为验证伪狂犬病病毒（pseudorabies virus, PRV）US3基因缺失后作为疫苗的免疫效力，构建PRV△gE/TK/US3基因缺失株。利用PRV QYY2012变异株基因组扩增US3基因两侧序列作为同源重组的左右侧同源臂，以绿色荧光蛋白（EGFP）为标记基因，经酶切依次连接至pBluescript SK（-）,构建重组转移载体pSK-US3-LR-EGFP。将pSK-US3-LR-EGFP和PRV△gE/TK株基因组共转染293 T细胞，以绿色荧光为标记经蚀斑纯化获得重组病毒PRV△gE/TK/US3/EGFP+株。将pcGlobin2-Cre质粒和PRV△gE/TK/US3/EGFP+株基因组共转染293 T细胞，利用Cre-Loxp系统去除EGFP基因，蚀斑纯化无荧光重组病毒，获得PRV△gE/TK/US3基因缺失株，并对该毒株遗传稳定性、生物学特性、安全性和免疫效力进行初步研究。PCR及测序鉴定证实PRV△gE/TK/US3株缺失US3基因925 bp,在Vero细胞可稳定传代；与PRV△gE/TK亲本株相比，PRV△gE/TK/US3株病毒滴度较低，但仍具有良好的增殖能力。该基因缺失毒株接种小鼠后具有安全性，能产生较PRV△gE/TK株更高水平的抗PRV中和抗体，且能维持较长时间；PRV△gE/TK/US3株免疫小鼠对PRV强毒株攻击可提供完全保护力。结果表明，成功构建的PRV△gE/TK/US3基因缺失株具有良好的免疫原性，可作为优秀的伪狂犬病基因缺失疫苗候选种毒株。