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摘要：选择毕赤酵母表达系统，根据酵母密码子偏爱性合成ChIFN-α成熟肽的基因序列，连接至载体pPIC9K中，构建重组质粒pPIC9K-α，将重组载体酶切线性后克隆至毕赤酵母GS115，筛选高拷贝转化子及其甲醇利用型，对其表达条件进行优化。结果表明：鸡α-干扰素在毕赤酵母中成功表达，在含2%酸水解酪蛋白，经0.5%甲醇在28 ℃诱导表达72 h后，重组蛋白表达量最多，抗病毒活性最高。
关键词：鸡；α-干扰素；毕赤酵母；基因表达；表达条件
中图分类号： S858.31文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0275-03
收稿日期：2014-11-27
基金项目：江苏省科技支撑计划（编号：BE2014380）；江苏农牧科技职业学院2014年度重点支持项目（编号：NSFZD1405）；扬州朝天歌农牧科技有限公司横向合作课题（编号：00010114012）。
作者简介：董亚青（1980—），女，江苏兴化人，硕士，讲师，主要从事预防兽医学研究。E-mail： [email protected]。
通信作者：王永娟，博士，副教授，主要从事生物工程技术研究。E-mail：[email protected]。干扰素（IFN）是1种具有抗病毒、调节免疫等作用的细胞因子，由英国科学家Isaacs和Lindemann于1957年首次发现[1]。Lamp等于1963年纯化了这种细胞因子，并证明其为蛋白质[2]。干扰素具有一定的特异性，只有同种的生物细胞产生的干扰素才能起到保护作用，对异种生物细胞则无作用[3]。根据细胞来源、生化特性及生物学活性可将其分为两大类：Ⅰ类、Ⅱ类[4]。鸡α-干扰素（ChIFN-α）全基因为582个碱基，编码193个氨基酸，包含31个氨基酸的信号肽、162个氨基酸的成熟蛋白[5]。ChIFN-α属于Ⅰ类干扰素，是禽类主要干扰素，具有抑制病毒复制、加强NK细胞杀伤力的能力[6]。本试验根据酵母密码子偏爱性合成ChIFN-α成熟肽的基因序列，克隆至毕赤酵母分泌表达型载体pPIC9K中，构建重组质粒pPIC9K-α，电转化至毕赤酵母GS115，筛选并鉴定其甲醇利用型，优化其表达条件，以期获得表达量多、抗病毒活性高的重组蛋白，旨在为干扰素应用研究提供基础。
1材料与方法
1.1材料
ChIFN-α序列合成由生工生物工程上海（股份）有限公司完成；毕赤酵母GS115由笔者所在实验室保存；限制性内切酶、连接酶、Preatained Protein 分子量marker均购自Fermentas公司；Wizard DNA Clean-up System均购自美国Promega公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、培养基等均购自北京康为世纪生物科技有限公司。
1.2重组质粒pPIC9K-α的构建
根据酵母密码子偏爱性合成ChIFN-α成熟肽的基因序列，在其末端加入设计好的酶切位点，经过酶切、连接将ChIFN-α的基因序列克隆至毕赤酵母分泌表达型载体pPIC9K中，转化至大肠杆菌DH5α中进行扩增，提取质粒进行酶切鉴定。
1.3重组质粒pPIC9K-α的转化及筛选
制备毕赤酵母感受态，-70℃保存。将鉴定正确的重组质粒pPIC9K-α大量制备并纯化，经SalⅠ 酶切线性并纯化后电转化至毕赤酵母GS115感受态中，将转化菌涂布于不含组氨酸的MD琼脂平板上，30℃孵育3 d。用含不同浓度G418的YPD平板筛选高拷贝转化子。用MD、MM平板鉴定其甲醇利用型，通常在MD平板上生长快且MM平板上生长缓慢或不生长的为Muts，生长速度一样的为Mut 。
1.4重组质粒pPIC9K-α的表达及抗病毒试验
挑取生长于YPD平板上的单菌落，接种于BMGY培养基中培养24 h左右，至D600 nm值为2～6，3 000 g离心3 min，收集菌体沉淀，悬浮于含甲醇的BMMY液体培养基中，至D600 nm值约为1，30 ℃ 230 r/min进行诱导表达，每隔24 h补加甲醇至终浓度为0.5%，96 h后收获培养液，3 000 g离心5 min，收集上清。在鸡胚成纤维细胞-水疱性口炎病毒（CEF-VSV）系统中检测重组ChIFN-α的抗病毒活性，在生长正常的CEF中，分别加入重组的ChIFN-α、病毒和重组ChIFN-α、病毒，培养约36 h，观察细胞的生长情况。
