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摘要：采用制备的微囊藻毒素（MC-LR）单克隆抗体制备包被抗原，建立MC-LR的ELISA检测方法。该方法定量检测区间LQD为0.20～4.00 μg/L，最低检测限LOD为0.10 μg/L，最高检测限HOD为8.00 μg/L，最佳包被抗原浓度为0.5 μg/mL，对应抗体稀释度为1 ∶20 000左右，酶标二抗工作稀释度选择为1 ∶6 000；应用该方法对加标水样进行检测，综合回收率为（98.0±10.7）%，各样品检测结果变异系数均小于10%。该ELISA方法准确度良好，精密度优良。
关键词：微囊藻毒素；单克隆抗体；间接竞争ELISA；检测
中图分类号： X17文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0340-04
我国是世界上藻灾最为严重的国家之一，藻毒素严重威胁居民饮水安全和食品安全。我国主要的淡水藻毒素是微囊藻毒素（microcystin，MC），微囊藻毒素是淡水蓝藻产生的一类生物活性物质，能够对人体多个器官产生危害，危害最严重的靶器官是肝脏，长时间低剂量接触MCs会导致肝损伤和诱发癌症[1-2]。有研究表明，我国肝癌多发区与当地水中高含量的微囊毒素有关[3-4]，MCs引发的急性肝中毒症状表现为肝细胞损伤、肝出血[5]。
预防藻毒素侵害最主要是保持水体清洁，防止藻类过量生长；同时，能够精确及时地检测毒素也是预防毒素污染的有效方法。我国淡水微囊藻毒素污染严重，但迄今为止尚没有一种较合适于现场使用的藻毒素检测方法，因此研制我国自主知识产权的检测淡水中微囊藻毒素的方法已成为当务之急。
藻毒检测方法主要有色谱检测、生物检测、细胞检测[6-8]，这些检测技术或是需要昂贵的仪器、或是需要较长的检测时间、或是准确率不够。与其他检测方法相比，酶联免疫法具有灵敏度高、特异性好、重复性高和检测准确快速的优点，在现场快速检测上具有开发前景，近年来在赤潮藻毒素快速检测方面得到重视和发展。笔者所在实验室在成功制备高效价MC-LR单克隆抗体的基础上，初步建立了检测 MC-LR 的间接竞争酶免疫学检测方法，为研制具有自主知识产权的相关检测试剂盒奠定了基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
微囊藻毒素单克隆抗体由笔者所在课题组研制；其他试剂均为国产分析纯。
1.2包被抗原的制备
用兔血清白蛋白（rabbit serum albumin，RSA）制备包被抗原MC-LR-RSA[9]，冰箱保存备用。
1.3抗原、抗体最佳稀释浓度的确定
在96孔ELISA板上，检测抗原按纵向排列，抗体按横向排列。检测抗原用包被缓冲液（pH值9.6，0.05 mol/L碳酸盐缓冲液）稀释为1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000这4个浓度，每浓度3个重复，每孔100 μL，4 ℃过夜；洗涤液后静置1 min，重复洗涤3次；用0.1% BSA（用包被液进行稀释）的封闭液进行封闭，每孔120 μL，37 ℃1 h，洗涤3次，拍干。
MC-LR抗体浓度调为7.5 mg/mL，用高纯水稀释成如下梯度浓度：0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L共11个点；依次加入酶标板上的1号至12号孔中，抗体体积为100 μL/孔，37 ℃温育后洗涤3次；加入HRP标记的羊抗鼠IgG，酶标二抗羊抗鼠IgG浓度选择为1 ∶6 000，每孔加入100 μL，37 ℃温育1 h，洗涤4次；显色液为TMB；终止液为 2 mol/L H2SO4。在酶标仪上测定D450 nm值，确定最佳包被抗原与抗体浓度。
1.4标准曲线的测定
