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[摘要]目的：了解超薄表皮片移植中干细胞的分化和分布的状况，初步探讨创面修复过程中细胞异位现象的存在。方法：超薄表皮片用中性蛋白酶分离自人环切术的包皮，反复冲洗使表皮干细胞脱落。分别用HE染色、免疫组化和DAPI标记后移植于8只裸鼠。第4天和第7天活杀取材，常规HE和石蜡与冰冻切片染色。用光学显微镜和荧光显微镜观察皮片的形态学改变，用免疫组化的方法评估表达角蛋白19和14细胞的分化和分布。结果：染色显示未移植皮片有正常的层次结构，但移植的皮片细胞层次有松弛紊乱的迹象，免疫组化显示CK14和CK19阳性细胞有异位现象；冰冻切片荧光显微镜下在基底层之外亦见有孤立成团同时双染的CK19阳性细胞。这些现象在移植后的第4天最为显著。结论：表皮细胞在超薄表皮片移植中显示出CK14和CK19阳性细胞有异位现象，这种特异性细胞的异位可能参与了创面修复以及之后表皮重塑。
[关键词]表皮片；干细胞；移植；裸鼠；创面修复
[中图分类号]R622 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)03－0313－04
皮片移植是烧伤治疗中最常用的手术方式，由于刃厚皮片较薄，生长所需条件低，在感染创面上生长容易及供皮区不受限等特点，因此在治疗大面积烧伤及其他皮肤疾病起着举足轻重的作用。刃厚皮片移植到有血运的创面后，早期靠创面渗出的血清维持营养，5～24h后，皮片与受区创面间有中性粒细胞浸润，同时受区创面向皮片生长血管芽，48h到达真皮与表皮的结合处，初步形成新生的毛细血管，因此皮片易于在创面成活，7天左右可建立良好的血运。值得注意的是，长期以来人们关注创基条件对皮片成活的影响，轻视了皮片本身细胞的增殖分化能力对创面愈合的作用。刃厚皮片移植后细胞的增殖分化是如何进行的?鲜见有文献报道。故笔者以分离的超薄的表皮片为研究对象，建立了表皮片移植后的细胞示踪模型，观察在基底层细胞相对不足的情况下表皮细胞增殖分布特点，为以后进一步研究表皮细胞的增殖分化奠定基础。
1 材料和方法
1．1 材料
1．1．1 包皮来自无泌尿系感染等疾病7～25岁行包皮环切术的患者。经知情同意由解放军空军总医院泌尿外科提供。实验动物为裸鼠，体重20g左右，许可证号：SCXK京2004－0001，购自中国医学科学院宣武动物所；麻醉剂速眠新Ⅱ(军事医学科学院兽医研究所)。
1．1．2 消化液：中性蛋白酶(dispose)，以D～hanks分别配制2mg/ml中性蛋白酶溶液，过滤灭菌后－20℃保存备用。
1．1．3 DAPI(Sigma)染液：称取1mg DAPI,用DMEM/F－12(GiBCO)培养液溶解定容至20ml，0.22μm微孔虑膜过滤除菌，4℃下避光保存。工作浓度为50μg/ml。
1．1．4 抗体：鼠抗人角蛋白10、14和19IgG单抗(福州迈新)，山羊抗鼠IgG2(北京中山)，以荧光素罗丹明标记的山羊抗鼠IgG2(北京中山)，两步法细胞免疫化学。
1．2 方法
1．2．1 表皮片的处理：将包皮剪切成约2.0cm×2.0cm左右的皮片，中性蛋白酶消化4℃过夜；吸弃dispase，D－Hanks液清洗后，仔细分离表皮层，设立未处理组，其余真皮面向上，用D－Hanks反复吹打漂洗进行预处理。
1．2．2 皮片移植和取材：将处理的表皮片移植前3h，加入DAPI染液，避光孵育3h，用Hank’s液冲洗7次以上去除未结合DAPI。根据无菌操作，裸鼠麻醉后，每只裸鼠背部人为设计0.5cm2大小的1～4个创面，创基喷rhEGF和bFGF，将处理过的超薄表皮片移植于8只裸鼠背部，纤维蛋白胶封闭创面，内衬少许纱布，创可贴包扎。