1.5ChIFN-α成熟肽表达条件的优化
挑取生长于YPD平板上的高拷贝重组菌的单菌落，接种于BMGY培养基中培养至D600 nm值为2～6，3 000 g离心3 min，收集菌体沉淀，悬浮于含0.5%甲醇的BMMY培养基中，至D600 nm值约为1，分别从第1天起每隔1 d取发酵液上清进行抗病毒试验。挑取高拷贝重组菌单菌落，同上进行诱导表达，诱导温度分别设定为20、22、24、26、28、30 ℃，取诱导后72 h培养上清测其抗病毒活性。挑取高拷贝重组菌单菌落，同上进行诱导表达，甲醇质量分数分别设置为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5%，取诱导后72 h培养上清测其抗病毒活性。在培养基中加入酸水解酪蛋白作为竞争性底物，酸水解酪蛋白的质量分数分别设置为1%、2%、3%，诱导表达方法同上。
2结果与分析
2.1重组质粒pPIC9K-α的构建
将连接有ChIFN-α基因的pPIC9K转化至大肠杆菌DH5α中，挑去阳性菌落进行扩增，提取质粒，用EcoRⅠ、SnalBⅠ进行双酶切，显示结果正确（图1）。
2.2重组质粒pPIC9K-α的转化及筛选
将重组质粒pPIC9K-α电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，将MD琼脂平板上的阳性克隆用含不同质量浓度G418的YPD平板筛选高拷贝转化子，获得4株抗4 mg/mL G418的高拷贝转化子及5株抗3 mg/mL G418的高拷贝转化子。用MD、MM平板鉴定其甲醇利用型，结果显示均为Mut 。 2.3重组质粒pPIC9K-α的表达及细胞毒性试验
接毒约36 h后，正常生长的GEFs基本未出现病变（图2-1），加入了重组ChIFN-α的正常生长的CEFs情况更加良好（图2-2），加入了病毒和重组ChIFN-α的细胞（图2-3）与只加病毒组细胞（图2-4） 相比， 细胞残缺程度明显较轻。4mg/mLG418抗性的重组酵母菌株的表达水平
与3 mg/mL G418抗性重组酵母菌株相当，不存在拷贝数依赖性。
2.4ChIFN-α成熟肽表达条件的优化
诱导24 h所得的抗病毒效果不明显，1～3 d重组蛋白的活性增强，3 d后活性有所下降（图3）。不同温度诱导 3 d 后，28 ℃摇瓶发酵培养时，重组蛋白的活性最高（图4）。不同甲醇质量分数时，0.5%甲醇诱导表达的重组蛋白活性最高（图5）。在培养基中加入酸水解酪蛋白作为竞争性底物时，当酪蛋白质量分数为2%时，重组蛋白活性最强（图6）。
综上所述，重组蛋白ChIFN-α最佳诱导表达条件为：在含2%酸水解酪蛋白、经0.5%甲醇28 ℃诱导表达3 d后，重组蛋白表达量最多，抗病毒活性最高。
3结论与讨论
我国养禽业规模及总量均居世界首位[7]，但禽病仍然阻碍养禽业发展，给养禽业带来了巨大的经济损失。一些禽病的治疗及预防缺乏有效手段。因此，寻求安全、高效的治疗制
剂和预防制剂迫在眉睫。干扰素是多功能的糖蛋白，与免疫球蛋白不同，它不具有免疫球蛋白的抗体特异性，但其具备广谱的抗病毒活性及强大的免疫调节作用[8-10]，对防治禽病具有重要意义。由于天然的干扰素在机体内表达量甚微，无法满足临床需要，因此人们利用基因工程技术来研究开发高效生产干扰素，用于防治病毒性疾病[11]。本研究利用毕赤酵母表达体系表达制备了ChIFN-α，构建了毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K-α，获得了高拷贝重组酵母菌株，对重组酵母菌进行诱导，使重组蛋白获得了较高水平表达，且具有良好的抗病毒活性，解决了原核表达系统抗菌肽生产过程中普遍存在的表达量低、活性低、成本高等问题，为禽病防治奠定了良好的基础。
参考文献：
[1]Isaaca A，Lindenmann J. Virus interference：1. The interferon[J]. Proc R Soc Lond Ser，1957，147：258-263.
