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摘要 [目的]建立茶叶中茶多酚、生物碱及茶氨酸的质谱分析方法。[方法]采用Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0 mm，5 μm）色谱柱，甲醇、水梯度洗脱20 min进行色谱分离；在质谱正离子模式下，用多反应监测离子对（MRM）模式进行定量分析。[结果]可在20 min内同时定量9种茶多酚、生物碱和茶氨酸。[结论]该方法灵敏、准确、选择性高，适应于茶叶中茶多酚、生物碱和茶氨酸的快速定量分析。
关键词 茶叶；茶多酚；生物碱；茶氨酸；液相色谱-串联质谱
中图分类号 TS207.3 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）08-0195-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.051
Abstract [Objective]The research aimed to establish a mass spectrometric analysis method for tea polyphenols，alkaloids and theanine in tea.[Method]The column was separated by a Shimpack VPODS （150 L×2.0 mm，5 μm） column and eluted with methanol and water for 20 min.[Result]Quantitative analysis was performed using the multiple reactions monitoring （MRM） mode in mass spectrometry positive ion mode.[Result]The method could quantitate 9 kinds of theanine，tea polyphenols and Alkaloids in 20 min.[Conclusion]The method is rapid，accurate and selective，it can be used to quantitate theanine，tea polyphenols and alkaloids rapidly in tea.
Key words Tea；Tea polyphenols；Alkaloids；Theanine；Liquid chromatographytandem mass spectrometry
茶葉中含有非常丰富的营养成分和药效成分，是人们日常生活中最常饮用的“健康饮料”。 茶叶中含有300多种对人体有益的化学成分，包括氨基酸、茶多酚、生物碱、维生素等[1]。茶叶中氨基酸的主要成分为茶氨酸和谷氨酸；茶叶药效功能的主要成分为茶多酚，约占茶叶干重的18%～36%，而茶多酚又以儿茶素类为主[2]。儿茶素类主要组成成分为表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）。茶多酚具有抗氧化、抗血栓、抑制细菌、提高人体免疫力等功效[3]，已有的科学研究证明茶多酚对老年痴呆、糖尿病和乳腺癌具有防治和抑制作用[4-6]。前人的研究主要集中在液相色谱分析方法[7-9]或者某一类化合物的研究[10-13]，液相色谱-串联质谱分析方法应用的比较少[14-15]。笔者利用液相色谱质谱高灵敏、高选择性的分析特点，建立同时定量茶叶中主要化学成分的分析方法，可为茶叶品质分析或药用价值开发提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试材。安吉白茶、铁观音和紫娟茶叶鲜样于2017年5月采自安徽农业大学郭河品种茶园，采摘部位为一芽二叶。华农绿针为华中农业大学生产的商业成品绿茶；贡品大红袍为福建省武夷山市慧苑岩茶科学技术研究所研制的半发酵乌龙茶，市面采购；松峰茶为湖北省赤壁市羊楼洞茶叶有限公司生产的绿茶，市面采购。
1.1.2 仪器。
日本岛津LC-20AD 液相色谱仪，岛津Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0 mm，5 μm）色谱柱；美国AB Sciex 公司API 4000 Qtrap 串联三重四级杆线性离子阱质谱仪；Millipore 超纯水仪（Millipore公司）；万分之一天平（梅特勒公司）；蠕动泵（Hamilton公司）。
1.1.3 试剂。乙腈（Merk，色谱纯）；超纯水；乙酸（色谱纯）；1 mL 医用注射器；0.22 μm过滤头（有机相，津腾牌）；谷氨酰胺、谷氨酸、茶氨酸、表儿茶素（EC）、没食子儿茶素（EGC）、儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、可可碱及咖啡碱均为西格玛公司色谱纯试剂，由安徽农业大学茶食学院赵剑教授提供。