1．2．3 取材及标本制作：单笼密闭包喂养4～8天，随机于第四天和第七天引颈活杀取材，分别制作石蜡(厚度3～5μm)和冰冻切片(厚度4～7μm)。常规滴加一抗及荧光标记的第二抗体，甘油封片。光镜及荧光显微镜下观察。
2 结果
2．1 皮片的染色结果：分离的表皮片在HE染色及免疫组织化学染色下，表皮片细胞排列规律整齐，细胞层次较为明显。CK10用阳性细胞多分布于表皮浅层，CK14分布在基底层及棘细胞层甚至颗粒层。未行预处理的表皮片CK19染色可见阳性细胞单层排列于基底层，呈波浪状。而经预处理的表皮片仅见少量CK19阳性细胞排列于基底层，基底层细胞排列不连续。
2．2 裸鼠及移植皮片的成活情况：裸鼠共8只，其中有3只试验结束前死亡，其原因可能是麻醉及包扎过重所致。皮片移植后，分别于第四天和第七天取材。打开包扎裸鼠创面较移植前缩小，至第七天缩小更明显。排除脱落，共13个创面，两个创面皮片未成活，系包扎不确切所致，11个创面皮片成活良好，颜色尚可。HE染色显示表皮细胞极性分布存在，皮片松弛，大体细胞层次增多，皮片变厚，创基有炎性细胞浸润。
2．3 石蜡切片免疫组织化学染色结果：镜下CK14阳性细胞较未移植前增多，排列紊乱，在皮片内分散分布，个别部位可见分布拥挤现象。CK19阳性细胞脱离基底层，可见分散孤立的分布于皮片内。移植的皮片细胞层次有松弛紊乱的迹象。上述现象在移植后的第四天最为显著。但系列切片未观察到“干细胞岛”现象。
2．4 冰冻切片：DAPI荧光及免疫组化染色结果：荧光显微镜下，在蓝色波长下观察到移植表皮片区域有蓝色密集颗粒，系DAPI标记细胞的表皮细胞核，其与鼠源性组织的自发荧光区分度较为明显。红光激发波长为543nm，在560nm波长观察可见皮片内有少量的罗丹明标记山羊抗鼠IgG的明显着色，排列不规律。鼠源性组织有着色区，可能是冰冻切片较厚而造成的假阳性。
3 讨论
表皮分为五层，从里向外依次是：基底层、棘细胞层、颗粒层、透明层及角质层。具有增殖能力的细胞包括表皮干细胞和短暂扩充细胞，它们主要定位于表皮基底层和棘细胞层，通常认为CK19和CK14分别是他们分化的阶段性标记物。中性蛋白酶能温和地分离去除真皮层，获得的超薄表皮片内含有基底层细胞在内的各层表皮细胞。理论上讲，位于基底层的表皮干细胞由于失去的基底膜的贴附，在机械冲击下更容易分离下来。结果表明在机械冲击下基底层细胞CK19阳性细胞的连续性断裂，说明表皮干细胞减少。表皮于细胞是皮肤发生、修复、重塑的关键性源泉。对于修复皮肤缺损的皮肤移植物，表皮的永久再生需要有干细胞移植其中。那么将这些表皮干细胞相对不足的表皮片移植至创面上又会怎样呢?HE染色观察到皮片移植后，皮片松弛变厚，表皮细胞极性分布存在，总体细胞层次增多，创基有炎性细胞浸润。在创面愈合过程中，该皮片一方面通过自身的细胞增殖参与创面愈合，另 一方面在创口逐渐收缩的过程中，皮片变厚，从而在质和量上加固创面。免疫组织化学显示，较移植前，CK14阳性细胞增多，皮片内分散存在，个别部位可见排列拥挤。而CK19阳性细胞脱离基底层，可见分散孤立的分布于皮片内。在荧光显微镜下可见到少量DAPI和CK19同时着色的阳性细胞，分布不规律。这种特异性的角质形成细胞的极性分布紊乱现象在移植后的第四天最为显著。那么如何解释在表皮片中出现的CK14及CK19阳性细胞的异位分布现象?