根据“1.3”节所得到的最佳包被抗原浓度和最佳抗体稀释倍数，以及最佳二抗浓度，用标准系列稀释的MC-LR（0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L），按照间接竞争ELISA测定。采用n=3个平行试验，获得标准曲线。
1.5一抗最佳反应时间的确定
根据“1.3”节试验选取最佳的抗原、抗体稀释度，包被抗原浓度为0.5 μg/mL，对应的抗体稀释度为1 ∶20 000，作为ELISA的反应条件。将MC-LR标准品用高纯水配制成如下梯度浓度：0、0.2、0.5、1、2、4 μg/L，共6个点，进行标准曲线测定，每孔50 μL标准品；同时加入用PBS配制好的单抗溶液，每孔50 μL，放入37 ℃培养箱中温育，一抗反应时间设定为30、60、90 min 3个组，每组3个平行；二抗体反应时间固定为60 min。每个时间内标准曲线设置2个平行。反应结束后分别洗涤3次，拍干。
加二抗：酶标二抗采用HRP标记的羊抗鼠IgG，采用PBS稀释，每孔加入100 μL，37 ℃温育1 h，洗涤4次，拍干。
显色：加入新配制的底物液（TMB-H2O2），每孔100 μL，室温下固定反应10 min。测定D450 nm值，选择最佳一抗反应时间。
1.6实际水样的检测（准确度和精密度验证）
1.6.1水样的采集和预处理选取上海市不同来源的水样，包括饮用水、地下水、景观娱乐用水（游泳池和公园水样）以及地表水（城市河道水体）14个样品，每个水样采集体积为10 mL，对较混浊的样品采用0.45 μm的滤膜过滤。
1.6.2水样的添加-回收测定在14个水样中添加标准微囊藻毒素，每个样品毒素的最终浓度分别为0.2、0.5、1.0 μg/L ，共3个不同浓度。采用直接竞争ELISA测定样品中毒素含量，每个水样平行测定5次，根据标准曲线计算水样中MC-LR浓度。同时测定原水中的毒素含量，结果进行比较，并计算回收率。回收率的计算方法如下：每个样品平行测定5次，计算吸光度的平均值，样品添加浓度（最终浓度）用X表示，未添加标准品的样品测定平均值为x1，添加了标准品的样品测定平均值为x2，则回收率计算如式（1）。当原水样ELISA测定浓度超出本方法的检测限，即小于0.1 μg/L时，视为未检出，此时均按照x1=0计算回收率。 回收率=x2-x1X×100% 。（1）
1.7一致性检验
按照确定的ELISA标准曲线测试方法，对所包被的单条可拆酶标板，同一个人分3 d（2014年4月7—9日）进行同样的试验。
试验过程描述如下：包被抗原浓度为0.5 μg/mL，对应的抗体稀释度为1 ∶20 000，微囊藻毒素-LR标准品：0、0.2、05、1、2、4 μg/L共6个点，进行标准曲线测定，每孔50 μL标准品；同时加入用PBS配制好的单抗溶液，每孔50 μL，放入37 ℃培养箱中温育，时间60 min；每个标准品设置2个平行。反应结束后洗涤3次，拍干。加二抗：酶标二抗采用HRP标记的羊抗鼠IgG，采用PBS稀释，每孔加入100 μL，37 ℃温育1 h，洗涤4次，拍干。显色：加入新配制的底物液（TMB-H2O2），每孔100 μL，室温下固定反应10 min。终止：向每孔中加入50 μL的2 mol/L的硫酸溶液。测定：用酶标仪测定其在450 nm的吸光度D450 nm。
2结果与分析
2.1包被抗原和抗体最佳浓度的确定
本试验结果包被抗原浓度为0.5 μg/mL，对应的抗体稀释度为1 ∶20 000左右，可以作为ELISA良好的反应条件。酶标二抗工作稀释度为选择1 ∶6 000。
2.2标准曲线的绘制和分析
间接竞争ELISA的标准曲线如图1所示，误差线为n=3次平行试验的标准偏差，试验重复性良好，相对标准偏差（变异系数）均在10%以内。从图1可以看出，曲线呈现明显的反S形。