1.2 样品处理方法
1.2.1 茶叶鲜样。精确称取0.035 g茶叶鲜样干粉，加5 mL 80%的甲醇水溶液，冰浴超声提取30 min，然后离心取上清，经 0.22 μm滤膜过滤，稀释100倍后进样分析。
1.2.2 商品茶叶。精确称取0.15 g商品茶叶，加50 mL沸水浸泡40 min，然后离心取上清，经 0.22 μm滤膜过滤，稀释10倍后进样分析。
1.3 试验条件
1.3.1 色谱条件。岛津Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0 mm，5 μm）色谱柱，样品室温度为室温；流动相：A为0.1%的乙酸水溶液（V/V），B为0.1%的乙酸的甲醇溶液（V/V）；流速为0.25 mL/min。梯度洗脱条件为：0～4.0 min，10%的B；4.1～10.0 min B从10%升至100%，10.0～15 min为100%的B，15.01～20.00 min为10%的B。柱温箱温度为40 ℃，进样量为10 μL。 1.3.2 质谱条件。采用电喷雾（ESI）离子源，在正离子电离模式下选用多反应监测（MRM）离子对扫描模式进行定量分析。电喷雾电压5 500 V；离子源温度500 ℃；离子源辅助气GS1/GS2气流均为50 L/h。
2 结果与分析
2.1 化合物质谱参数优化 将各化合物标准品用甲醇水配制成100 μg/L左右的溶液。用针泵注射器以10 μL/min的速度直接进到质谱仪。先用质谱Q1全扫描模式，在分子量100～500 Da扫描确定化合物的Q1母离子，同样电压下比较正负离子模式下母离子的强度，确定正离子电离模式信号较高，然后再优化DP电压。再在子离子扫描模式下，对Q1母离子进行打碎，优化碎裂能量（CE），使各子离子碎片和母离子信号强度比例最优。从化合物的二级质谱碎片中（图1），选取信号强度最高的子离子作为Q3，与母离子Q1组成定量分析的特征离子对MRM进行定量分析，各化合物MRM离子对参数及选择离子流色谱图见图2和表1。
2.2 标准曲线方程和检出限
分别称取各化合物标准品2.5 mg，用80%甲醇/水（V/V）定容为100 mL的混合母液。 继续用水溶液稀释成250、125、62.5、31.25、15.6 μg/L的梯度标准溶液。在“1.3”试验条件下上机分析，以各化合物的浓度为横坐标x、相应峰面积为y绘制标准曲线，得到各物质的标准曲线方程（表1）。
2.3 回收率试验
因茶叶样品中的儿茶素在热水浸提过程中有相互转化，因此做加标回收试验没有太大的意义[10]。
2.4 茶叶样品定量分析 将安吉白茶、铁观音和紫仙3种茶叶鲜样粉末分别称取2份，按“1.2.1”方法处理后上机分析，得到各化合物含量见表2。分别称取市售商品茶叶华农绿针、贡品大红袍、松峰茶2份，按“1.2.2”方法处理后上机分析，得到各化合物含量见表3。
从表2可看出，同一品种茶叶中各化合物含量有显著差异；不同茶叶品种之间各化合物含量差别比较大，基本规律是EGCG含量最高，ECG或茶氨酸其次。从表3和表2数据对比发现，商品茶中各化合物的含量除了可可碱都远低于新鲜茶叶，应该是商品茶不同配方和加工过程中损失造成的。无论是新鲜茶叶还是商品茶叶，都未检测到茶叶碱，可能是因为本身含量太低及前处理损失导致未能检出。
3 结论与讨论
该研究建立的多种茶多酚、茶氨酸和生物碱的质谱检测方法，可在20 min内定量出茶叶中9种主要化合物的含量。该方法与常用的高效液相色谱方法相比，灵敏度和选择性有显著提高；质谱检测的高选择性有效降低了基质干扰，提高了测定结果的准确度；每个化合物MRM离子对都有单独的检测通道，即使2种化合物保留时间完全一样也不会影响其峰面积定量。该方法可适用于茶叶研究中茶多酚、生物碱和茶氨酸的快速定量分析。 参考文献
[1]宛晓春.茶叶生物化学[M].北京：中国农业出版社，2003：32-34.
[2] 杨成对，张经华，宋莉晖，等.四种茶中茶多酚成分分析[J]. 食品科学，2009，30（18）：307-309.
[3] 范海涛，刘庄，张照康，等.一种毛尖茶叶多糖MTP06的提取分离及其活性测定[J].茶叶科学，2016，36（5）：531-536.
[4] 魏然，徐平，应乐，等.茶多酚对阿尔茨海默病的防治功能与机理研究进展[J]. 茶叶科学，2016，36（1）：1-10.
[5] 高媛圆，毛立民，徐平，等.茶多酚防治2型糖尿病的分子机理研究进展[J]. 茶叶科学，2015，35（3）：239-247.
[6] 乔如颖，李明，郑新强，等.茶叶及其儿茶素类对乳腺癌的抑制作用[J].茶叶科学，2016，36（6）：557-566.
[7] 郭穎，陈琦，黄峻榕，等.超高效液相色谱法测定茶叶中没食子酸、咖啡碱和儿茶素含量[J].食品科技，2015，40（11）：296-300.
[8] 曾秋梅，梁杏秋，王晓琴，等.RP-HPLC-DAD 法测定茶叶籽油酚类化合物[J].中国粮油学报，2017，32（4）：141-146.
[9] 戴军，王洪新，陈尚卫，等.茶叶及茶多酚中儿茶素的高效液相色谱分析方法研究[J].色谱，2001，19（5）：398-402.