由于在皮片移植之前对表皮片进行示踪，荧光显微镜下在皮片内未见到DAPI阴性而角蛋白阳性着色的细胞，基本上排除了异源性细胞浸入皮片内的可能。我们推断，在上皮－间质界面形成由复杂的细胞信号组成的“微环境”的作用下，可能有以下原因：一是ESC和TAC产生了“跳跃”，即伴随着机体创伤修复信号的启动，ESC和TAC快速地向表皮上层迁移，能动的参与创面的修复；二是由于机体创伤修复的紧迫性，虽然ESC和脱离表皮基底层进入了分化状态而形成了短暂TAC，TAC进而分化为PMD细胞，但这些TAC和PMD细胞的状态尚属幼年期，仍表达更为原始细胞的某些特征；三是是否存在由成熟的表皮细胞逆分化为ESC样细胞或TAC样细胞。成熟细胞可通过去分化、转分化和逆分化方式向肿瘤细胞、其他(胚层的)成熟细胞和干细胞转变。这些细胞可能在丧失表达原细胞蛋白分子或结构特征的同时，合成和装配了新生细胞的蛋白，从而完成成体细胞的异常分化(逆分化和/或转分化)过程。但其中具体的分子生物学机制，值得进一步研究。如何解释特异性的角质形成细胞的异位现象在移植后的第四天最为显著的现象?皮片移植第四天是血运正在建立但仍未稳定时期，血液循环呈摆动或呆滞的缓慢移动。此时的皮片逐渐适应新的环境，表皮细胞处于缺血及缺氧状态，加上人为添加的rhEGF及bFGF在局部产生的作用，由此复杂的共同的信号转导所产生了一系列的分子生物学效应，可能导致了上述三种可能机制的发生。事实上，体外的实验研究中第四天也是一个关键点。McGann cJ等利用早期蝾螈的肢体再生提取物来诱导C2C12小鼠的肌管，观察到最大量的肌管进入细胞周期并形成增殖性的单个核细胞发生于第三天，第四天呈持续状态。Shuibing Chen等用一种名为“逆转素”的小分子物质诱导C2C12肌管。加入该物质后4天后，肌管形成完全被抑制，细胞不断地形成单核细胞群，肌浆蛋白特异标志如MyoD和myosin培养开始消失，此后细胞在成骨或脂肪诱导条件下表现为相应再分化细胞特异性标记物。这种体内和体外实验在时间上的巧合，是否提示四天之中细胞获得了可塑性，在发育上发生了根本性的逆转；这种细胞异常分化的节点是一种必然还是偶然值得探讨。本实验观察到特异性的角质形成细胞的异位分布及皮片增厚的现象，我们考虑不能排除表皮细胞在超薄表皮片移植中显示出逆分化和再分化。这种特异性细胞的异位可能参与了创面修复以及之后表皮重塑。
[关键词]表皮片；干细胞；移植；裸鼠；创面修复
[中图分类号]R622 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)03－0313－04
皮片移植是烧伤治疗中最常用的手术方式，由于刃厚皮片较薄，生长所需条件低，在感染创面上生长容易及供皮区不受限等特点，因此在治疗大面积烧伤及其他皮肤疾病起着举足轻重的作用。刃厚皮片移植到有血运的创面后，早期靠创面渗出的血清维持营养，5～24h后，皮片与受区创面间有中性粒细胞浸润，同时受区创面向皮片生长血管芽，48h到达真皮与表皮的结合处，初步形成新生的毛细血管，因此皮片易于在创面成活，7天左右可建立良好的血运。值得注意的是，长期以来人们关注创基条件对皮片成活的影响，轻视了皮片本身细胞的增殖分化能力对创面愈合的作用。刃厚皮片移植后细胞的增殖分化是如何进行的?鲜见有文献报道。故笔者以分离的超薄的表皮片为研究对象，建立了表皮片移植后的细胞示踪模型，观察在基底层细胞相对不足的情况下表皮细胞增殖分布特点，为以后进一步研究表皮细胞的增殖分化奠定基础。
1 材料和方法
1．1 材料
