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[摘要] 目的：通过研究缬沙坦对兔视网膜色素上皮细胞生长的影响，以期寻找药物治疗、延缓PVR的发生、发展。方法：体外培养兔视网膜色素上皮细胞，取第三代细胞加入96孔板，分为①正常对照组；②血小板源性生长因子（PDGF）刺激组： 50μg/L PDGF；③缬沙坦（Valsartan）治疗组：0.2mg/mL Valsartan+50μg/L PDGF。分别行MTT法检测兔RPE细胞增殖能力，ELASA法检测兔RPE细胞培养液TGF-β1含量。结果：PDGF刺激组兔RPE细胞的增殖速度加快，而Valsartan治疗组对PDGF刺激后的兔RPE生长有明显抑制作用，且明显抑制PDGF刺激兔RPE细胞分泌TGF-β1。结论：Valsartan可抑制体外培养的兔RPE细胞生长。
[关键词] 缬沙坦 视网膜色素上皮细胞 抑制生长
增殖性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy, PVR）是玻璃体视网膜手术后产生的一种视网膜玻璃体纤维组织增生性病变，是导致玻璃体视网膜手术失败的最常见原因，故抑制、延缓PVR的产生是提高玻璃体视网膜手术成功率的关键[1]。缬沙坦（valsartan）是一种血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，实验研究显示血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂能有效减轻组织纤维化程度，从而抑制肝脏、肾脏、心脏、胰腺等脏器的纤维化[2]。已有研究证实视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞在PVR中起主导作用[3]，本实验通过研究Valsartan对RPE细胞生长的影响，旨在证实Valsartan能否抑制RPE生长而在PVR中起类似的抗纤维化作用，以期寻找药物治疗、延缓PVR的发生、发展。
1 材料和方法
1.1 材料
美国Forma CO2 培养箱、苏州超净工作台、日本OLYMPUS倒置相差显微镜、美国Metertech公司Σ550型酶联免疫检测仪、太仓HZ-8211K恒温振荡仪、北京精利LCZ-5-2型低温自动平衡离心机。DMEM／F12培养基、胎牛血清、小牛血清（均为Gibco公司）、TGF-β1测定ELASA试剂盒（南京建成生物工程研究所）
1.2 兔RPE细胞体外培养与鉴定
参照本科室建立的方法[4]。
1.3 MTT法检测兔RPE细胞增殖能力
将第3代兔RPE细胞按1×103/孔个接种于96板，每孔培养体积为200μL。随机分三组：①正常对照组；②PDGF刺激组：50μg/L PDGF；③Valsartan 治疗组：0.2mg/mL Valsartan+50μg/L PDGF。从接种次日开始，每天将各组中的4孔细胞进行吸光度值测定，共测7天，每天换液一次。测定时每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，继续培养4h，弃去培养液，加入二甲亚砜150μL，震荡10min，使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪在490nm处测定各孔吸光度值（OD值）。
1.4 ELASA法检测兔RPE细胞培养液TGF-β1含量
将第3代兔RPE细胞接种于96板，每孔培养体积为200μL，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育72h后，随机分三组：①正常对照组；②PDGF刺激组： 50μg/l PDGF；③Valsartan 治疗组：0.2mg/ml Valsartan+50μg/l PDGF，每组设4个复孔，继续培养72h后，取上清液用ELASA法测定TGF-β1含量，操作按试剂盒进行。
1.5 统计学分析
所有数据以±s表示，采用SPSS13.0统计软件分析。兔RPE细胞增殖实验采用析因方差分析，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用q检验，p<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Valsartan抑制PDGF刺激兔RPE细胞增殖。经析因方差分析,三组差异具有显著性（F=34.620，P＝0.000）；不同时间点对细胞体外增殖的影响差异具有显著性（F=107.860，P＝0.000）；各组细胞与各时间组两因素交互效应显著（F=89.55，P＝0.000）；除第1、2天外，其他各时间点细胞组间的细胞增殖差异具有显著性（表1）。经LSD 法多重比较，结果表明，与正常对照组相比较，PDGF刺激组兔RPE细胞的增殖速度加快，而Valsartan治疗组对PDGF刺激后的兔RPE生长有明显抑制作用。
2.2 Valsartan抑制PDGF刺激兔RPE细胞分泌TGF-β1
PDGF刺激兔RPE细胞大量分泌TGF-β1，与正常对照组比有显著性差异，而Valsartan则明显抑制PDGF刺激兔RPE细胞分泌TGF-β1（表2）。
表2 不同处理因素对兔RPE细胞分泌TGF-β1的影响
注：F值为165.759，P值为0.000，*与正常对照组比P=0.000，#与PDGF刺激组比P=0.000。
3 讨论