[10] 郭颖，黄峻榕，陈琦，等.茶叶中儿茶素类测定方法的优化[J].食品科学，2016，37（6）：137-141.
[11] 金钰，周有祥，胡定金，等.湖北不同地区绿茶中儿茶素与咖啡因含量比较[J].湖北农业科学，2017，56（23）：4588-4590.
[12] 董占波，许金伟，张星海，等.平阳早香茶与平阳黄汤主要品质成分分析[J].广州化工，2017，45（21）：109-111.
[13] 黄正安.饮品茶类化学成分与药理作用的研究进展[J].现代医学与健康研究， 2017，1（6）：151-152.
[14] 王虹，康海宁，陈军辉，等.HPLC-APCI-MS 法测定茶叶中的茶氨酸[J].茶叶科学，2008，28（6）：20-26.
[15] 赖国银，王俐娟，卢鹤，等.超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱定性研究茶叶籽中的酚类化合物[J].色谱，2017，35（5）：502-508.
关键词 茶叶；茶多酚；生物碱；茶氨酸；液相色谱-串联质谱
中图分类号 TS207.3 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）08-0195-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.051
Abstract [Objective]The research aimed to establish a mass spectrometric analysis method for tea polyphenols，alkaloids and theanine in tea.[Method]The column was separated by a Shimpack VPODS （150 L×2.0 mm，5 μm） column and eluted with methanol and water for 20 min.[Result]Quantitative analysis was performed using the multiple reactions monitoring （MRM） mode in mass spectrometry positive ion mode.[Result]The method could quantitate 9 kinds of theanine，tea polyphenols and Alkaloids in 20 min.[Conclusion]The method is rapid，accurate and selective，it can be used to quantitate theanine，tea polyphenols and alkaloids rapidly in tea.
Key words Tea；Tea polyphenols；Alkaloids；Theanine；Liquid chromatographytandem mass spectrometry
茶葉中含有非常丰富的营养成分和药效成分，是人们日常生活中最常饮用的“健康饮料”。 茶叶中含有300多种对人体有益的化学成分，包括氨基酸、茶多酚、生物碱、维生素等[1]。茶叶中氨基酸的主要成分为茶氨酸和谷氨酸；茶叶药效功能的主要成分为茶多酚，约占茶叶干重的18%～36%，而茶多酚又以儿茶素类为主[2]。儿茶素类主要组成成分为表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）。茶多酚具有抗氧化、抗血栓、抑制细菌、提高人体免疫力等功效[3]，已有的科学研究证明茶多酚对老年痴呆、糖尿病和乳腺癌具有防治和抑制作用[4-6]。前人的研究主要集中在液相色谱分析方法[7-9]或者某一类化合物的研究[10-13]，液相色谱-串联质谱分析方法应用的比较少[14-15]。笔者利用液相色谱质谱高灵敏、高选择性的分析特点，建立同时定量茶叶中主要化学成分的分析方法，可为茶叶品质分析或药用价值开发提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试材。安吉白茶、铁观音和紫娟茶叶鲜样于2017年5月采自安徽农业大学郭河品种茶园，采摘部位为一芽二叶。华农绿针为华中农业大学生产的商业成品绿茶；贡品大红袍为福建省武夷山市慧苑岩茶科学技术研究所研制的半发酵乌龙茶，市面采购；松峰茶为湖北省赤壁市羊楼洞茶叶有限公司生产的绿茶，市面采购。
1.1.2 仪器。
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1.2 样品处理方法
1.2.1 茶叶鲜样。精确称取0.035 g茶叶鲜样干粉，加5 mL 80%的甲醇水溶液，冰浴超声提取30 min，然后离心取上清，经 0.22 μm滤膜过滤，稀释100倍后进样分析。
1.2.2 商品茶叶。精确称取0.15 g商品茶叶，加50 mL沸水浸泡40 min，然后离心取上清，经 0.22 μm滤膜过滤，稀释10倍后进样分析。
1.3 试验条件