1．1．1 包皮来自无泌尿系感染等疾病7～25岁行包皮环切术的患者。经知情同意由解放军空军总医院泌尿外科提供。实验动物为裸鼠，体重20g左右，许可证号：SCXK京2004－0001，购自中国医学科学院宣武动物所；麻醉剂速眠新Ⅱ(军事医学科学院兽医研究所)。
1．1．2 消化液：中性蛋白酶(dispose)，以D～hanks分别配制2mg/ml中性蛋白酶溶液，过滤灭菌后－20℃保存备用。
1．1．3 DAPI(Sigma)染液：称取1mg DAPI,用DMEM/F－12(GiBCO)培养液溶解定容至20ml，0.22μm微孔虑膜过滤除菌，4℃下避光保存。工作浓度为50μg/ml。
1．1．4 抗体：鼠抗人角蛋白10、14和19IgG单抗(福州迈新)，山羊抗鼠IgG2(北京中山)，以荧光素罗丹明标记的山羊抗鼠IgG2(北京中山)，两步法细胞免疫化学。
1．2 方法
1．2．1 表皮片的处理：将包皮剪切成约2.0cm×2.0cm左右的皮片，中性蛋白酶消化4℃过夜；吸弃dispase，D－Hanks液清洗后，仔细分离表皮层，设立未处理组，其余真皮面向上，用D－Hanks反复吹打漂洗进行预处理。
1．2．2 皮片移植和取材：将处理的表皮片移植前3h，加入DAPI染液，避光孵育3h，用Hank’s液冲洗7次以上去除未结合DAPI。根据无菌操作，裸鼠麻醉后，每只裸鼠背部人为设计0.5cm2大小的1～4个创面，创基喷rhEGF和bFGF，将处理过的超薄表皮片移植于8只裸鼠背部，纤维蛋白胶封闭创面，内衬少许纱布，创可贴包扎。
1．2．3 取材及标本制作：单笼密闭包喂养4～8天，随机于第四天和第七天引颈活杀取材，分别制作石蜡(厚度3～5μm)和冰冻切片(厚度4～7μm)。常规滴加一抗及荧光标记的第二抗体，甘油封片。光镜及荧光显微镜下观察。
2 结果
2．1 皮片的染色结果：分离的表皮片在HE染色及免疫组织化学染色下，表皮片细胞排列规律整齐，细胞层次较为明显。CK10用阳性细胞多分布于表皮浅层，CK14分布在基底层及棘细胞层甚至颗粒层。未行预处理的表皮片CK19染色可见阳性细胞单层排列于基底层，呈波浪状。而经预处理的表皮片仅见少量CK19阳性细胞排列于基底层，基底层细胞排列不连续。
2．2 裸鼠及移植皮片的成活情况：裸鼠共8只，其中有3只试验结束前死亡，其原因可能是麻醉及包扎过重所致。皮片移植后，分别于第四天和第七天取材。打开包扎裸鼠创面较移植前缩小，至第七天缩小更明显。排除脱落，共13个创面，两个创面皮片未成活，系包扎不确切所致，11个创面皮片成活良好，颜色尚可。HE染色显示表皮细胞极性分布存在，皮片松弛，大体细胞层次增多，皮片变厚，创基有炎性细胞浸润。
2．3 石蜡切片免疫组织化学染色结果：镜下CK14阳性细胞较未移植前增多，排列紊乱，在皮片内分散分布，个别部位可见分布拥挤现象。CK19阳性细胞脱离基底层，可见分散孤立的分布于皮片内。移植的皮片细胞层次有松弛紊乱的迹象。上述现象在移植后的第四天最为显著。但系列切片未观察到“干细胞岛”现象。
2．4 冰冻切片：DAPI荧光及免疫组化染色结果：荧光显微镜下，在蓝色波长下观察到移植表皮片区域有蓝色密集颗粒，系DAPI标记细胞的表皮细胞核，其与鼠源性组织的自发荧光区分度较为明显。红光激发波长为543nm，在560nm波长观察可见皮片内有少量的罗丹明标记山羊抗鼠IgG的明显着色，排列不规律。鼠源性组织有着色区，可能是冰冻切片较厚而造成的假阳性。
3 讨论