PVR是玻璃体视网膜手术失败的主要原因，且迄今为止无特别有效的治疗手段。PVR的发生机理是由视网膜表面及玻璃体内细胞的增殖，主要是RPE细胞、胶原细胞及成纤维细胞增殖形成增殖膜，增殖膜收缩引起视网膜脱离（RD）导致视力丧失。大量研究表明RPE细胞在PVR的发生发展过程中起主导作用，RPE通过分化、转分化，分泌细胞因子，表达细胞因子受体，参与细胞外基质形成通过复杂的细胞因子网络引发“瀑布式”级联反应，导致PVR的发生[5]。TGF-β1即是PVR病理过程中的主要作用因子之一。在PVR病理过程中PDGF分泌增加，并刺激RPE增殖，促进PVR进展。
缬沙坦（Valsartan）是一种血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，临床上广泛用于治疗高血压病，是一种安全有效的降压药物。最近的实验室研究显示血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂能有效减轻组织纤维化程度，有效抑制肝脏、肾脏、心脏、胰腺等脏器的纤维化，其机制可能与抑制组织细胞内的TGF-β1及TGFRⅡmRNA表达有关。
TGF-β1已有实验证明在PVR形成过程中起复杂的双向调节作用，不同浓度时对RPE细胞分别表现出促进或抑制作用。TGFβmRNA及其蛋白水平的升高可使视网膜色素上皮细胞分泌释放多种生长因子，刺激活化的巨噬细胞和成纤维细胞，使其产生胶原和纤维粘连蛋白等物质，导致PVR的进展。
本实验初步证实Valsartan可通过抑制RPE表达、分泌TGF-β1，抑制RPE增殖。作用机制需进一步实验室研究，Valsartan对PVR的抑制作用有待进一步体外动物实验证实。
参考文献：
[1] Pastor CJ,Proliferative vitreoretinopathy;an overview[J].Surv Ophthalmol,1998,
43(1):3-18.
[2] 姜美华,涂玲,徐西振,等.心肌纤维化细胞模型的构建及缬沙坦对其治疗的研究[J].医学导报.2008,27(7):739-742.
[3] Casaroli-Marano RP,Pagan R,Vilaro S.Epithelial-mesenchymal transition in proliferative vitreoreinopathy:intermediate filament protein expression in retinal pigment epithelial cells.Invest Ophthalmol[J]. Vis Sci,1999,40(9):2062-2072.
[4] 徐国兴,杨娟,孙堂胜,等.体外原代培养人视网膜色素上皮细胞[J].国际眼科杂志,2004,4(1):12-15.
[5] Xu GX,Thoreson WB. Effects of lysophosphatidic acid on DNA synthesis and proliferation in cultured human retinal pigment epithelial cells[J]. Investigative Ophthalmology&Visual Science (suppl),1997,38（3）:671.
[关键词] 缬沙坦 视网膜色素上皮细胞 抑制生长
增殖性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy, PVR）是玻璃体视网膜手术后产生的一种视网膜玻璃体纤维组织增生性病变，是导致玻璃体视网膜手术失败的最常见原因，故抑制、延缓PVR的产生是提高玻璃体视网膜手术成功率的关键[1]。缬沙坦（valsartan）是一种血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，实验研究显示血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂能有效减轻组织纤维化程度，从而抑制肝脏、肾脏、心脏、胰腺等脏器的纤维化[2]。已有研究证实视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞在PVR中起主导作用[3]，本实验通过研究Valsartan对RPE细胞生长的影响，旨在证实Valsartan能否抑制RPE生长而在PVR中起类似的抗纤维化作用，以期寻找药物治疗、延缓PVR的发生、发展。
1 材料和方法
1.1 材料
美国Forma CO2 培养箱、苏州超净工作台、日本OLYMPUS倒置相差显微镜、美国Metertech公司Σ550型酶联免疫检测仪、太仓HZ-8211K恒温振荡仪、北京精利LCZ-5-2型低温自动平衡离心机。DMEM／F12培养基、胎牛血清、小牛血清（均为Gibco公司）、TGF-β1测定ELASA试剂盒（南京建成生物工程研究所）
1.2 兔RPE细胞体外培养与鉴定
参照本科室建立的方法[4]。
1.3 MTT法检测兔RPE细胞增殖能力
将第3代兔RPE细胞按1×103/孔个接种于96板，每孔培养体积为200μL。随机分三组：①正常对照组；②PDGF刺激组：50μg/L PDGF；③Valsartan 治疗组：0.2mg/mL Valsartan+50μg/L PDGF。从接种次日开始，每天将各组中的4孔细胞进行吸光度值测定，共测7天，每天换液一次。测定时每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，继续培养4h，弃去培养液，加入二甲亚砜150μL，震荡10min，使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪在490nm处测定各孔吸光度值（OD值）。
