利用Rock抑制剂联合低氧－常氧培养方式构建基于胚胎干细胞(ESCs)的组织工程角膜上皮。
方法应用贴壁培养作为分化方式，用全反式维甲酸(RA)＋骨形态发生蛋白4(BMP4)诱导人源ESCs细胞系H1向角膜上皮样细胞分化。以SHEM与KSFM培养基1∶2混合配比作为扩增基础培养基，分别添加或不添加Rock抑制剂Y27632，扩增ESCs来源的角膜上皮样细胞。将诱导后的角膜上皮样细胞接种于去上皮羊膜载体上，在低氧、常氧、低氧－常氧相结合等不同条件下构建组织工程角膜上皮。通过形态学、实时荧光定量PCR反应(RTFQ-PCR)、免疫荧光法检测诱导效果、ESCs来源角膜上皮样细胞的扩增能力及组织工程角膜上皮表型。
结果与对照组比较，诱导组诱导后8 d ESCs标志物Oct4 mRNA，Notch信号通路相关因子Notch1、Jagged1 mRNA以及Wnt信号通路的相关因子c-myc和Cyclin D1 mRNA的相对表达量显著降低，表皮外胚层标志物p63和K18 mRNA的相对表达量显著增加，差异均有统计学意义(t＝14.63、20.15、93.50、11.60、19.30、18.44、22.63，均P<0.05)。与Y27632未添加组相比，Y27632添加组细胞的p63、K14 mRNA相对表达量以及Notch信号通路受体Notch1和Jagged1 mRNA相对表达量显著升高，Wnt信号通路下游靶向基因c-myc和CylinD1 mRNA相对表达量明显降低，差异均有统计学意义(t＝20.29、59.22、2.90、39.59、5.32、10.14，均P<0.05)；2个组K18 mRNA的相对表达量无明显变化，差异无统计学意义(t＝1.38，P>0.05)。Y27632添加组用低氧－常氧相结合的方式构建ESCs来源的上皮片较持续低氧或常氧培养复层化更明显，排列更紧密，并全层表达上皮细胞标志物Pan-CK和K18及上皮干细胞标志物p63和K14。
结论Y27632的添加可增加ESCs来源角膜上皮样细胞的增生能力，激活Notch信号通路，抑制Wnt信号通路。采用低氧－常氧相结合的方式，利用添加Y27632的培养基扩增构建ESCs来源的组织工程角膜上皮有助于上皮片的复层化。