[2]Lamp S P，TytellA A，Nemes M M，et al. Purification and characterization of chick embryo interferon[J]. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine，1963，112：468-478.
[3]朱颖慧，朱兰才，刘然义，等. 干扰素-γ治疗肿瘤的研究进展[J]. 肿瘤学杂志，2008，14（1）：4-9.
[4]焦道忠，王云龙，李晨阳，等. 鸡α干扰素基因的克隆与表达[J]. 生物学杂志，2008，25（5）：48-51.
[5]王永娟，朱善元，左伟勇，等. 鸡α-干扰素成熟肽的原核表达及其多价血清的制备[J]. 扬州大学学报：农业与生命科学版，2013，34（1）：32-35，40.
[6]殷震，刘景华. 动物病毒学[M]. 2版.北京：科学技术出版社，1997：704 - 735.
[7]侯庆华. 养禽业的现状及发展趋势[J]. 郑州牧业工程高等专科学校学报，2013，33（3）：22-23.
[8]霍海龙，赵跃，王锐，等. 猪白细胞介素6和α干扰素基因的融合及其原核表达[J]. 江苏农业学报，2013，29（2）：329-334.
[9]吴静，李玉峰，宋敏训，等. 鸡α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及其抗病毒活性测定[J]. 山东农业科学，2006（1）：61-64.
[10]韦琴，吴士筠，梅辉，等. 鸡α干扰素在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒功能初探[J]. 江苏农业科学，2014，42（10）：49-51.
[11]姚清侠，钱平，曹毅，等. 猪α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定[J]. 中国兽医学报，2008，28（12）：1456-1460.云巾宴，任春宇，车达，等. 气肿疽梭菌不同靶基因检测方法的比较[J]. 江苏农业科学，2015，43（11
：278-280.
关键词：鸡；α-干扰素；毕赤酵母；基因表达；表达条件
中图分类号： S858.31文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0275-03
收稿日期：2014-11-27
基金项目：江苏省科技支撑计划（编号：BE2014380）；江苏农牧科技职业学院2014年度重点支持项目（编号：NSFZD1405）；扬州朝天歌农牧科技有限公司横向合作课题（编号：00010114012）。
作者简介：董亚青（1980—），女，江苏兴化人，硕士，讲师，主要从事预防兽医学研究。E-mail： [email protected]。
通信作者：王永娟，博士，副教授，主要从事生物工程技术研究。E-mail：[email protected]。干扰素（IFN）是1种具有抗病毒、调节免疫等作用的细胞因子，由英国科学家Isaacs和Lindemann于1957年首次发现[1]。Lamp等于1963年纯化了这种细胞因子，并证明其为蛋白质[2]。干扰素具有一定的特异性，只有同种的生物细胞产生的干扰素才能起到保护作用，对异种生物细胞则无作用[3]。根据细胞来源、生化特性及生物学活性可将其分为两大类：Ⅰ类、Ⅱ类[4]。鸡α-干扰素（ChIFN-α）全基因为582个碱基，编码193个氨基酸，包含31个氨基酸的信号肽、162个氨基酸的成熟蛋白[5]。ChIFN-α属于Ⅰ类干扰素，是禽类主要干扰素，具有抑制病毒复制、加强NK细胞杀伤力的能力[6]。本试验根据酵母密码子偏爱性合成ChIFN-α成熟肽的基因序列，克隆至毕赤酵母分泌表达型载体pPIC9K中，构建重组质粒pPIC9K-α，电转化至毕赤酵母GS115，筛选并鉴定其甲醇利用型，优化其表达条件，以期获得表达量多、抗病毒活性高的重组蛋白，旨在为干扰素应用研究提供基础。
1材料与方法
1.1材料