表皮分为五层，从里向外依次是：基底层、棘细胞层、颗粒层、透明层及角质层。具有增殖能力的细胞包括表皮干细胞和短暂扩充细胞，它们主要定位于表皮基底层和棘细胞层，通常认为CK19和CK14分别是他们分化的阶段性标记物。中性蛋白酶能温和地分离去除真皮层，获得的超薄表皮片内含有基底层细胞在内的各层表皮细胞。理论上讲，位于基底层的表皮干细胞由于失去的基底膜的贴附，在机械冲击下更容易分离下来。结果表明在机械冲击下基底层细胞CK19阳性细胞的连续性断裂，说明表皮干细胞减少。表皮于细胞是皮肤发生、修复、重塑的关键性源泉。对于修复皮肤缺损的皮肤移植物，表皮的永久再生需要有干细胞移植其中。那么将这些表皮干细胞相对不足的表皮片移植至创面上又会怎样呢?HE染色观察到皮片移植后，皮片松弛变厚，表皮细胞极性分布存在，总体细胞层次增多，创基有炎性细胞浸润。在创面愈合过程中，该皮片一方面通过自身的细胞增殖参与创面愈合，另 一方面在创口逐渐收缩的过程中，皮片变厚，从而在质和量上加固创面。免疫组织化学显示，较移植前，CK14阳性细胞增多，皮片内分散存在，个别部位可见排列拥挤。而CK19阳性细胞脱离基底层，可见分散孤立的分布于皮片内。在荧光显微镜下可见到少量DAPI和CK19同时着色的阳性细胞，分布不规律。这种特异性的角质形成细胞的极性分布紊乱现象在移植后的第四天最为显著。那么如何解释在表皮片中出现的CK14及CK19阳性细胞的异位分布现象?由于在皮片移植之前对表皮片进行示踪，荧光显微镜下在皮片内未见到DAPI阴性而角蛋白阳性着色的细胞，基本上排除了异源性细胞浸入皮片内的可能。我们推断，在上皮－间质界面形成由复杂的细胞信号组成的“微环境”的作用下，可能有以下原因：一是ESC和TAC产生了“跳跃”，即伴随着机体创伤修复信号的启动，ESC和TAC快速地向表皮上层迁移，能动的参与创面的修复；二是由于机体创伤修复的紧迫性，虽然ESC和脱离表皮基底层进入了分化状态而形成了短暂TAC，TAC进而分化为PMD细胞，但这些TAC和PMD细胞的状态尚属幼年期，仍表达更为原始细胞的某些特征；三是是否存在由成熟的表皮细胞逆分化为ESC样细胞或TAC样细胞。成熟细胞可通过去分化、转分化和逆分化方式向肿瘤细胞、其他(胚层的)成熟细胞和干细胞转变。这些细胞可能在丧失表达原细胞蛋白分子或结构特征的同时，合成和装配了新生细胞的蛋白，从而完成成体细胞的异常分化(逆分化和/或转分化)过程。但其中具体的分子生物学机制，值得进一步研究。如何解释特异性的角质形成细胞的异位现象在移植后的第四天最为显著的现象?皮片移植第四天是血运正在建立但仍未稳定时期，血液循环呈摆动或呆滞的缓慢移动。此时的皮片逐渐适应新的环境，表皮细胞处于缺血及缺氧状态，加上人为添加的rhEGF及bFGF在局部产生的作用，由此复杂的共同的信号转导所产生了一系列的分子生物学效应，可能导致了上述三种可能机制的发生。事实上，体外的实验研究中第四天也是一个关键点。McGann cJ等利用早期蝾螈的肢体再生提取物来诱导C2C12小鼠的肌管，观察到最大量的肌管进入细胞周期并形成增殖性的单个核细胞发生于第三天，第四天呈持续状态。Shuibing Chen等用一种名为“逆转素”的小分子物质诱导C2C12肌管。加入该物质后4天后，肌管形成完全被抑制，细胞不断地形成单核细胞群，肌浆蛋白特异标志如MyoD和myosin培养开始消失，此后细胞在成骨或脂肪诱导条件下表现为相应再分化细胞特异性标记物。这种体内和体外实验在时间上的巧合，是否提示四天之中细胞获得了可塑性，在发育上发生了根本性的逆转；这种细胞异常分化的节点是一种必然还是偶然值得探讨。本实验观察到特异性的角质形成细胞的异位分布及皮片增厚的现象，我们考虑不能排除表皮细胞在超薄表皮片移植中显示出逆分化和再分化。这种特异性细胞的异位可能参与了创面修复以及之后表皮重塑。