1.3.1 色谱条件。岛津Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0 mm，5 μm）色谱柱，样品室温度为室温；流动相：A为0.1%的乙酸水溶液（V/V），B为0.1%的乙酸的甲醇溶液（V/V）；流速为0.25 mL/min。梯度洗脱条件为：0～4.0 min，10%的B；4.1～10.0 min B从10%升至100%，10.0～15 min为100%的B，15.01～20.00 min为10%的B。柱温箱温度为40 ℃，进样量为10 μL。 1.3.2 质谱条件。采用电喷雾（ESI）离子源，在正离子电离模式下选用多反应监测（MRM）离子对扫描模式进行定量分析。电喷雾电压5 500 V；离子源温度500 ℃；离子源辅助气GS1/GS2气流均为50 L/h。
2 结果与分析
2.1 化合物质谱参数优化 将各化合物标准品用甲醇水配制成100 μg/L左右的溶液。用针泵注射器以10 μL/min的速度直接进到质谱仪。先用质谱Q1全扫描模式，在分子量100～500 Da扫描确定化合物的Q1母离子，同样电压下比较正负离子模式下母离子的强度，确定正离子电离模式信号较高，然后再优化DP电压。再在子离子扫描模式下，对Q1母离子进行打碎，优化碎裂能量（CE），使各子离子碎片和母离子信号强度比例最优。从化合物的二级质谱碎片中（图1），选取信号强度最高的子离子作为Q3，与母离子Q1组成定量分析的特征离子对MRM进行定量分析，各化合物MRM离子对参数及选择离子流色谱图见图2和表1。
2.2 标准曲线方程和检出限
分别称取各化合物标准品2.5 mg，用80%甲醇/水（V/V）定容为100 mL的混合母液。 继续用水溶液稀释成250、125、62.5、31.25、15.6 μg/L的梯度标准溶液。在“1.3”试验条件下上机分析，以各化合物的浓度为横坐标x、相应峰面积为y绘制标准曲线，得到各物质的标准曲线方程（表1）。
2.3 回收率试验
因茶叶样品中的儿茶素在热水浸提过程中有相互转化，因此做加标回收试验没有太大的意义[10]。
2.4 茶叶样品定量分析 将安吉白茶、铁观音和紫仙3种茶叶鲜样粉末分别称取2份，按“1.2.1”方法处理后上机分析，得到各化合物含量见表2。分别称取市售商品茶叶华农绿针、贡品大红袍、松峰茶2份，按“1.2.2”方法处理后上机分析，得到各化合物含量见表3。
从表2可看出，同一品种茶叶中各化合物含量有显著差异；不同茶叶品种之间各化合物含量差别比较大，基本规律是EGCG含量最高，ECG或茶氨酸其次。从表3和表2数据对比发现，商品茶中各化合物的含量除了可可碱都远低于新鲜茶叶，应该是商品茶不同配方和加工过程中损失造成的。无论是新鲜茶叶还是商品茶叶，都未检测到茶叶碱，可能是因为本身含量太低及前处理损失导致未能检出。
3 结论与讨论
该研究建立的多种茶多酚、茶氨酸和生物碱的质谱检测方法，可在20 min内定量出茶叶中9种主要化合物的含量。该方法与常用的高效液相色谱方法相比，灵敏度和选择性有显著提高；质谱检测的高选择性有效降低了基质干扰，提高了测定结果的准确度；每个化合物MRM离子对都有单独的检测通道，即使2种化合物保留时间完全一样也不会影响其峰面积定量。该方法可适用于茶叶研究中茶多酚、生物碱和茶氨酸的快速定量分析。 参考文献
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[2] 杨成对，张经华，宋莉晖，等.四种茶中茶多酚成分分析[J]. 食品科学，2009，30（18）：307-309.
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[7] 郭穎，陈琦，黄峻榕，等.超高效液相色谱法测定茶叶中没食子酸、咖啡碱和儿茶素含量[J].食品科技，2015，40（11）：296-300.
[8] 曾秋梅，梁杏秋，王晓琴，等.RP-HPLC-DAD 法测定茶叶籽油酚类化合物[J].中国粮油学报，2017，32（4）：141-146.
[9] 戴军，王洪新，陈尚卫，等.茶叶及茶多酚中儿茶素的高效液相色谱分析方法研究[J].色谱，2001，19（5）：398-402.
[10] 郭颖，黄峻榕，陈琦，等.茶叶中儿茶素类测定方法的优化[J].食品科学，2016，37（6）：137-141.
[11] 金钰，周有祥，胡定金，等.湖北不同地区绿茶中儿茶素与咖啡因含量比较[J].湖北农业科学，2017，56（23）：4588-4590.
[12] 董占波，许金伟，张星海，等.平阳早香茶与平阳黄汤主要品质成分分析[J].广州化工，2017，45（21）：109-111.
[13] 黄正安.饮品茶类化学成分与药理作用的研究进展[J].现代医学与健康研究， 2017，1（6）：151-152.
[14] 王虹，康海宁，陈军辉，等.HPLC-APCI-MS 法测定茶叶中的茶氨酸[J].茶叶科学，2008，28（6）：20-26.
[15] 赖国银，王俐娟，卢鹤，等.超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱定性研究茶叶籽中的酚类化合物[J].色谱，2017，35（5）：502-508.