1.4 ELASA法检测兔RPE细胞培养液TGF-β1含量
将第3代兔RPE细胞接种于96板，每孔培养体积为200μL，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育72h后，随机分三组：①正常对照组；②PDGF刺激组： 50μg/l PDGF；③Valsartan 治疗组：0.2mg/ml Valsartan+50μg/l PDGF，每组设4个复孔，继续培养72h后，取上清液用ELASA法测定TGF-β1含量，操作按试剂盒进行。
1.5 统计学分析
所有数据以±s表示，采用SPSS13.0统计软件分析。兔RPE细胞增殖实验采用析因方差分析，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用q检验，p<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Valsartan抑制PDGF刺激兔RPE细胞增殖。经析因方差分析,三组差异具有显著性（F=34.620，P＝0.000）；不同时间点对细胞体外增殖的影响差异具有显著性（F=107.860，P＝0.000）；各组细胞与各时间组两因素交互效应显著（F=89.55，P＝0.000）；除第1、2天外，其他各时间点细胞组间的细胞增殖差异具有显著性（表1）。经LSD 法多重比较，结果表明，与正常对照组相比较，PDGF刺激组兔RPE细胞的增殖速度加快，而Valsartan治疗组对PDGF刺激后的兔RPE生长有明显抑制作用。
2.2 Valsartan抑制PDGF刺激兔RPE细胞分泌TGF-β1
PDGF刺激兔RPE细胞大量分泌TGF-β1，与正常对照组比有显著性差异，而Valsartan则明显抑制PDGF刺激兔RPE细胞分泌TGF-β1（表2）。
表2 不同处理因素对兔RPE细胞分泌TGF-β1的影响
注：F值为165.759，P值为0.000，*与正常对照组比P=0.000，#与PDGF刺激组比P=0.000。
3 讨论
PVR是玻璃体视网膜手术失败的主要原因，且迄今为止无特别有效的治疗手段。PVR的发生机理是由视网膜表面及玻璃体内细胞的增殖，主要是RPE细胞、胶原细胞及成纤维细胞增殖形成增殖膜，增殖膜收缩引起视网膜脱离（RD）导致视力丧失。大量研究表明RPE细胞在PVR的发生发展过程中起主导作用，RPE通过分化、转分化，分泌细胞因子，表达细胞因子受体，参与细胞外基质形成通过复杂的细胞因子网络引发“瀑布式”级联反应，导致PVR的发生[5]。TGF-β1即是PVR病理过程中的主要作用因子之一。在PVR病理过程中PDGF分泌增加，并刺激RPE增殖，促进PVR进展。
缬沙坦（Valsartan）是一种血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，临床上广泛用于治疗高血压病，是一种安全有效的降压药物。最近的实验室研究显示血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂能有效减轻组织纤维化程度，有效抑制肝脏、肾脏、心脏、胰腺等脏器的纤维化，其机制可能与抑制组织细胞内的TGF-β1及TGFRⅡmRNA表达有关。
TGF-β1已有实验证明在PVR形成过程中起复杂的双向调节作用，不同浓度时对RPE细胞分别表现出促进或抑制作用。TGFβmRNA及其蛋白水平的升高可使视网膜色素上皮细胞分泌释放多种生长因子，刺激活化的巨噬细胞和成纤维细胞，使其产生胶原和纤维粘连蛋白等物质，导致PVR的进展。
本实验初步证实Valsartan可通过抑制RPE表达、分泌TGF-β1，抑制RPE增殖。作用机制需进一步实验室研究，Valsartan对PVR的抑制作用有待进一步体外动物实验证实。
参考文献：
[1] Pastor CJ,Proliferative vitreoretinopathy;an overview[J].Surv Ophthalmol,1998,
43(1):3-18.
[2] 姜美华,涂玲,徐西振,等.心肌纤维化细胞模型的构建及缬沙坦对其治疗的研究[J].医学导报.2008,27(7):739-742.
[3] Casaroli-Marano RP,Pagan R,Vilaro S.Epithelial-mesenchymal transition in proliferative vitreoreinopathy:intermediate filament protein expression in retinal pigment epithelial cells.Invest Ophthalmol[J]. Vis Sci,1999,40(9):2062-2072.
[4] 徐国兴,杨娟,孙堂胜,等.体外原代培养人视网膜色素上皮细胞[J].国际眼科杂志,2004,4(1):12-15.
[5] Xu GX,Thoreson WB. Effects of lysophosphatidic acid on DNA synthesis and proliferation in cultured human retinal pigment epithelial cells[J]. Investigative Ophthalmology&Visual Science (suppl),1997,38（3）:671.