：59-65.
Flett F，Mersinias V，Smith C P. 1997. High efficiency intergeneric conjugal transfer of plasmid DNA from Escherichia coli to methyl DNA restricting Streptomyces[J]. FEMS Microbiology Letters，155：223-229.
Kieser T，Bibb M J，Buttner M J，Chater K F，Hopwood D A. 2000. Practical Streptomyces Genetics[M]. Norwich：The John Innes Foundation，UK.
Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T. 1989. Molecular Cloning：A Laboratory Manual[M]. New York：Cold Spring Harbor Labo-
ratory Press.
Veal D A，Stokes H W，Daggard G. 1992. Genetic exchange in natural microbial communities[J]. Advances in Microbial Ecology，12：383-430.
Wang Z，Solanki M K，Pang F，Singh R K，Yang L T，Li Y R，Li H B，Zhu K，Xing Y X. 2016. Identification and efficiency of a nitrogen-fixing endophytic actinobacterial strain from sugarcane[J]. Sugar Technology，doi：10.1007/s12355-016-0498-y.
（責任编辑 思利华）