由标准曲线可以分析：（1） 半抑制浓度IC50=（0.81±0.05） μg/L。（2） 检测限。间接竞争ELISA的最低检测限LOD是结合率y=10%时所对应的目标物质的浓度，即LOD=0.10 μg/L；最高检测限HOD是结合率y=90%时所对应的目标物质的浓度，即HOD=8.00 μg/L。（3） 定量检测区间。靠近中点处（x0）的一段区间是线性的，称之为定量检测区间，间接竞争ELISA的定量检测区间是结合率为80%～20%所对应的目标物质的浓度区间，即LQD为0.20～4.00 μg/L。
2.3最佳一抗反应时间的确定
一抗反应30 min的结果（图2）表明，吸光度偏低，同时在较高浓度范围内，吸光度变化不是太明显，标准曲线有拖尾的现象。一抗反应60 min的结果（图3）表明，标准曲线线性较好，能满足实际检测的需要。
一抗反应90 min的结果（图4）表明，吸光度较高，说明反应充分；同时标准曲线的线性度也较好，也能满足实际检测要求。但是90 min相对来说时间较长，不推荐在实际操作中应用。
2.5一致性试验
试验结果（图5、图6、图7）表明，各标准曲线的斜率较为接近；吸光度虽然略有差异，但这应该是由试验过程中显色-终止时间的微小差异决定的，不可避免。总体来说，所建立的微囊藻毒素ELISA方法，一致性较好。
3讨论
微囊藻毒素目前已经分离出80多种异构体[10]，其中MC-LR是目前毒性最大、存在最广泛、研究最多的一种，也是我国最常见的微囊藻毒素种类[11]。目前MC-LR被定为检测微囊藻毒素污染的指标。为了降低MCs对人和水生动物的毒性及潜在危害性，世界卫生组织（WHO）推荐水中微囊藻毒素的安全指导值MC-LR是1 000 ng/L[12]。
常用的藻毒素检测方法是高效液相色谱法（HPLC）、免疫学法以及生物毒性法（MBA）。HPLC法精确灵敏，但需要复杂的设备和专业的操作人员；MBA法简单直观，但精确性和灵敏性较差。免疫学技术利用抗原抗体之间的特异性进行样品捕获和检测，被应用于检测领域后取得了显著的效果，具有快速、
灵敏、操作简单、不需要复杂仪器设备、价格低廉、便于制成可携带的检测纸板和试剂盒等优点，成为我国攻克藻毒素现场快速检测的首选方法。国际上已经有关于免疫检测技术在藻毒素检测的研究报道，并且已经制备出了部分藻毒素的ELISA试剂盒，如美国、日本、欧洲一些国家有微囊藻毒素（microcystin）[13-14]和软海绵酸（okadaic acid，OA）的ELISA检测试剂盒销售[15-16]，但价格昂贵，检测成本高，不适合大量样品的检测；近年我国也有学者研究藻毒素的免疫检测技术，如盛建武等将MC与BSA偶联制备免疫原MC-LR-BSA，用其研制的抗体建立的ELISA，最低的检测限为 10 ng/L[17]。赵晓联等采用人KLH作为载体制备免疫原MC-LR-KHL，其抗体建立的ELISA最低检测限为0.01 ng/mL[18]。
本研究选取我国典型微囊藻毒素（microcystin-LR）为研究对象，采用碳二亚胺缩合方法分别合成了毒素的完全抗原MC-LR-KLH，利用制备的单克隆抗体发展建立了有效的MC-LR间接竞争酶联免疫检测，最佳包被抗原浓度为 0.5 μg/mL，对应抗体稀释度为1 ∶20 000左右，酶标二抗工作稀释度选择为1 ∶6 000；检测区间LQD为0.20～4.00 μg/L，最低检测限LOD为0.10 μg/L，最高检测限HOD为8.00 μg/L，特异性较好。
应用该方法对4个加标水样进行检测，各水样原水均未检测出MC-LR（<10 ng/L），检测结果相对标准偏差均小于10%，与投加的标准MC-LR相关系数大于0.98，样品的回收率在综合回收率为（98.0±10.7）%。该ELISA方法准确度良好，精密度优良。
参考文献：
[1]许川，舒为群，曹佳. 我国水环境微囊藻毒素污染及其健康危害研究[J]. 癌变·畸变·突变，19（3）：202-205.
