【摘 要】
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目的 探讨肌球蛋白1D(myosin 1d,MYO1D)对自噬溶酶体形成的影响及其作用机制.方法 免疫荧光观察大鼠肾上皮(normal rat kidney,NRK)细胞内MYO1D蛋白质与自噬体标志性蛋白质微
【机 构】
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新疆医科大学 基础医学院生物化学教研室,乌鲁木齐 830011新疆医科大学药学院药理学教研室,乌鲁木齐 830011;新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院,乌鲁木齐 830011;
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目的 探讨肌球蛋白1D(myosin 1d,MYO1D)对自噬溶酶体形成的影响及其作用机制.方法 免疫荧光观察大鼠肾上皮(normal rat kidney,NRK)细胞内MYO1D蛋白质与自噬体标志性蛋白质微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light Chain 3,LC3)的共定位关系;CRISPR-Cas9技术敲除NRK细胞中MYO1D基因,并分为MYO1D基因未敲除组,即NC组(non-specific control,NC)与MYO1D基因敲除组,即KO组(myosin1d knockout,KO);免疫荧光观察两组细胞中LC3与溶酶体关联膜蛋白1(lysosomal associated membrane protein 1,LAMP1)的共定位关系;蛋白质免疫印迹检测两组细胞自噬底物蛋白P62(p62/sequestosom-1,p62)的表达水平;对两组细胞进行荧光融合蛋白GFP-RFP-LC3(GFP-RFP-LC3)转染,在激光共聚焦显微镜下示踪自噬溶酶体的形成,并利用溶酶体标记探针(lyso-tracker red)检测溶酶体活性的变化.结果 在NRK细胞中,可观察到MYO1D与LC3存在显著的共定位关系;激光共聚焦显微镜下可观察到KO组中自噬溶酶体的形成受阻,荧光拟合程度降低;与NC组比较KO组P62蛋白表达水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01);KO组内绿色荧光与红色荧光共同标记的自噬体比例升高;与NC组比较KO组溶酶体活性增强,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 MYO1D参与并影响自噬溶酶体的生成过程,其作用机制可能是MYO1D参与了自噬体转运至溶酶体并与之融合.
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