ChIFN-α序列合成由生工生物工程上海（股份）有限公司完成；毕赤酵母GS115由笔者所在实验室保存；限制性内切酶、连接酶、Preatained Protein 分子量marker均购自Fermentas公司；Wizard DNA Clean-up System均购自美国Promega公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、培养基等均购自北京康为世纪生物科技有限公司。
1.2重组质粒pPIC9K-α的构建
根据酵母密码子偏爱性合成ChIFN-α成熟肽的基因序列，在其末端加入设计好的酶切位点，经过酶切、连接将ChIFN-α的基因序列克隆至毕赤酵母分泌表达型载体pPIC9K中，转化至大肠杆菌DH5α中进行扩增，提取质粒进行酶切鉴定。
1.3重组质粒pPIC9K-α的转化及筛选
制备毕赤酵母感受态，-70℃保存。将鉴定正确的重组质粒pPIC9K-α大量制备并纯化，经SalⅠ 酶切线性并纯化后电转化至毕赤酵母GS115感受态中，将转化菌涂布于不含组氨酸的MD琼脂平板上，30℃孵育3 d。用含不同浓度G418的YPD平板筛选高拷贝转化子。用MD、MM平板鉴定其甲醇利用型，通常在MD平板上生长快且MM平板上生长缓慢或不生长的为Muts，生长速度一样的为Mut 。
1.4重组质粒pPIC9K-α的表达及抗病毒试验
挑取生长于YPD平板上的单菌落，接种于BMGY培养基中培养24 h左右，至D600 nm值为2～6，3 000 g离心3 min，收集菌体沉淀，悬浮于含甲醇的BMMY液体培养基中，至D600 nm值约为1，30 ℃ 230 r/min进行诱导表达，每隔24 h补加甲醇至终浓度为0.5%，96 h后收获培养液，3 000 g离心5 min，收集上清。在鸡胚成纤维细胞-水疱性口炎病毒（CEF-VSV）系统中检测重组ChIFN-α的抗病毒活性，在生长正常的CEF中，分别加入重组的ChIFN-α、病毒和重组ChIFN-α、病毒，培养约36 h，观察细胞的生长情况。
1.5ChIFN-α成熟肽表达条件的优化
挑取生长于YPD平板上的高拷贝重组菌的单菌落，接种于BMGY培养基中培养至D600 nm值为2～6，3 000 g离心3 min，收集菌体沉淀，悬浮于含0.5%甲醇的BMMY培养基中，至D600 nm值约为1，分别从第1天起每隔1 d取发酵液上清进行抗病毒试验。挑取高拷贝重组菌单菌落，同上进行诱导表达，诱导温度分别设定为20、22、24、26、28、30 ℃，取诱导后72 h培养上清测其抗病毒活性。挑取高拷贝重组菌单菌落，同上进行诱导表达，甲醇质量分数分别设置为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5%，取诱导后72 h培养上清测其抗病毒活性。在培养基中加入酸水解酪蛋白作为竞争性底物，酸水解酪蛋白的质量分数分别设置为1%、2%、3%，诱导表达方法同上。
2结果与分析
2.1重组质粒pPIC9K-α的构建
将连接有ChIFN-α基因的pPIC9K转化至大肠杆菌DH5α中，挑去阳性菌落进行扩增，提取质粒，用EcoRⅠ、SnalBⅠ进行双酶切，显示结果正确（图1）。
2.2重组质粒pPIC9K-α的转化及筛选
将重组质粒pPIC9K-α电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，将MD琼脂平板上的阳性克隆用含不同质量浓度G418的YPD平板筛选高拷贝转化子，获得4株抗4 mg/mL G418的高拷贝转化子及5株抗3 mg/mL G418的高拷贝转化子。用MD、MM平板鉴定其甲醇利用型，结果显示均为Mut 。 2.3重组质粒pPIC9K-α的表达及细胞毒性试验
接毒约36 h后，正常生长的GEFs基本未出现病变（图2-1），加入了重组ChIFN-α的正常生长的CEFs情况更加良好（图2-2），加入了病毒和重组ChIFN-α的细胞（图2-3）与只加病毒组细胞（图2-4） 相比， 细胞残缺程度明显较轻。4mg/mLG418抗性的重组酵母菌株的表达水平
与3 mg/mL G418抗性重组酵母菌株相当，不存在拷贝数依赖性。