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[15]Tagmouti-Talha F，Moutaouakkil A，Taib N，et al. Detection of paralytic and diarrhetic shellfish toxins in moroccan cockles（Acanthocardia tuberculata）[J]. Bull Environ Contam Toxicol， 2000，65：707-716.
[16]Llamas N M，Stewart L，Fodey T，et al . Development of a novel immunobiosensor method for the rapid detection of okadaic acid contamination in shellfish extracts[J]. Anal Bioanal Chem，2007，389（2）：581-587.
[17]盛建武，何苗，余少青，等. 水体中微囊藻毒素-LR的间接ELISA检测[J]. 环境科学，2006，27（6）：1166-1170.
[18]赵晓联，孙蔚榕，刘媛，等. 微囊藻毒素（MC-LR）多克隆抗体的制备、纯化及鉴定[J]. 2006，35（1）76-78.
关键词：微囊藻毒素；单克隆抗体；间接竞争ELISA；检测
中图分类号： X17文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0340-04
我国是世界上藻灾最为严重的国家之一，藻毒素严重威胁居民饮水安全和食品安全。我国主要的淡水藻毒素是微囊藻毒素（microcystin，MC），微囊藻毒素是淡水蓝藻产生的一类生物活性物质，能够对人体多个器官产生危害，危害最严重的靶器官是肝脏，长时间低剂量接触MCs会导致肝损伤和诱发癌症[1-2]。有研究表明，我国肝癌多发区与当地水中高含量的微囊毒素有关[3-4]，MCs引发的急性肝中毒症状表现为肝细胞损伤、肝出血[5]。
预防藻毒素侵害最主要是保持水体清洁，防止藻类过量生长；同时，能够精确及时地检测毒素也是预防毒素污染的有效方法。我国淡水微囊藻毒素污染严重，但迄今为止尚没有一种较合适于现场使用的藻毒素检测方法，因此研制我国自主知识产权的检测淡水中微囊藻毒素的方法已成为当务之急。
藻毒检测方法主要有色谱检测、生物检测、细胞检测[6-8]，这些检测技术或是需要昂贵的仪器、或是需要较长的检测时间、或是准确率不够。与其他检测方法相比，酶联免疫法具有灵敏度高、特异性好、重复性高和检测准确快速的优点，在现场快速检测上具有开发前景，近年来在赤潮藻毒素快速检测方面得到重视和发展。笔者所在实验室在成功制备高效价MC-LR单克隆抗体的基础上，初步建立了检测 MC-LR 的间接竞争酶免疫学检测方法，为研制具有自主知识产权的相关检测试剂盒奠定了基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
微囊藻毒素单克隆抗体由笔者所在课题组研制；其他试剂均为国产分析纯。
1.2包被抗原的制备
用兔血清白蛋白（rabbit serum albumin，RSA）制备包被抗原MC-LR-RSA[9]，冰箱保存备用。
1.3抗原、抗体最佳稀释浓度的确定
在96孔ELISA板上，检测抗原按纵向排列，抗体按横向排列。检测抗原用包被缓冲液（pH值9.6，0.05 mol/L碳酸盐缓冲液）稀释为1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000这4个浓度，每浓度3个重复，每孔100 μL，4 ℃过夜；洗涤液后静置1 min，重复洗涤3次；用0.1% BSA（用包被液进行稀释）的封闭液进行封闭，每孔120 μL，37 ℃1 h，洗涤3次，拍干。
