【摘 要】
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【目的】构建产溶血性磷脂酶C(Hemolytic Phospholipase C,PLCH)的重组大肠杆菌(Escherich coli)菌株,并初步优化其发酵条件。【方法】首先利用卵黄硼砂平板分离法筛选到一株
【机 构】
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江南大学食品科学与技术国家重点实验室,工业生物技术教育部重点实验室,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室;
【基金项目】
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国家“863计划”(2011AA100905);教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET-11-0665);江南大学食品科学与技术国家重点实验室自由探索资助课题(SKLF-ZZA-201201)~~
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【目的】构建产溶血性磷脂酶C(Hemolytic Phospholipase C,PLCH)的重组大肠杆菌(Escherich coli)菌株,并初步优化其发酵条件。【方法】首先利用卵黄硼砂平板分离法筛选到一株产磷脂酶C(PhospholipaseC,PLC)活性较高的菌株,命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)41;进一步以P.aeruginosa 41基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增获得溶血性磷脂酶C(PLCH)基因,构建重组大肠杆菌表达质粒并转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3);筛选转化子并检测PLC活性和溶血能力,并初步优化其发酵条件。【结果】成功构建了重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-plcH;在硼砂卵黄平板上对重组菌进行PLC活性测定,显示重组菌有明显的磷脂酶C活性;在哥伦比亚血琼脂平板上对重组菌进行溶血性试验,表明PLCH具有较强的溶血活性;初步优化摇瓶发酵条件为:5%转接量,37℃、200 r/min下培养4 h添加IPTG至终浓度为0.9 mmol/L,转为25℃、150 r/min诱导培养14 h;优化后重组菌的酶活可达到722.89±0.47 U/mL。【结论】本文成功构建了一株产溶血性磷脂酶C活性较高的重组大肠杆菌菌株,并通过优化发酵条件使其酶活达到了722.89±0.47 U/mL,本实验在国内首次实现了铜绿假单胞菌来源的溶血性磷脂酶C基因在大肠杆菌的胞内表达,该研究为研究磷脂酶C产业化奠定了一定的基础。
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