2.4ChIFN-α成熟肽表达条件的优化
诱导24 h所得的抗病毒效果不明显，1～3 d重组蛋白的活性增强，3 d后活性有所下降（图3）。不同温度诱导 3 d 后，28 ℃摇瓶发酵培养时，重组蛋白的活性最高（图4）。不同甲醇质量分数时，0.5%甲醇诱导表达的重组蛋白活性最高（图5）。在培养基中加入酸水解酪蛋白作为竞争性底物时，当酪蛋白质量分数为2%时，重组蛋白活性最强（图6）。
综上所述，重组蛋白ChIFN-α最佳诱导表达条件为：在含2%酸水解酪蛋白、经0.5%甲醇28 ℃诱导表达3 d后，重组蛋白表达量最多，抗病毒活性最高。
3结论与讨论
我国养禽业规模及总量均居世界首位[7]，但禽病仍然阻碍养禽业发展，给养禽业带来了巨大的经济损失。一些禽病的治疗及预防缺乏有效手段。因此，寻求安全、高效的治疗制
剂和预防制剂迫在眉睫。干扰素是多功能的糖蛋白，与免疫球蛋白不同，它不具有免疫球蛋白的抗体特异性，但其具备广谱的抗病毒活性及强大的免疫调节作用[8-10]，对防治禽病具有重要意义。由于天然的干扰素在机体内表达量甚微，无法满足临床需要，因此人们利用基因工程技术来研究开发高效生产干扰素，用于防治病毒性疾病[11]。本研究利用毕赤酵母表达体系表达制备了ChIFN-α，构建了毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K-α，获得了高拷贝重组酵母菌株，对重组酵母菌进行诱导，使重组蛋白获得了较高水平表达，且具有良好的抗病毒活性，解决了原核表达系统抗菌肽生产过程中普遍存在的表达量低、活性低、成本高等问题，为禽病防治奠定了良好的基础。
参考文献：
[1]Isaaca A，Lindenmann J. Virus interference：1. The interferon[J]. Proc R Soc Lond Ser，1957，147：258-263.
[2]Lamp S P，TytellA A，Nemes M M，et al. Purification and characterization of chick embryo interferon[J]. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine，1963，112：468-478.
[3]朱颖慧，朱兰才，刘然义，等. 干扰素-γ治疗肿瘤的研究进展[J]. 肿瘤学杂志，2008，14（1）：4-9.
[4]焦道忠，王云龙，李晨阳，等. 鸡α干扰素基因的克隆与表达[J]. 生物学杂志，2008，25（5）：48-51.
[5]王永娟，朱善元，左伟勇，等. 鸡α-干扰素成熟肽的原核表达及其多价血清的制备[J]. 扬州大学学报：农业与生命科学版，2013，34（1）：32-35，40.
[6]殷震，刘景华. 动物病毒学[M]. 2版.北京：科学技术出版社，1997：704 - 735.
[7]侯庆华. 养禽业的现状及发展趋势[J]. 郑州牧业工程高等专科学校学报，2013，33（3）：22-23.
[8]霍海龙，赵跃，王锐，等. 猪白细胞介素6和α干扰素基因的融合及其原核表达[J]. 江苏农业学报，2013，29（2）：329-334.
[9]吴静，李玉峰，宋敏训，等. 鸡α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及其抗病毒活性测定[J]. 山东农业科学，2006（1）：61-64.
[10]韦琴，吴士筠，梅辉，等. 鸡α干扰素在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒功能初探[J]. 江苏农业科学，2014，42（10）：49-51.
[11]姚清侠，钱平，曹毅，等. 猪α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定[J]. 中国兽医学报，2008，28（12）：1456-1460.云巾宴，任春宇，车达，等. 气肿疽梭菌不同靶基因检测方法的比较[J]. 江苏农业科学，2015，43（11
：278-280.