MC-LR抗体浓度调为7.5 mg/mL，用高纯水稀释成如下梯度浓度：0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L共11个点；依次加入酶标板上的1号至12号孔中，抗体体积为100 μL/孔，37 ℃温育后洗涤3次；加入HRP标记的羊抗鼠IgG，酶标二抗羊抗鼠IgG浓度选择为1 ∶6 000，每孔加入100 μL，37 ℃温育1 h，洗涤4次；显色液为TMB；终止液为 2 mol/L H2SO4。在酶标仪上测定D450 nm值，确定最佳包被抗原与抗体浓度。
1.4标准曲线的测定
根据“1.3”节所得到的最佳包被抗原浓度和最佳抗体稀释倍数，以及最佳二抗浓度，用标准系列稀释的MC-LR（0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L），按照间接竞争ELISA测定。采用n=3个平行试验，获得标准曲线。
1.5一抗最佳反应时间的确定
根据“1.3”节试验选取最佳的抗原、抗体稀释度，包被抗原浓度为0.5 μg/mL，对应的抗体稀释度为1 ∶20 000，作为ELISA的反应条件。将MC-LR标准品用高纯水配制成如下梯度浓度：0、0.2、0.5、1、2、4 μg/L，共6个点，进行标准曲线测定，每孔50 μL标准品；同时加入用PBS配制好的单抗溶液，每孔50 μL，放入37 ℃培养箱中温育，一抗反应时间设定为30、60、90 min 3个组，每组3个平行；二抗体反应时间固定为60 min。每个时间内标准曲线设置2个平行。反应结束后分别洗涤3次，拍干。
加二抗：酶标二抗采用HRP标记的羊抗鼠IgG，采用PBS稀释，每孔加入100 μL，37 ℃温育1 h，洗涤4次，拍干。
显色：加入新配制的底物液（TMB-H2O2），每孔100 μL，室温下固定反应10 min。测定D450 nm值，选择最佳一抗反应时间。
1.6实际水样的检测（准确度和精密度验证）
1.6.1水样的采集和预处理选取上海市不同来源的水样，包括饮用水、地下水、景观娱乐用水（游泳池和公园水样）以及地表水（城市河道水体）14个样品，每个水样采集体积为10 mL，对较混浊的样品采用0.45 μm的滤膜过滤。
1.6.2水样的添加-回收测定在14个水样中添加标准微囊藻毒素，每个样品毒素的最终浓度分别为0.2、0.5、1.0 μg/L ，共3个不同浓度。采用直接竞争ELISA测定样品中毒素含量，每个水样平行测定5次，根据标准曲线计算水样中MC-LR浓度。同时测定原水中的毒素含量，结果进行比较，并计算回收率。回收率的计算方法如下：每个样品平行测定5次，计算吸光度的平均值，样品添加浓度（最终浓度）用X表示，未添加标准品的样品测定平均值为x1，添加了标准品的样品测定平均值为x2，则回收率计算如式（1）。当原水样ELISA测定浓度超出本方法的检测限，即小于0.1 μg/L时，视为未检出，此时均按照x1=0计算回收率。 回收率=x2-x1X×100% 。（1）
1.7一致性检验
按照确定的ELISA标准曲线测试方法，对所包被的单条可拆酶标板，同一个人分3 d（2014年4月7—9日）进行同样的试验。
试验过程描述如下：包被抗原浓度为0.5 μg/mL，对应的抗体稀释度为1 ∶20 000，微囊藻毒素-LR标准品：0、0.2、05、1、2、4 μg/L共6个点，进行标准曲线测定，每孔50 μL标准品；同时加入用PBS配制好的单抗溶液，每孔50 μL，放入37 ℃培养箱中温育，时间60 min；每个标准品设置2个平行。反应结束后洗涤3次，拍干。加二抗：酶标二抗采用HRP标记的羊抗鼠IgG，采用PBS稀释，每孔加入100 μL，37 ℃温育1 h，洗涤4次，拍干。显色：加入新配制的底物液（TMB-H2O2），每孔100 μL，室温下固定反应10 min。终止：向每孔中加入50 μL的2 mol/L的硫酸溶液。测定：用酶标仪测定其在450 nm的吸光度D450 nm。
2结果与分析
2.1包被抗原和抗体最佳浓度的确定
本试验结果包被抗原浓度为0.5 μg/mL，对应的抗体稀释度为1 ∶20 000左右，可以作为ELISA良好的反应条件。酶标二抗工作稀释度为选择1 ∶6 000。
2.2标准曲线的绘制和分析
间接竞争ELISA的标准曲线如图1所示，误差线为n=3次平行试验的标准偏差，试验重复性良好，相对标准偏差（变异系数）均在10%以内。从图1可以看出，曲线呈现明显的反S形。
由标准曲线可以分析：（1） 半抑制浓度IC50=（0.81±0.05） μg/L。（2） 检测限。间接竞争ELISA的最低检测限LOD是结合率y=10%时所对应的目标物质的浓度，即LOD=0.10 μg/L；最高检测限HOD是结合率y=90%时所对应的目标物质的浓度，即HOD=8.00 μg/L。（3） 定量检测区间。靠近中点处（x0）的一段区间是线性的，称之为定量检测区间，间接竞争ELISA的定量检测区间是结合率为80%～20%所对应的目标物质的浓度区间，即LQD为0.20～4.00 μg/L。
2.3最佳一抗反应时间的确定
一抗反应30 min的结果（图2）表明，吸光度偏低，同时在较高浓度范围内，吸光度变化不是太明显，标准曲线有拖尾的现象。一抗反应60 min的结果（图3）表明，标准曲线线性较好，能满足实际检测的需要。
一抗反应90 min的结果（图4）表明，吸光度较高，说明反应充分；同时标准曲线的线性度也较好，也能满足实际检测要求。但是90 min相对来说时间较长，不推荐在实际操作中应用。
2.5一致性试验
试验结果（图5、图6、图7）表明，各标准曲线的斜率较为接近；吸光度虽然略有差异，但这应该是由试验过程中显色-终止时间的微小差异决定的，不可避免。总体来说，所建立的微囊藻毒素ELISA方法，一致性较好。
3讨论
微囊藻毒素目前已经分离出80多种异构体[10]，其中MC-LR是目前毒性最大、存在最广泛、研究最多的一种，也是我国最常见的微囊藻毒素种类[11]。目前MC-LR被定为检测微囊藻毒素污染的指标。为了降低MCs对人和水生动物的毒性及潜在危害性，世界卫生组织（WHO）推荐水中微囊藻毒素的安全指导值MC-LR是1 000 ng/L[12]。
常用的藻毒素检测方法是高效液相色谱法（HPLC）、免疫学法以及生物毒性法（MBA）。HPLC法精确灵敏，但需要复杂的设备和专业的操作人员；MBA法简单直观，但精确性和灵敏性较差。免疫学技术利用抗原抗体之间的特异性进行样品捕获和检测，被应用于检测领域后取得了显著的效果，具有快速、
灵敏、操作简单、不需要复杂仪器设备、价格低廉、便于制成可携带的检测纸板和试剂盒等优点，成为我国攻克藻毒素现场快速检测的首选方法。国际上已经有关于免疫检测技术在藻毒素检测的研究报道，并且已经制备出了部分藻毒素的ELISA试剂盒，如美国、日本、欧洲一些国家有微囊藻毒素（microcystin）[13-14]和软海绵酸（okadaic acid，OA）的ELISA检测试剂盒销售[15-16]，但价格昂贵，检测成本高，不适合大量样品的检测；近年我国也有学者研究藻毒素的免疫检测技术，如盛建武等将MC与BSA偶联制备免疫原MC-LR-BSA，用其研制的抗体建立的ELISA，最低的检测限为 10 ng/L[17]。赵晓联等采用人KLH作为载体制备免疫原MC-LR-KHL，其抗体建立的ELISA最低检测限为0.01 ng/mL[18]。
本研究选取我国典型微囊藻毒素（microcystin-LR）为研究对象，采用碳二亚胺缩合方法分别合成了毒素的完全抗原MC-LR-KLH，利用制备的单克隆抗体发展建立了有效的MC-LR间接竞争酶联免疫检测，最佳包被抗原浓度为 0.5 μg/mL，对应抗体稀释度为1 ∶20 000左右，酶标二抗工作稀释度选择为1 ∶6 000；检测区间LQD为0.20～4.00 μg/L，最低检测限LOD为0.10 μg/L，最高检测限HOD为8.00 μg/L，特异性较好。
应用该方法对4个加标水样进行检测，各水样原水均未检测出MC-LR（<10 ng/L），检测结果相对标准偏差均小于10%，与投加的标准MC-LR相关系数大于0.98，样品的回收率在综合回收率为（98.0±10.7）%。该ELISA方法准确度良好，精密度优良。
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